Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הטבעי של סין (31671074) וקרנות מחקר היסוד עבור האוניברסיטאות הפרובינציאלי ג'ה-ג'יאנג (2019XZZX003-12).

1. הכנת הזחלים מדרוזופילה
<ol><li>הכנת בינונית סטנדרטית המורכבת קמח תירס מבושל (73 g), אגר (5.6 g), ארוחה סויה (10 גרם), שמרים (17.3 g), סירופ (76 mL) ומים (1000 mL).</li>
	<li>מרימים את כל הזבובים ב-25 ° c על מדיום רגיל בחדר עם מחזור אור/12 h 12 שעות.</li>
</ol>2. הכנת צלחות אגר
<ol><li>להכין 1.0% הפתרון אגר. שוקלים 3 ?...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה מציג את הגישה לנקודת האור כדי לבחון את היכולת של הזחלים של דרוזוהילה לברוח מהאור. היכולת הזאת מאפשרת מעקב אחר התנהגות הזחלים לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר השארת נקודת אור. פרטים על תנועת זחל ניתן ללכוד ולנתח. הכדאיות של נקודת האור היא פשוטה מאוד ובעלת יכולת מעשית חזקה. הע?...

הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות היה תחת חקירה, במיוחד בעבר 50 שנים1,2,3,4,5,6,7 ,8. בשנים האחרונות, למרות העובדה 1) נוירונים רבים מדיה הימנעות הזחל אור זוהו4,5,9,10,11,12 ו -2) החיבור המלא של מערכת הזחל ויזואלית ברזולוציה של הסינפסות הוקמה13, המנגנונים העצביים המשמשים את מוניות הזחל לא ברורים במידה רבה.
מספר התנהגות התנהגותית. שימשו ללימוד מוניות זחל הם יכולים להיות מחולקים במידה רבה לשני כיתות: אחד מעורב מעברי אור מרחבי המרחב והשני מעורבים מעברי אור זמני. עבור אור מרחבי מעבר הדרגתי, הזירה מחולקת למספר שווה של סעיפים באור ובחושך. הזירה ניתן לחלק לחצאים אור כהה2,4 או אור וכהה הרביעים14,15, או אפילו יכול להיות מופרד לאור חלופי ריבועים כהים כמו על לוח שחמט7. בדרך כלל, לוחות אגר משמשים לצורך במילוי מרחבי אור מרחבית, אבל צינורות המחולקים לאור חלופי ומקטעים אפלים יכולים לשמש גם10,14.
בגרסה ישנה יותר של הספר, תאורה אור מקורו בדרך כלל מתחת לזחלים. עם זאת, התאורה בגרסאות חדשות מקורו במידה רבה מלמעלה, מאז עיני הזחל (למשל, איברי הבולפאה הרגישים נמוך או בינוני בעוצמות האור16) כלולים בשלד cephalopharyngeal אטום עם פתחים לעבר חזית העליונה. זה הופך את הזחלים רגישים יותר לאור מכיוונים הקדמי העליון מאשר מתחת מאחורי הכיוונים7. עבור האור הזמני מעבר שאומר, עוצמת האור הוא אחיד ממדים בזירה, אבל האינטנסיביות שינויים לאורך זמן. בנוסף לאור מרובע הזמני גל (כלומר, מהבהב on/off או אור חזק/חלש3,7), אור שונים באופן זמני המתאים לשיפוע ליניארי בעוצמה משמש גם8 כדי למדוד את הרגישות של הזחלים שינוי זמני של גירוי באור.
סוג שלישי של שיטת הפוטומוניות הוא הניווט האור scape הכיוון, אשר מערבת תאורה מלמעלה בזווית של 45 °7. לפני העבודה של קיין ואח '7, רק פרמטרים גסים כגון מספר הזחלים באזורים האור והחשוך, תדירות המפנה, ואורך השבילים חושבו בזחל פוטומוניות assays. מאז עבודתה של אותה קבוצה, עם ניתוח של רקורד וידאו ברזולוציה גבוהה לזחל מוניות, דינמיקה מפורטת של תנועת זחל במהלך פוטומוניות (כלומר, מהירויות מיידיות של חלקים שונים של הזחל, כיוון הכותרת, מפנה זווית מהירות זוויתי המקביל) נותחו7. לפיכך, ניתן היה לגלות פרטים נוספים על התנהגות הזחל פוטופוטונית. באותם מספר, הזחלים נבדקים בקבוצות, כך שהשפעות הקבוצה לא ייכללו.
פרוטוקול זה מציג שיטת ספוט קלה לחקירת תגובות של זחל התנהגותי לגירוי קל בודדים. הערכה הניסיונית העיקרית מורכבת ממערכת גירוי חזותית ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום. במערכת הגירוי החזותי, מקור אור LED יוצר נקודת אור בקוטר 2 ס מ עגול על צלחת אגר, שם נבדק הזחל. ניתן לכוונן את עוצמת האור באמצעות מנהל התקן LED. מערכת ההדמיה כוללת מצלמת אינפרא אדום הלוכד את אופן הפעולה של הזחל בנוסף 3 850 הנוריות האינפרא-אדומות ננומטר לספק תאורה עבור המצלמה. העדשה של המצלמה מכוסה על ידי מסנן לעבור פס nm 850 ננומטר כדי לחסום את האור ממערכת גירוי חזותי מלהיכנס למצלמה, בעוד אור אינפרא אדום מותר להיכנס למצלמה. לפיכך, נמנעת הפרעה של גירוי חזותי בהדמיה. במסגרת זו, הפרטים ההתנהגותית של התגובות המהירות של הזחלים הבודדים בתקופה כולל לפני, במהלך, ולאחר הזנת האור מוקלטים ומנתחים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות יכול לשמש כמודל לחקר התנהגות הימנעות מבעלי חיים. פרוטוקול זה מציג את התפקוד של נקודת האור כדי לחקור התנהגות של פוטוטקטיקה של זחל. הערכה הניסיונית כוללת שני חלקים עיקריים: מערכת גירוי חזותית היוצרת את נקודת האור, ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום הרושמת את תהליך ההימנעות מאור הזחל. הדבר מאפשר מעקב אחר אופן הפעולה של הזחל לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר עזיבת נקודת האור. פרטים על תנועת הזחל כולל האטה, הפסקה, הליהוק הראש, והפעלה ניתן ללכוד ולנתח באמצעות שיטה זו.

על פי הפרוטוקול, שימש השימוש בשיטת האור כדי לחקור את התנהגות ההתחמקות הקלה של הזחל השלישי שהועלו ב -25 ° c על המדיום הסטנדרטי בחדר עם מחזור אור/כהות של 12 שעות/12 שעות. אחד w1118 זחל נבדק באמצעות שיטת ספוט האור ב 25.5 ° c. עוצמת האור הממוצעת של מקום האור שנוצר על ידי LED nm 460 היה 0.59 μW/cm2. כ...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

באמצעות ההסטה של נקודת האור, ניתן לעקוב אחר ההתנהגות של הזחלים לפני, במהלך ואחרי הכניסה לאזור האור המאפשר לנתח את הפרטים של תנועת הזחל. בדיקה זו היא פשוטה וקלה לביצוע. תגובת האור נבדקת פעם אחת בלבד, כך שניתן לשלול כל השפעה אפשרית של התאמת האור.כדי להכין את צלחות אגר, לאט ובדרך שווה לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי 15 ס"מ עם שכבה בעובי של כארבעה מילימטר של חם 1% אגר. אפשר לצלחת להתקרר בטמפרטורת החדר עד שהגר יתמצה. כדי להגדיר את מערכת הגירוי החזותי, גזור מקור אור LED מוכן על מסגרת ברזל, תוך טיפול כי האור מקרין כלפי מטה לכיוון שולחן העבודה.להטות את הצילינדר מעט עד הזווית בין מישור הצילינדר לבין המישור האנכי הוא כ 10 מעלות. חבר את אור LED כחול 470 ננומטר לתקע LED אחד של מנהל ההתקן LED כוח גבוה ולהדליק את הנהג. סובב את הידית בפינה השמאלית העליונה של הנהג כדי לבחור ערוץ 470 ננומטר ולחץ על LED.כאשר המסך יציג בדיקה, תופיע נקודת אור כחולה בשולחן העבודה. לחץ על אישור וסובב את הידית כדי להתאים את עוצמת האור. הזז את מיקום מקור האור למעלה ולמטה כדי להתאים את קוטר נקודת האור לשני סנטימטרים.סובב את הידית כדי לבחור את עוצמת האור בהתאם לדרישות הניסוי. השתמש במסוף מד כוח קומפקטי עם חיישן כוח דיודה צילום סטנדרטי כדי למדוד את כוח האור המקסימלי והמינימלי במקום. כוח האור צריך להימדד בחושך בניסוי עצמו.לאחר מכן הקלט את כוח האור, למדוד אותו שלוש פעמים ולהשתמש בערך הממוצע. כדי להגדיר את מערכת הדמיון, מהדקים מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה עם קליפ ברזל כ-10 ס"מ מעל נקודת האור בשולחן העבודה ומתאימים את הכיוון של עדשת המצלמה לכיוון שולחן העבודה. חבר את המצלמה למחשב שבו פועל Windows 7 באמצעות ממשק USB והצב את לוחית הגר על שולחן העבודה ממש מתחת למצלמה.פתח את תוכנת AMCap 9.22, נקודת האור תוצג באופן אוטומטי בחלון AMCap. הזז את המצלמה מעט שמאלה או ימינה כדי לוודא שמקום האור קרוב למרכז החלון. השתמש קליפ כדי לתקן 850 פלוס או מינוס שלושה ננומטר מסנן bandpass בחמישה עד שבעה מילימטרים מיד מתחת למצלמה.מניחים שלושה נורות LED המייצרות אור אינפרא אדום עם אורך גל מרכזי של 850 ננומטר באופן שווה סביב צלחת אגר במרחק של כ-5 ס"מ מקצה הצלחת ועם עדשות LED בזווית של 70 מעלות הפונה לכיוון הצלחת. לאחר מכן חבר את ה-LEDs למקור מתח באמצעות ממירי AC ל- DC שלהם. בתפריט של תוכנת AMCap, בחר אפשרויות, התקן וידאו ותבנית לכידה והגדר את גודל הפיקסל של הווידאו שנלכד ל- 800 על 600 ואת קצב המסגרות ל- 60 מסגרות לשנייה.הסר את המסנן והצב סרגל מתחת למצלמה. התאם את מוקד המצלמה עד שקו קנה המידה יהיה ברור ובמקביל לרוחב שדה התצוגה של הווידאו ולחץ על לכידה, הגדרה ולכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה. לאחר מכן לחץ על התחל להקליט כדי להקליט את המרחק הממשי המתאים ל- 600 פיקסלים ולחשב את היחס בין כל פיקסל למרחק הממשי.לפני הצגת הזחל להגדרת ההדמיה, רכוש סרטון קצר של מיקום האור ותן שם לאזור אור הווידאו ברקע הפקד הלא מסונן. מקם את המסנן בחזרה על עדשת המצלמה והדליק אור רחוק מהמכשיר הניסיוני בהגדרה נמוכה ככל האפשר ועדיין מאפשר לזחלים להתבונן בבירור. השתמש בכף כדי להסיר כמה זחלים מן מדיום התרבות בעדינות לבחור זחל instar שלישי.שוטפים את הזחל במים מזוקקים ומ מניחים את הזחל במרכז צלחת הגר. מוציאים בעדינות את כל המים העודפים מהזחל ומכבה את אור החדר. אפשר לזחל להתאקלם במשך שתי דקות בסביבה הכהה לפני הפעלת נורית LED אינפרא אדום.ניסוי התנהגות הימנעות האור הבא צריך להתבצע בחושך. לנוחות ההדגמה צילמנו באור הבוהק. מברישים בעדינות את הזחל למרכז הצלחת.כאשר הזחל מתחיל לזחול ישר, לסובב את הצלחת כדי להפוך את הזחל ראש לכיוון נקודת האור. לחץ על לכידה, הגדרה ולכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה ולחץ על התחל הקלטה כדי להקליט. אפשר לזחל לזחול לכיוון, הזן ועזוב את נקודת האור עד שהיא כמעט מחוץ לשדה התצוגה ולחץ על הפסק הקלטה.הרחק את המסנן מהמצלמה ורכוש וידאו קצר של מיקום נקודת האור. לאחר מכן תן שם להודעה שתבטיח אזור אור וידאו לא מסונן 2 והשווה סרטון זה עם אזור האור בסרטון אחד כדי להבטיח שמיקום נקודת האור לא השתנה. כאן, עקומות זמן של מהירות הזנב, זווית כיפוף הגוף ומהירות זוויתית של כיפוף הגוף של זחל מייצג ניתן לראות.גודלו של ייצוק ראש הזחל, ולכן, זווית כיפוף הגוף המקסימלית מצטמצמת באופן משמעותי בזחלים instar השלישי עם נוירונים תמנון מעוכבים על ידי ביטוי רעיל טטנוס לעומת בקרת הורים המציין כי נוירונים Tdc2-Gal4 נחוצים לתגובת אור זחל נורמלי. לעיבוד תמונה מוצלח, ודא שהמצלמה אינה חוסמת את האור ושנקודה האור עגולה ובסמוך למרכז החלון. בעקבות הליך זה, אופטוגנטיקה יכולה להתבצע כדי לבחון כיצד הזחלים מגיבים כאשר נוירונים ספציפיים מופעלים.באמצעות בדיקה זו, ניתן לנתח את הפרטים של תנועת הזחל המאפשרת את ההשפעה הרחוקה של הסביבה ועל גורמים פנימיים על התנהגות הימנעות אור זחל להיחקר.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...