Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Diese Arbeit wird von der naturwissenschaftlichen Stiftung China (31671074) und fundamental Research Funds for the Zhejiang Provincial Universities (2019XZZX003-12) unterstützt.

1. Herstellung von Drosophila Larven
<ol><li>Bereiten Sie Standardmedium bestehend aus gekochtem Maismehl (73 g), Agar (5,6 g), Sojamehl (10 g), Hefe (17,3 g), Sirup (76 ml) und Wasser (1000 ml) zu.</li>
	<li>Heben Sie alle Fliegen bei 25 °C auf Standardmedium in einem Raum mit einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus an.</li>
</ol>2. Herstellung von Agarplatten
<ol><li>Bereiten Sie 1,0% Agar-Lösung vor. Wiegen Sie 3 g Agar in einem 500 ml Becher mit einem Gleichgewicht, dann fügen Sie ...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt den Lichtfleck-Assay vor, um die Fähigkeit von Drosophila-Larven zu testen, dem Licht zu entkommen. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen eines Lichtflecks. Details der Larvenbewegung können erfasst und analysiert werden. Der Lichtfleck-Assay ist sehr einfach und besitzt eine starke Praktikabilität. Die Kosten für das gesamte Gerät sind nicht hoch. Im Experiment wird LED-Licht als Lichtquelle v...

Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis wurde untersucht, vor allem in den letzten 50 Jahren1,2,3,4,5,6,7 ,8. In den letzten Jahren wurden trotz der Tatsache, dass 1) viele Neuronen, die Larvenlichtvermeidung vermitteln,identifiziert4,5,9,10,11,12 und 2) das komplette Connectome des Larven-Visuellen Systems bei der Auflösung von Synapsen wurde13etabliert, die neuronalen Mechanismen, die Larvenphototaxis zugrunde liegen, bleiben weitgehend unklar.
Eine Reihe von Verhaltens-Assays wurden verwendet, um Larven-Phototaxis zu studieren. Sie lassen sich weitgehend in zwei Klassen unterteilen: eine mit räumlichen Lichtgradienten und die andere mit zeitlichen Lichtgradienten. Bei räumlichen Lichtgradienten-Assays ist die Arena in gleiche Anzahl von Abschnitten in Hell und Dunkel unterteilt. Die Arena kann in helle und dunkle Hälften2,4 oder helle und dunkle Quadranten14,15, oder kann sogar in alternative helle und dunkle Quadrate wie auf einem Schachbrett7getrennt werden. Normalerweise werden Agarplatten für räumliche Lichtgradienten-Assay verwendet, aber Rohre, die in alternative helle und dunkle Abschnitte unterteilt sind, können auch10,14verwendet werden.
In älteren Versionen von Assays stammt die Lichtbeleuchtung in der Regel von unterhalb der Larven. Die Beleuchtung in neueren Versionen stammt jedoch weitgehend von oben, da Larvenaugen (z. B. die Organe des Bolwig, die empfindlich auf niedrige oder mittlere Lichtintensitäten16) im undurchsichtigen Cephalopharyngealskelett mit Öffnungen in Richtung die obere Vorderseite. Dies macht Larven empfindlicher gegenüber Licht aus oberen vorderen Richtungen als von unten hinter Denrichtungen7. Bei zeitlichen Lichtgradienten-Assays ist die Lichtintensität in der Arena räumlich einheitlich, aber die Intensität ändert sich im Laufe der Zeit. Neben zeitlichem Rechtecklicht (d.h. blinkendes ein/aus oder starkes/schwaches Licht3,7) wird zeitlich variierendes Licht, das einer linearen Rampe in der Intensität entspricht, auch8 verwendet, um die Empfindlichkeit von Larven zeitlich wechselnden Lichtreiz.
Eine dritte Art von Phototaxis Assay ist die richtungsweisende Licht-Landschaftsnavigation, die Beleuchtung von oben in einem Winkel von 45°7beinhaltet. Vor der Arbeit von Kane et al.7wurden in Larven-Phototaxis-Assays nur grobe Parameter wie die Anzahl der Larven in hellen und dunklen Regionen, die Drehhäufigkeit und die Spurlänge berechnet. Seit der Arbeit dieser Gruppe, mit der Analyse von hochzeitlichen Auflösung Videoaufzeichnung für Larven-Phototaxis, detaillierte Dynamik der Larvenbewegung während Phototaxis (d.h. sofortige Geschwindigkeiten von verschiedenen Teilen des Larvenkörpers, Richtung, Wendewinkel und die entsprechende Winkelgeschwindigkeit) wurden analysiert7. So konnten weitere Details des Larven-Phototaxis-Verhaltens entdeckt werden. In diesen Tests werden Larven in Gruppen getestet, so dass Gruppeneffekte nicht ausgeschlossen werden.
Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay zur Untersuchung von Larvenverhaltensreaktionen auf die individuelle Lichtstimulation ein. Die Hauptanlage besteht aus einem visuellen Stimulationssystem und einem lichtbasierten Infrarot-Bildgebungssystem. Im visuellen Stimulationssystem erzeugt eine LED-Lichtquelle einen rund 2 cm großen Lichtfleck auf einer Agarplatte, wo die Larve getestet wird. Die Lichtintensität kann mit einem LED-Treiber eingestellt werden. Das Bildgebungssystem umfasst eine Infrarotkamera, die das Verhalten der Larve sowie drei 850 nm Infrarot-LEDs erfasst, die die Beleuchtung der Kamera ermöglichen. Das Objektiv der Kamera wird mit einem 850 nm Bandpassfilter abgedeckt, um das Licht des visuellen Stimulationssystems am Eindringen in die Kamera zu hindern, während das Infrarotlicht in die Kamera eindringen darf. So wird eine Störung der visuellen Stimulation bei der Bildgebung verhindert. In diesem Test werden die Verhaltensdetails der schnellen Reaktionen einzelner Larven innerhalb eines Zeitraums, einschließlich vor, während und nach dem Eindringen ins Licht, aufgezeichnet und analysiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis können als Modell verwendet werden, um das Verhalten von Tieren zu untersuchen. Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten der Larven zu untersuchen. Die experimentelle Einrichtung umfasst zwei Hauptteile: ein visuelles Stimulationssystem, das den Lichtfleck erzeugt, und ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem, das den Prozess der Larvenlichtvermeidung aufzeichnet. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen des Lichtflecks. Details der Larvenbewegung, einschließlich Verzögerung, Pause, Kopfgießen und Drehen können mit dieser Methode erfasst und analysiert werden.

Gemäß dem Protokoll wurde der Lichtfleck-Assay verwendet, um das Lichtvermeidungsverhalten von dritten Insternlarven zu untersuchen, die bei 25 °C auf Standardmedium in einem Raum mit einem 12 h/12 h Licht-/Dunkelzyklus angehoben wurden. Eine einzelne w1118 Larve wurde mit dem Lichtfleck-Assay bei 25,5 °C getestet. Die durchschnittliche Lichtintensität des Lichtflecks, der durch eine 460 nm LED erzeugt wurde, betrug 0,59 w/cm2. Der gesamte Prozess des Eindringens und Verlassens des Li...

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Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten von Drosophila larval zu untersuchen. In diesem Test wird ein Lichtfleck als Lichtstimulation erzeugt, und der Prozess der Larvenlichtvermeidung wird durch ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem aufgezeichnet.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Mit dem Lichtfleck-Assay kann das Verhalten von Larven vor, während und nach dem Betreten des Lichtbereichs verfolgt werden, so dass die Details der Larvenbewegung analysiert werden können. Dieser Test ist einfach und einfach durchzuführen. Die Lichtreaktion wird nur einmal getestet, so dass ein möglicher Effekt der Lichtanpassung ausgeschlossen werden kann.Um die Agarplatten vorzubereiten, bedecken Sie langsam und gleichmäßig den Boden einer 15 Zentimeter langen Petrischale mit einer etwa vier Millimeter dicken Schicht mit heißem 1%Agar. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur abkühlen, bis sich der Agar verfestigt hat. Um das visuelle Stimulationssystem einzurichten, klemmen Sie eine vorbereitete LED-Lichtquelle auf einen Eisenrahmen und achten Sie darauf, dass das Licht auf den Desktop hinabgeht.Neigen Sie den Zylinder leicht, bis der Winkel zwischen der Zylinderebene und der vertikalen Ebene etwa 10 Grad beträgt. Schließen Sie das 470 Nanometer blaue LED-Licht an die LED ein Stecker des Hochleistungs-LED-Treibers an und schalten Sie den Treiber ein. Drehen Sie den Knopf in der oberen rechten Ecke des Treibers, um Kanal 470 Nanometer auszuwählen und auf LED zu klicken.Wenn auf dem Bildschirm ein Scheck angezeigt wird, wird ein blauer Lichtfleck auf dem Desktop angezeigt. Klicken Sie auf OK und drehen Sie den Knopf, um die Intensität des Lichts anzupassen. Bewegen Sie die Position der Lichtquelle nach oben und unten, um den Durchmesser des Lichtflecks auf zwei Zentimeter einzustellen.Drehen Sie den Knopf, um die Lichtintensität entsprechend den experimentellen Anforderungen auszuwählen. Verwenden Sie eine kompakte Leistungskonsole mit einem Standard-Fotodioden-Leistungssensor, um die maximale und minimale Lichtleistung vor Ort zu messen. Die Lichtkraft muss im eigentlichen Experiment im Dunkeln gemessen werden.Zeichnen Sie dann die Lichtleistung auf, messen Sie sie dreimal und verwenden Sie den Durchschnittswert. Um das Imaginierungssystem einzurichten, klemmen Sie eine hochauflösende Webkamera mit einem Eisenclip etwa 10 Zentimeter über dem Lichtfleck auf dem Desktop und passen Sie die Ausrichtung der Kameralinse zum Desktop an. Schließen Sie die Kamera über eine USB-Schnittstelle an einen Computer mit Windows 7 an und platzieren Sie die Agarplatte auf dem Desktop direkt unter der Kamera.Öffnen Sie die AMCap 9.22 Software, der Lichtfleck wird automatisch im AMCap-Fenster angezeigt. Bewegen Sie die Kamera leicht nach links oder rechts, um sicherzustellen, dass sich der Lichtfleck in der Nähe der Mitte des Fensters befindet. Verwenden Sie einen Clip, um einen 850 plus oder minus drei Nanometer Bandpassfilter mit fünf bis sieben Millimetern direkt unter der Kamera zu fixieren.Platzieren Sie drei Infrarot-Licht erzeugende LEDs mit einer zentralen Wellenlänge von 850 Nanometern gleichmäßig um die Agarplatte, etwa fünf Zentimeter vom Rand der Platte entfernt und mit LED-Objektiven in einem 70-Grad-Winkel zur Platte gerichtet. Schließen Sie dann die LEDs über ihre AC-zu-DC-Wandler an eine Stromquelle an. Wählen Sie im Menü der AMCap-Software Optionen, Videogerät und Aufnahmeformat aus und legen Sie die Pixelgröße des aufgenommenen Videos auf 800 x 600 und die Bildrate auf 60 Bilder pro Sekunde fest.Entfernen Sie den Filter, und legen Sie ein Lineal unter die Kamera. Passen Sie den Kamerafokus so lange an, bis die Skalierungslinie klar und parallel zur Breite des Videofelds ist, und klicken Sie auf Aufnahme, Einrichtung und Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen. Klicken Sie dann auf Aufnahme starten, um den tatsächlichen Abstand von 600 Pixeln aufzuzeichnen und das Verhältnis jedes Pixels zur tatsächlichen Entfernung zu berechnen.Bevor Sie die Larve in das Bildgebungs-Setup einführen, erfassen Sie ein kurzes Video der Lichtposition und benennen Sie den ungefilterten Kontrollhintergrund-Videolichtbereich eins. Legen Sie den Filter wieder auf das Kameraobjektiv und schalten Sie ein Licht weit weg vom Versuchsgerät bei einer möglichst niedrigen Einstellung ein, während die Larven dennoch deutlich beobachtet werden können. Verwenden Sie einen Löffel, um einige Larven aus dem Kulturmedium zu entfernen und wählen Sie vorsichtig eine dritte Instar Larve.Waschen Sie die Larve in destilliertem Wasser und legen Sie die Larve in die Mitte der Agarplatte. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Wasser aus der Larve und schalten Sie das Raumlicht aus. Lassen Sie die Larve für zwei Minuten in der dunklen Umgebung akklimatisieren, bevor Sie das Infrarot-LED-Licht einschalten.Das folgende Lichtvermeidungsverhaltensexperiment muss im Dunkeln durchgeführt werden. Für die Bequemlichkeit der Demonstration haben wir im hellen Licht gefilmt. Bürsten Sie die Larve vorsichtig in die Mitte der Platte.Wenn die Larve gerade zu kriechen beginnt, drehen Sie die Platte, um die Larve in Richtung des Lichtflecks zu bewegen. Klicken Sie auf Aufnahme, Einrichtung und Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen und auf Aufzeichnung starten, um aufzunehmen. Lassen Sie die Larven kriechen, betreten und lassen Sie den Lichtfleck, bis er fast aus dem Sichtfeld entfernt ist, und klicken Sie auf Aufnahme beenden.Bewegen Sie den Filter von der Kamera weg und erfassen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtflecks. Benennen Sie dann den Post-Assay ungefilterten Videolichtbereich zwei und vergleichen Sie dieses Video mit dem Lichtbereich ein Video, um sicherzustellen, dass die Lichtfleckposition nicht geändert wird. Hierkönnen können Zeitkurven der Schwanzgeschwindigkeit, des Körperbiegewinkels und der Winkelgeschwindigkeit der Körperbiegung einer repräsentativen Larve beobachtet werden.Die Größe des Larvenkopfgusses und damit des maximalen Körperbiegewinkels wird bei dritten Insternlarven mit octopaminergen Neuronen, die durch tetanus toxische Expression gehemmt sind, im Vergleich zu der elterlichen Kontrolle deutlich reduziert, was darauf hindeutet, dass Tdc2-Gal4-Neuronen für eine normale Larvenlichtreaktion notwendig sind. Stellen Sie für eine erfolgreiche Bildverarbeitung sicher, dass die Kamera das Licht nicht blockiert und dass der Lichtfleck rund und in der Mitte des Fensters ist. Nach diesem Verfahren kann eine Optogenetik durchgeführt werden, um zu beobachten, wie die Larven reagieren, wenn bestimmte Neuronen aktiviert werden.Mit diesem Test können die Details der Larvenbewegung analysiert werden, so dass die weiten Auswirkungen von Umwelteinflüssen und internen Faktoren auf das Larvenlichtvermeidungsverhalten untersucht werden können.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

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Forschung

Biologie

Drosophila Larval NMJ Dissection

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Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

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Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

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