Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Dette arbejde understøttes af Natural Science Foundation i Kina (31671074) og grundlæggende forskningsmidler til Zhejiang provinsielle universiteter (2019XZZX003-12).

1. klargøring af Drosophila larver
<ol><li>Forbered standard medium bestående af kogt majs måltid (73 g), agar (5,6 g), sojabønne måltid (10 g), gær (17,3 g), sirup (76 mL) og vand (1000 mL).</li>
	<li>Løft alle fluer ved 25 °C på standard mediet i et rum med 12 timer/12 timer lys/mørk cyklus.</li>
</ol>2. fremstilling af agarplader
<ol><li>Forbered 1,0% agar opløsning. Der afvejes 3 g agar i et 500 mL bægerglas med en balance, hvorefter der tilsættes 300 mL destilleret v...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Denne protokol præsenterer Light spot assay til at teste evnen af Drosophila larver at flygte fra lys. Denne analyse gør det muligt at spore larverne, før de kommer ind, under møder og efter at have forladt et lyspunkt. Detaljer om larve bevægelsen kan fanges og analyseres. Light spot assay er meget enkel og besidder stærk praktisk anvendelighed. Omkostningerne ved hele enheden er ikke høj. I eksperimentet bruges LED-lys som lyskilde. Det kan udskiftes med lyskilder af forskellige bølgelængder, hvis det...

Larverne af Drosophila melanogaster viser indlysende lys-undgå opførsel under foraldrings stadiet. Drosophila larve phototaxis har været under efterforskning, især i de seneste 50 år1,2,3,4,5,6,7 ,8. I de seneste år, trods det faktum, at 1) mange neuroner mægle larve lys undgåelse er blevet identificeret4,5,9,10,11,12 og 2) den komplette tilslutning af larve visuelt system ved opløsningen af synapser er blevet etableret13, de neurale mekanismer underliggende larve phototaxis fortsat stort set uklart.
En række adfærdsmæssige assays er blevet brugt til at studere larve phototaxis. De kan i vid udstrækning opdeles i to klasser: den ene involverer rumlige lys gradienter og den anden involverer tidsmæssige lys gradienter. For rumlige lys gradient assays, er arenaen opdelt i samme antal sektioner i lys og mørke. Arenaen kan opdeles i lys og mørke halvdele2,4 eller lyse og mørke kvadranter14,15, eller kan endda adskilles i alternative lyse og mørke firkanter som på en skakbræt7. Normalt, agar plader anvendes til rumlig lys gradient assay, men rør, der er opdelt i alternative lys og mørke sektioner kan også bruges10,14.
I ældre version af assays, lys belysning generelt stammer fra under larverne. Men belysningen i nyere versioner stammer i vid udstrækning fra oven, da larve øjne (f. eks. de bolte organer, der er følsomme over for lav-eller medium lysintensiteter16), er indeholdt i det uigennemsigtige blæksprutter med åbninger mod den øverste front. Dette gør larverne mere følsom over for lys fra øvre front retninger end nedefra bag retninger7. For temporale lysgradient analyser er lysintensiteten rumlig ensartet i arenaen, men intensiteten ændrer sig over tid. Ud over det temporale kvadratiske bølge lys (dvs. blinkende til/fra eller stærkt/svagt lys3,7) anvendes der også et tids forskelligt lys, der er i overensstemmelse med en lineær rampe i intensitet,8 til måling af larvaes følsomhed over for en temporalt skiftende let stimulus.
En tredje type af phototaxis assay er retningsbestemt lys Scape navigation, som involverer belysning ovenfra i en vinkel på 45 °7. Før Kane et al.7arbejde, blev kun grove parametre som antallet af larver i lyse og mørke områder, hyppigheden af drejning og Trail længde beregnet i larve phototaxis assays. Da arbejdet i denne gruppe, med analysen af høj tidsmæssig opløsning video rekord for larve phototaxis, detaljerede dynamik larve bevægelse under phototaxis (dvs. øjeblikkelige hastigheder af forskellige dele af larve legeme, kurs retning, drejning vinkel og tilsvarende vinkelhastighed) er blevet analyseret7. Således, flere detaljer om larve phototaxis opførsel har været i stand til at blive opdaget. I disse assays testes larverne i grupper, så gruppe effekter ikke udelukkes.
Denne protokol introducerer en Light-spot analyse for undersøgelse af larve adfærdsmæssige reaktioner på individuel let stimulation. Den vigtigste eksperimentelle opsætning består af et visuelt stimulerings system og infrarødt lysbaseret billedbehandlingssystem. I det visuelle stimulerings system genererer en LED-lyskilde en lys plet med 2 cm i diameter på en agarplade, hvor Larven testes. Lysintensiteten kan justeres ved hjælp af en LED-driver. Billed systemet omfatter et infrarødt kamera, der fanger larvas opførsel ud over 3 850 nm infrarøde lysdioder, der giver belysning til kameraet. Kameraets linse er dækket af et 850 nm band-pass filter for at blokere lys fra det visuelle stimulerings system fra at komme ind i kameraet, mens det infrarøde lys er tilladt at komme ind i kameraet. Således forhindres interferens af visuel stimulation på billeddannelse. I denne analyse registreres og analyseres de adfærdsmæssige detaljer for de enkelte larver hurtigt respons inden for en periode, herunder før, under og efter indtastning af lys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Larverne af Drosophila melanogaster viser indlysende lys-undgå opførsel under foraldrings stadiet. Drosophila larve phototaxis kan bruges som en model til at studere dyrenes undgåelse adfærd. Denne protokol introducerer en Light-spot analyse for at undersøge larve phototaktik adfærd. Den eksperimentelle opsætning omfatter to hoveddele: et visuelt stimulerings system, der genererer lysstedet, og et infrarødt lys-baseret billedsystem, der registrerer processen med larve Light undgåelse. Denne analyse gør det muligt at spore larvas opførsel, før de kommer ind, under møder og efter at have forladt lysstedet. Detaljer om larve bevægelsen, herunder deceleration, pause, hoved støbning, og drejning kan fanges og analyseres ved hjælp af denne metode.

I henhold til protokollen blev Light spot assay anvendt til at undersøge lysundgåelse adfærd af tredje INSTAR larve, der blev rejst ved 25 °c på standard medium i et rum med en 12 h/12 h lys/mørk cyklus. En enkelt w1118 larve blev testet ved hjælp af Light spot assay ved 25,5 °c. Den gennemsnitlige lysintensitet af lysstedet genereret af en 460 nm LED var 0,59 μW/cm2. Hele processen med larve ind og ud af lysstedet blev indspillet og analyseret ved hjælp af SOS software og bruger...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Denne protokol introducerer en Light-spot analyse for at undersøge Drosophila larve phototaktik adfærd. I denne analyse, en lys plet er genereret som let stimulation, og processen med larve lys undgåelse registreres af en infrarød lys-baserede Imaging System.

Light spot-baseret assay til analyse af Drosophila larval phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Ved hjælp af lyspunktsanalysen kan larvernes adfærd spores før, under og efter indtastning af lysområdet, så larvebevægelsens detaljer kan analyseres. Denne analyse er enkel og nem at udføre. Lysresponsen testes kun én gang, så enhver mulig effekt af lystilpasning kan udelukkes.For at forberede agar plader, langsomt og jævnt dække bunden af en 15 centimeter petriskål med en cirka fire millimeter tykt lag af varme 1% agar. Lad pladen køle af ved stuetemperatur, indtil agaren er størknet. Hvis du vil konfigurere det visuelle stimuleringssystem, skal du klippe en forberedt LED-lyskilde ud på en jernramme, idet der skal tages hånd om, at lyset projicerer ned mod skrivebordet.Vip cylinderen en smule, indtil vinklen mellem cylinderplanet og det lodrette plan er ca. 10 grader. Tilslut det 470 nanometerblå LED-lys til LED-stikket et stik på den højeffekt-LED-driver, og tænd for driveren. Drej knappen i øverste højre hjørne af føreren for at vælge kanal 470 nanometer og klik på LED.Når skærmen viser en kontrol, vises der et blåt lys på skrivebordet. Klik på OK og drej knappen for at justere intensiteten af lyset. Flyt lyskildens position op og ned for at justere lyspunktets diameter til to centimeter.Drej knappen for at vælge lysintensiteten i henhold til forsøgskravene. Brug en kompakt effektmålerkonsol med en standardsensor til fotodiode til at måle den maksimale og minimale lyseffekt på stedet. Lyset magt skal måles i mørke i selve eksperimentet.Derefter registrere lyseffekt, måle det tre gange og bruge den gennemsnitlige værdi. For at oprette forestille systemet, klemme en høj opløsning webkamera med et jern klip omkring 10 centimeter over lyspunktet på skrivebordet og justere retningen af kameralinsen mod skrivebordet. kameraet til en computer, der kører Windows 7 via en USB-grænseflade, og placer agarpladen på skrivebordet lige under kameraet.Åbn AMCap 9.22-softwaren, lyspunktet vises automatisk i AMCap-vinduet. Flyt kameraet en smule til venstre eller højre for at sikre, at lyspunktet er tæt på midten af vinduet. Brug et klip til at fastsætte en 850 plus eller minus tre nanometer bandpass filter på fem til syv millimeter umiddelbart under kameraet.Placer tre infrarøde lysgenererende lysdioder med en central bølgelængde på 850 nanometer jævnt omkring agar plade omkring fem centimeter væk fra kanten af pladen og med LED linser i en 70 graders vinkel vender mod pladen. Tilslut derefter LED'erne til en strømkilde via deres vekselstrøm til DC-konvertere. I menuen i AMCap-softwaren skal du vælge indstillinger, videoenhed og optageformat og indstille pixelstørrelsen på den optagne video til 800 med 600 og billedhastigheden til 60 billeder pr. sekund.Fjern filteret, og placer en lineal under kameraet. Juster kameraets fokus, indtil skalalinjen er klar og parallel med bredden af videovisningsfeltet, og klik på optagelse, opsætning og videooptagelse for at vælge lagringsstien. Klik derefter på Start optagelse for at registrere den faktiske afstand, der svarer til 600 pixel, og beregn forholdet mellem hver pixel og den faktiske afstand.Før du introducerer larverne til billedopsætningen, skal du anskaffe en kort video af lyspositionen og navngive det ufiltrerede kontrolbaggrundsvideolysområde et. Anvend filteret tilbage på kameralinsen og tænd for et lys langt fra forsøgsenheden ved så lav en indstilling som muligt, samtidig med at larverne kan observeres tydeligt. Brug en ske til at fjerne nogle larver fra kulturmediet og vælg forsigtigt en tredje instar larver.Vask larven i destilleret vand og læg larverne i midten af agarpladen. Fjern forsigtigt overskydende vand fra larverne og sluk lyset i rummet. Lad larverne akklimatisere i to minutter i det mørke miljø, før du tænder for det infrarøde LED-lys.Følgende lys undgåelse adfærd eksperiment skal udføres i mørke. For nemheds skyld demonstration vi filmet i det klare lys. Børst forsigtigt larven til midten af pladen.Når larven begynder at kravle lige, drej pladen for at få larverne til at gå mod lyspunktet. Klik på hentning, opsætning og videooptagelse for at vælge lagringsstien, og klik på Start optagelse for at optage. Lad larverne kravle mod, komme ind og lade lyspunktet være, indtil den er næsten ude af synsfeltet, og klik på stopoptagelse.Flyt filteret væk fra kameraet, og få en kort video af lysstedets placering. Derefter navngive stillingen assay ufiltreret video lys område to og sammenligne denne video med lysområdet en video for at sikre, at lyspunktet position ikke ændres. Her kan tidskurver af halen hastighed, krop bøjning vinkel og kantede hastighed af kroppen bøjning af en repræsentativ larver observeres.Størrelsen af larvehovedet og dermed den maksimale kropsbøjningsvinkel reduceres betydeligt i tredje instar larver med octopaminergiske neuroner hæmmet af stivkrampetoksisk udtryk sammenlignet med forældrekontrol, hvilket indikerer, at Tdc2-Gal4 neuroner er nødvendige for en normal larvelysrespons. For en vellykket billedbehandling skal du sørge for, at kameraet ikke blokerer lyset, og at lyspunktet er rundt og i nærheden af midten af vinduet. Efter denne procedure, optogenetik kan udføres for at observere, hvordan larverne reagerer, når specifikke neuroner er aktiveret.Ved hjælp af denne analyse, kan detaljerne i larve bevægelse analyseres tillader den vidtrækkende indvirkning af miljømæssige og interne faktorer på larve lys undgåelse adfærd, der skal undersøges.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersøgelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver luftrør Terminal Cells ved lysmikroskopi

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...