Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la Chine (31671074) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités provinciales du Zhejiang (2019XZZX003-12).

1. Préparation des larves de Drosophila
<ol><li>Préparer le milieu standard composé de farine de maïs bouillie (73 g), d'agar (5,6 g), de farine de soja (10 g), de levure (17,3 g), de sirop (76 ml) et d'eau (1000 ml).</li>
	<li>Soulevez toutes les mouches à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h.</li>
</ol>2. Préparation des plaques d'agar
<ol><li>Préparer une solution d'agar de 1,0 %. Peser 3 g d'agar dans un bécher de 500 ml avec...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Ce protocole présente l'analyse des points lumineux pour tester la capacité des larves de Drosophila à s'échapper de la lumière. Cet analyse permet de suivre le comportement des larves avant d'entrer, lors de la rencontre et après avoir quitté un point lumineux. Les détails du mouvement larvaire peuvent être capturés et analysés. L'argument de la tache lumineuse est très simple et possède une forte praticabilité. Le coût de l'ensemble de l'appareil n'est pas élevé. Dans l'expérience, la lumièr...

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d'évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis a fait l'objet d'une enquête, en particulier dans les 50 dernières années1,2,3,4,5,6,7 ,8. Ces dernières années, malgré le fait que 1) de nombreux neurones médiateurs de l'évitement de la lumière larvaire ont été identifiés4,5,9,10,11,12 et 2) le connectome complet du système visuel larvaire à la résolution des synapses a été établi13,les mécanismes neuronaux sous-jacents phototaxis larvaires restent en grande partie peu clairs.
Un certain nombre d'essais comportementaux ont été utilisés dans l'étude de la phototaxie larvaire. Ils peuvent être en grande partie divisés en deux classes : l'une impliquant des gradients de lumière spatiale et l'autre impliquant des gradients de lumière temporelle. Pour les essais de gradient de lumière spatiale, l'arène est divisée en nombre égal de sections dans la lumière et l'obscurité. L'arène peut être divisée en moitiés de lumière et sombres2,4 ou quadrants de lumière et sombres'il ya 14,15, ou peut même être séparée en carrés alternatifs de lumière et sombres comme sur un damier7. Habituellement, les plaques d'agar sont utilisées pour l'analyse de gradient de lumière spatiale, mais les tubes qui sont divisés en sections de lumière et d'obscurité alternatives peuvent également être utilisés10,14.
Dans l'ancienne version des essais, l'éclairage lumineux provient généralement de dessous les larves. Cependant, l'illumination dans les versions plus récentes provient en grande partie d'en haut, puisque les yeux larvaires (par exemple, les organes du Bolwig qui sont sensibles aux intensités de lumière faible ou moyenne16) sont contenus dans le squelette céphalopharyngé opaque avec des ouvertures vers l'avant supérieur. Cela rend les larves plus sensibles à la lumière par les directions avant supérieures que par le bas derrière les directions7. Pour les essais de gradient de lumière temporelle, l'intensité lumineuse est spatialement uniforme dans l'arène, mais l'intensité change avec le temps. En plus de la lumière temporelle des ondes carrées (c.-à-d. clignotant/off ou lumière forte/faible3,7), la lumière temporellement variable qui se conforme à une rampe linéaire d'intensité est également utilisée8 pour mesurer la sensibilité des larves à un changement temporel de stimulus de la lumière.
Un troisième type d'essai de phototaxis est la navigation directionnelle de paysage de lumière, qui implique l'illumination d'en haut à un angle de 45'7. Avant les travaux de Kane et coll.7, seuls des paramètres grossiers tels que le nombre de larves dans les régions sombres et légères, la fréquence des virages et la longueur des sentiers ont été calculés dans les essais de phototaxis larvaires. Depuis le travail de ce même groupe, avec l'analyse de l'enregistrement vidéo à haute résolution temporelle pour la phototaxie larvaire, dynamique détaillée du mouvement larvaire pendant la phototaxie (c.-à-d., vitesses instantanées de différentes parties du corps larvaire, direction de cap, angle de rotation et la vitesse angulaire correspondante) ont été analysés7. Ainsi, plus de détails sur le comportement de la phototaxis larvaire ont pu être découverts. Dans ces essais, les larves sont testées en groupes afin que les effets de groupe ne soient pas exclus.
Ce protocole introduit un analyse de tache légère pour l'étude des réponses comportementales larvaires à la stimulation lumineuse individuelle. La principale installation expérimentale consiste en un système de stimulation visuelle et un système d'imagerie infrarouge à base de lumière. Dans le système de stimulation visuelle, une source lumineuse LED génère une tache lumineuse ronde de 2 cm de diamètre sur une plaque d'agar, où la larve est testée. L'intensité lumineuse peut être ajustée à l'aide d'un pilote LED. Le système d'imagerie comprend une caméra infrarouge qui capture le comportement de la larve en plus de trois LED infrarouges de 850 nm qui fournissent l'éclairage pour la caméra. L'objectif de la caméra est recouvert d'un filtre de 850 nm pour empêcher la lumière du système de stimulation visuelle d'entrer dans la caméra, tandis que la lumière infrarouge est autorisée à entrer dans la caméra. Ainsi, l'interférence de la stimulation visuelle sur l'imagerie est évitée. Dans cet analyse, les détails comportementaux des réponses rapides des larves individuelles au cours d'une période, y compris avant, pendant et après l'entrée de la lumière sont enregistrés et analysés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d'évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis peut être utilisé comme un modèle pour étudier le comportement d'évitement des animaux. Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire. La configuration expérimentale comprend deux parties principales : un système de stimulation visuelle qui génère la tache lumineuse, et un système d'imagerie infrarouge basé sur la lumière qui enregistre le processus d'évitement de la lumière larvaire. Cet analyse permet de suivre le comportement de la larve avant d'entrer, lors de la rencontre, et après avoir quitté la tache lumineuse. Les détails du mouvement larvaire, y compris la décélération, la pause, le moulage de la tête et le virage, peuvent être capturés et analysés à l'aide de cette méthode.

Selon le protocole, l'analyse de tache lumineuse a été employée pour étudier le comportement d'évitement de lumière de la troisième larve d'étoile qui ont été soulevées à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle de lumière/obscurité de 12 h/12 h. Une seule larve w1118 a été testée à l'aide de l'analyse de la tache lumineuse à 25,5 oC. L'intensité lumineuse moyenne de la tache lumineuse générée par une LED de 460 nm était de 0,59 W/cm2. L'ensemble d...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire de Drosophila. Dans cet analyse, un point lumineux est généré sous forme de stimulation lumineuse, et le processus d'évitement de la lumière larvaire est enregistré par un système d'imagerie infrarouge à base de lumière.

Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

À l’aide de l’analyse des taches lumineuses, le comportement des larves peut être suivi avant, pendant et après être entré dans la zone lumineuse, ce qui permet d’analyser le détail du mouvement larvaire. Cet essai est simple et facile à exécuter. La réponse lumineuse n’est testée qu’une seule fois, de sorte que tout effet possible de l’adaptation de la lumière peut être exclu.Pour préparer les assiettes d’agar, couvrir lentement et uniformément le fond d’une boîte de Pétri de 15 centimètres avec une couche d’environ quatre millimètres d’épaisseur de 1% d’agar chaud. Laisser refroidir la plaque à température ambiante jusqu’à ce que l’agar se soit solidifié. Pour configurer le système de stimulation visuelle, coupez une source lumineuse LED préparée sur un cadre en fer, en prenant soin que la lumière se projette vers le bas vers le bureau.Inclinez légèrement le cylindre jusqu’à ce que l’angle entre le plan du cylindre et le plan vertical soit d’environ 10 degrés. Connectez la lumière LED bleue de 470 nanomètres à la LED une prise du conducteur LED de haute puissance et allumez le conducteur. Tournez le bouton dans le coin supérieur droit du conducteur pour sélectionner le canal 470 nanomètres et cliquez sur LED.Lorsque l’écran affiche une vérification, un point lumineux bleu apparaît sur le bureau. Cliquez SUR OK et tournez le bouton pour ajuster l’intensité de la lumière. Déplacez la position de la source lumineuse de haut en bas pour ajuster le diamètre du point lumineux à deux centimètres.Faites pivoter le bouton pour sélectionner l’intensité lumineuse en fonction des exigences expérimentales. Utilisez une console compacte de compteur de puissance avec un capteur de puissance de diode photo standard pour mesurer la puissance lumineuse maximale et minimale sur place. La puissance lumineuse doit être mesurée dans l’obscurité dans l’expérience réelle.Enregistrez ensuite la puissance lumineuse, mesurez-la trois fois et utilisez la valeur moyenne. Pour configurer le système d’imagination, serrez une caméra Web haute résolution avec un clip en fer à environ 10 centimètres au-dessus du point lumineux sur le bureau et ajustez l’orientation de l’objectif de la caméra vers le bureau. Connectez la caméra à un ordinateur fonctionnant sous Windows 7 via une interface USB et placez la plaque d’agar sur le bureau juste en dessous de la caméra.Ouvrez le logiciel AMCap 9.22, le point lumineux sera automatiquement affiché dans la fenêtre AMCap. Déplacez la caméra légèrement à gauche ou à droite pour vous assurer que le point lumineux se trouve près du centre de la fenêtre. Utilisez un clip pour fixer un filtre bandpass de 850 plus ou moins trois nanomètres à cinq à sept millimètres immédiatement en dessous de la caméra.Placez trois LED génératrices de lumière infrarouge avec une longueur d’onde centrale de 850 nanomètres uniformément autour de la plaque d’agar à environ cinq centimètres du bord de la plaque et avec des lentilles LED à un angle de 70 degrés face à la plaque. Connectez ensuite les LED à une source d’énergie par l’intermédiaire de leurs convertisseurs AC à DC. Dans le menu du logiciel AMCap, sélectionnez les options, l’appareil vidéo et le format de capture et réglez la taille des pixels de la vidéo capturée à 800 par 600 et le taux d’image à 60 images par seconde.Retirez le filtre et placez une règle sous la caméra. Réglez la mise au point de la caméra jusqu’à ce que la ligne d’échelle soit claire et parallèle à la largeur du champ de vision vidéo et cliquez sur capture, configuration et capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement. Cliquez ensuite sur commencer à enregistrer pour enregistrer la distance réelle correspondant à 600 pixels et calculer le rapport de chaque pixel à la distance réelle.Avant d’introduire la larve à la configuration d’imagerie, acquérir une courte vidéo de la position de la lumière et nommer la zone de lumière vidéo de fond de contrôle non filtrée un. Placez le filtre sur la lentille de la caméra et allumez une lumière loin du dispositif expérimental à un réglage aussi bas que possible tout en permettant aux larves d’être clairement observées. Utilisez une cuillère pour éliminer certaines larves du milieu de culture et sélectionnez délicatement une troisième larve de stade.Laver la larve dans de l’eau distillée et placer la larve au centre de la plaque d’agar. Retirez délicatement l’excès d’eau de la larve et éteignez la lumière ambiante. Laissez la larve s’acclimater pendant deux minutes dans l’environnement sombre avant d’allumer la lumière infrarouge à LED.L’expérience suivante de comportement d’évitement de la lumière doit être effectuée dans l’obscurité. Pour la commodité de la démonstration, nous avons filmé dans la lumière vive. Badigeonner délicatement la larve au centre de la plaque.Lorsque la larve commence à ramper droit, faites pivoter la plaque pour faire la tête de larve vers le point lumineux. Cliquez sur capture, configuration et capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement et cliquez sur démarrer l’enregistrement pour enregistrer. Laissez la larve ramper vers, entrez et laissez le point lumineux jusqu’à ce qu’elle soit presque hors du champ de vision, et cliquez sur arrêter l’enregistrement.Éloignez le filtre de la caméra et acquérez une courte vidéo de la position du point lumineux. Nommez ensuite la zone de lumière vidéo non filtrée de post-test deux et comparez cette vidéo avec la zone lumineuse une vidéo pour s’assurer que la position du point lumineux n’est pas modifiée. Ici, des courbes de temps de la vitesse de queue, de l’angle de flexion du corps et de la vitesse angulaire de flexion du corps d’une larve représentative peuvent être observées.La taille de la tête larvaire coulée et, par conséquent, l’angle maximal de flexion du corps est significativement réduite dans les larves de troisième stade avec des neurones octopaminergiques inhibés par l’expression toxique du tétanos par rapport aux contrôles parentaux indiquant que les neurones Tdc2-Gal4 sont nécessaires pour une réponse normale de lumière larvaire. Pour un traitement d’image réussi, assurez-vous que l’appareil photo ne bloque pas la lumière et que le point lumineux est rond et près du centre de la fenêtre. Après cette procédure, l’optogénétique peut être effectuée pour observer comment les larves réagissent lorsque des neurones spécifiques sont activés.À l’aide de cet essai, les détails du mouvement larvaire peuvent être analysés permettant d’étudier l’impact lointain de l’environnement et des facteurs internes sur le comportement larvaire d’évitement de la lumière.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

Drosophila Larval NMJ Dissection

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examen de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaires cellules terminales trachéales par microscopie optique

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...