Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door Natural Science Foundation of China (31671074) en fundamentele onderzoeksfondsen voor de Zhejiang provinciale universiteiten (2019XZZX003-12).

1. bereiding van de larven van Drosophila
<ol><li>Bereid standaard medium bestaande uit gekookte maïsmeel (73 g), agar (5,6 g), sojameel (10 g), gist (17,3 g), siroop (76 mL) en water (1000 mL).</li>
	<li>Hef alle vliegen op 25 ° c op standaard medium in een kamer met een licht/donkere cyclus van 12 h/12 uur.</li>
</ol>2. bereiding van de agar-platen
<ol><li>Bereid 1,0% agar oplossing. Weeg 3 g agar in een bekerglas van 500 mL met een balans en voeg vervolgens 300 mL gedistilleerd w...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Dit protocol presenteert de lichtvlek test om het vermogen van Drosophila larven te testen om te ontsnappen aan licht. Deze bepaling maakt het mogelijk om het gedrag van larven te volgen voordat u, tijdens het ontmoeten, en na het verlaten van een lichte vlek. Details van larvale beweging kunnen worden vastgelegd en geanalyseerd. De lichtvlek assay is zeer eenvoudig en heeft een sterke uitvoerbaarheid. De kosten van het hele apparaat zijn niet hoog. In het experiment wordt LED-licht gebruikt als lichtbron. Het k...

De larven van Drosophila melanogaster vertonen duidelijk licht-Vermijd gedrag tijdens de foerageren fase. Drosophila larvale phototaxis is onderzocht, vooral in de afgelopen 50 jaar1,2,3,4,5,6,7 ,8. In de afgelopen jaren, ondanks het feit dat 1) vele neuronen bemiddelend larvale licht vermijding zijn geïdentificeerd4,5,9,10,11,12 en 2) de volledige aansluiting van het larvale visuele systeem bij de resolutie van synapsen is vastgesteld13, de neurale mechanismen onderliggende larvale foto taxi's blijven grotendeels onduidelijk.
Een aantal gedragstesten zijn gebruikt in het bestuderen van larvale phototaxis. Ze kunnen grotendeels onderverdeeld worden in twee klassen: een met betrekking tot ruimtelijke licht gradiënten en de andere met tijdelijke licht gradiënten. Voor ruimtelijk licht gradiënt assays, is de Arena verdeeld in gelijk aantal secties in licht en donker. De Arena kan worden onderverdeeld in lichte en donkere helften2,4 of lichte en donkere kwadranten14,15, of kan zelfs worden gescheiden in alternatieve lichte en donkere pleinen zoals op een dambord7. Meestal worden agar-platen gebruikt voor ruimtelijke licht gradiënt Assay, maar buizen die zijn onderverdeeld in alternatieve lichte en donkere secties kunnen ook worden gebruikt10,14.
In de oudere versie van de assays komt licht verlichting meestal van onder de larven. De verlichting in nieuwere versies komt echter grotendeels van bovenaf, aangezien larvale ogen (bijv. de organen van de Bolwig die gevoelig zijn voor licht intensiteiten met lage of middelzware sterkte16) zijn opgenomen in het ondoorzichtige kopopharyngeale skelet met openingen naar het bovenste front. Dit maakt larven gevoeliger voor licht uit de bovenste voorkant richtingen dan van onderen achter aanwijzingen7. Bij tijdelijke licht gradiënt is de lichtintensiteit ruimtelijk uniform in de Arena, maar de intensiteit verandert in de loop van de tijd. Naast temporaal vierkant Golf licht (d.w.z. knipperen aan/uit of sterk/zwak licht3,7), wordt ook tijdelijk wisselend licht dat voldoet aan een lineaire helling in intensiteit8 gebruikt om de gevoeligheid van larven te meten met een tijdelijk veranderende licht stimulus.
Een derde type fototaxis test is de directionele lichtscape navigatie, waarbij de verlichting van bovenaf onder een hoek van 45 °7plaatsvindt. Voor het werk van Kane et al.7werden alleen Grove parameters zoals het aantal larven in lichte en donkere gebieden, de frequentie van draaien en de lengte van de Trail berekend in de assays van larvale phototaxis. Sinds het werk van deze zelfde groep, met de analyse van hoge temporele resolutie video record voor larvale foto taxi's, gedetailleerde dynamiek van larvale beweging tijdens foto taxi's (dat wil zeggen, directe snelheden van verschillende delen van larvale lichaam, richting, draaihoek en de corresponderende hoeksnelheid) zijn geanalyseerd7. Dus, meer details van larvale phototaxis gedrag hebben kunnen worden ontdekt. In deze assays worden larven getest in groepen, zodat groeps effecten niet worden uitgesloten.
Dit protocol introduceert een lichtvlek test voor het onderzoeken van larvale gedrags responsen op individuele licht stimulatie. De belangrijkste experimentele opstelling bestaat uit een visueel stimulatie systeem en een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem. In het visuele stimulatie systeem genereert een LED-lichtbron een ronde lichtvlek van 2 cm diameter op een agar-plaat, waar de larve wordt getest. De lichtintensiteit kan worden aangepast met behulp van een LED-driver. Het imaging systeem bevat een infraroodcamera die het gedrag van de larve vastlegt naast de 3 850 nm infrarood Led's die verlichting bieden voor de camera. De lens van de camera wordt bedekt door een 850 nm band-pass filter om het licht van het visuele stimulatie systeem van het betreden van de camera te blokkeren, terwijl het infraroodlicht de camera mag betreden. Interferentie van visuele stimulatie op beeldvorming wordt dus voorkomen. In deze test worden de gedrags Details van de snelle reacties van individuele larven binnen een periode, inclusief voor, tijdens en na het invoeren van licht, geregistreerd en geanalyseerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

De larven van Drosophila melanogaster vertonen duidelijk licht-Vermijd gedrag tijdens de foerageren fase. Drosophila larvale foto taxi's kunnen worden gebruikt als een model om dier vermijding gedrag te bestuderen. Dit protocol introduceert een lichtvlek test om het larvale phototactische gedrag te onderzoeken. De experimentele opstelling bestaat uit twee hoofdonderdelen: een visueel stimulatie systeem dat de lichtvlek genereert, en een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem dat het proces van larvale licht vermijding registreert. Deze test maakt het volgen van het gedrag van larve mogelijk voordat u, tijdens het ontmoeten, en na het verlaten van de lichtvlek. Details van de larvale beweging, inclusief vertraging, pauze, hoofd Casting en draaien kunnen worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van deze methode.

Volgens het protocol werd de lichtvlek test gebruikt om het licht vermijdings gedrag van de derde INSTAR larve te onderzoeken die op standaard medium op 25 °c werden verhoogd in een ruimte met een licht/donker cyclus van 12 uur/12 uur. Eén enkele w1118 larve werd getest met behulp van de lichtvlek test bij 25,5 °c. De gemiddelde lichtintensiteit van de lichtvlek gegenereerd door een 460 nm LED was 0,59 μW/cm2. Het hele proces van larvale in-en uitstappen van de lichtvlek werd opgenomen...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dit protocol introduceert een lichtvlek test om Drosophila larvale phototactische gedrag te onderzoeken. Bij deze test wordt een lichtvlek opgewekt als licht stimulatie en wordt het proces van het vermijden van larvale licht door een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem vastgelegd.

Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Met behulp van de lichte spottest kan het gedrag voor larven worden gevolgd vóór, tijdens en na het betreden van het lichtgebied, waardoor de details van de larvebeweging kunnen worden geanalyseerd. Deze test is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren. De lichtrespons wordt slechts één keer getest, zodat elk mogelijk effect van lichtaanpassing kan worden uitgesloten.Om de agarplaten te bereiden, bedek je langzaam en gelijkmatig de bodem van een petrischaal van 15 centimeter met een ongeveer vier millimeter dikke laag van hete 1%agar. Laat de plaat afkoelen op kamertemperatuur totdat de agar gestold is. Als u het visuele stimulatiesysteem wilt instellen, klemt u een voorbereide LED-lichtbron op een ijzeren frame, waarbij u ervoor wilt zorgen dat het licht naar beneden naar het bureaublad leidt.Kantel de cilinder iets tot de hoek tussen het cilindervlak en het verticale vlak ongeveer 10 graden is. Sluit het 470 nanometer blauwe LED-lampje aan op de LED-één stekker van de high power LED-driver en zet de bestuurder aan. Draai de knop in de rechterbovenhoek van de bestuurder om kanaal 470 nanometer te selecteren en op LED te klikken.Wanneer het scherm een controle weergeeft, verschijnt er een blauwe lichtvlek op het bureaublad. Klik op OK en draai de knop om de intensiteit van het licht aan te passen. Beweeg de positie van de lichtbron op en neer om de diameter van de lichtvlek aan te passen tot twee centimeter.Draai de knop om de lichtintensiteit te selecteren volgens de experimentele vereisten. Gebruik een compacte power meter console met een standaard foto diode power sensor om het maximale en minimale lichtvermogen ter plaatse te meten. De lichtkracht moet gemeten in het donker in het eigenlijke experiment.Neem vervolgens het lichtvermogen op, meet het drie keer en gebruik de gemiddelde waarde. Om het verbeeldende systeem in te stellen, klemt u een webcamera met hoge resolutie met een ijzeren clip ongeveer 10 centimeter boven de lichtvlek op het bureaublad en past u de oriëntatie van de cameralens naar het bureaublad aan. Sluit de camera aan op een computer met Windows 7 via een USB-interface en plaats de agar-plaat op het bureaublad direct onder de camera.Open de AMCap 9.22 software, de lichtvlek wordt automatisch weergegeven in het AMCap-venster. Verplaats de camera iets naar links of rechts om ervoor te zorgen dat de lichtvlek zich in het midden van het venster bevindt. Gebruik een clip om een 850 plus of min drie nanometer bandpass filter vast te stellen op vijf tot zeven millimeter direct onder de camera.Plaats drie infrarood licht genererende LED's met een centrale golflengte van 850 nanometer gelijkmatig rond de agar plaat ongeveer vijf centimeter afstand van de rand van de plaat en met LED-lenzen in een hoek van 70 graden naar de plaat. Sluit vervolgens de LED's aan op een stroombron via hun AC op DC-converters. Selecteer in het menu van de AMCap-software opties, videoapparaat en opnameformaat en stel de pixelgrootte van de vastgelegde video in op 800 bij 600 en de framesnelheid op 60 frames per seconde.Verwijder het filter en plaats een liniaal onder de camera. Pas de camerafocus aan totdat de schaallijn duidelijk en parallel loopt aan de breedte van het videoveld en klik op vastleggen, instellen en video-opname om het op te slaan pad te selecteren. Klik vervolgens op Opnemen om de werkelijke afstand van 600 pixels op te nemen en de verhouding van elke pixel tot de werkelijke afstand te berekenen.Voordat u de larve aan de beeldvormingsopstelling introduceert, krijgt u een korte video van de lichtpositie en noemt u de ongefilterde controleachtergrondlichtruimte één. Plaats het filter terug op de cameralens en zet een licht ver van het experimentele apparaat in een zo laag mogelijke stand, terwijl de larven toch duidelijk kunnen worden waargenomen. Gebruik een lepel om een aantal larven uit het kweekmedium te verwijderen en selecteer voorzichtig een derde instarlarve.Was de larve in gedestilleerd water en plaats de larve in het midden van de agarplaat. Verwijder voorzichtig overtollig water uit de larve en schakel het ruimtelicht uit. Laat de larve twee minuten acclimatiseren in de donkere omgeving voordat u het infrarood-LED-licht inschakelt.Het volgende lichtvermijdend gedrag experiment moet worden uitgevoerd in het donker. Voor het gemak van demonstratie filmden we in het felle licht. Borstel de larve voorzichtig naar het midden van de plaat.Wanneer de larve begint te kruipen recht, draai de plaat om de larve hoofd naar de lichte plek. Klik op vastleggen, instellen en video-opname om het op te slaan pad te selecteren en klik op opnemen opnemen. Laat de larve naar de larve kruipen, de lichtvlek invoeren en verlaten totdat deze bijna buiten het gezichtsveld is en klik op opname stoppen.Verplaats het filter uit de buurt van de camera en verkrijg een korte video van de positie van de lichtvlek. Geef vervolgens de post test ongefilterde video licht gebied twee en vergelijk deze video met het licht gebied een video om ervoor te zorgen dat de lichtvlek positie niet wordt gewijzigd. Hier kunnen tijdkrommen van de staartsnelheid, de buighoek van het lichaam en de hoeksnelheid van het buigen van het lichaam van een representatieve larve worden waargenomen.De grootte van de larve hoofd gegoten en dus maximale lichaam buigen hoek is aanzienlijk verminderd in de derde instar larven met octopaminergic neuronen geremd door tetanus toxische expressie in vergelijking met ouderlijk toezicht wat aangeeft dat Tdc2-Gal4 neuronen nodig zijn voor een normale larval lichtrespons. Voor een succesvolle beeldverwerking moet u ervoor zorgen dat de camera het licht niet blokkeert en dat de lichtvlek rond en in de buurt van het midden van het venster is. Na deze procedure kan optogenetica worden uitgevoerd om te observeren hoe de larven reageren wanneer specifieke neuronen worden geactiveerd.Met behulp van deze test kunnen de details van larvebeweging worden geanalyseerd, waardoor de verre impact van milieu en interne factoren op larvelichtvermijdingsgedrag kan worden bestudeerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

Drosophila larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissectie en kleuring van de Drosophila Larvale Eierstokken

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Onderzoek van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Tracheale Terminal cellen door lichtmicroscopie

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...