Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671074) और झेजियांग प्रांतीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (2019X-X003-12) द्वारा समर्थित है।

1. ड्रोसोफिला लार्वा की तैयारी
<ol><li>उबला हुआ मकई का भोजन (73 ग्राम), आगर (5.6 ग्राम), सोयाबीन भोजन (10 ग्राम), खमीर (17.3 ग्राम), सिरप (76 एमएल) और पानी (1000 एमएल) से मिलकर मानक माध्यम तैयार करें।</li>
	<li>12 h/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्?...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल प्रकाश स्थान परख प्रस्तुत करता है प्रकाश से बचने के लिए Drosophila लार्वा की क्षमता का परीक्षण करने के लिए। यह परख प्रवेश करने से पहले लार्वा के व्यवहार पर नज़र रखने की अनुमति देता है, मुठभेड़...

Drosophila मेलेनोगैस्टर के लार्वा फोरेजिंग चरण के दौरान स्पष्ट प्रकाश-वाणकित व्यवहार दिखाते हैं। Drosophila लार्वा फोटोटैक्सिस जांच के तहत किया गया है , विशेष रूप से पिछले 50 वर्षों में1,2,3,4,5,6,7 ,8. हाल के वर्षों में, इस तथ्य के बावजूद कि 1) कई न्यूरॉन्स लार्वा प्रकाश परिहार मध्यस्थता की पहचान की गई है4,5,9,10,11,12 और 2) synapses के संकल्प पर लार्वा दृश्य प्रणाली का पूरा connectome स्थापित किया गया है13, तंत्रिका तंत्र अंतर्निहित लार्वा phototaxis काफी हद तक स्पष्ट नहीं रह.
लार्वा फोटोटैक्सिस के अध्ययन में कई व्यवहारिक परखों का उपयोग किया गया है। वे मोटे तौर पर दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: एक स्थानिक प्रकाश ढाल और अन्य लौकिक प्रकाश ढाल शामिल शामिल. स्थानिक प्रकाश ढाल परख के लिए, क्षेत्र प्रकाश और अंधेरे में वर्गों के बराबर संख्या में विभाजित है. क्षेत्र को प्रकाश और गहरे हिस्सों2,4 या प्रकाश और गहरे वृत्तों14,15में विभाजित किया जा सकता है , या यहां तक कि एक चेकरबोर्ड7पर की तरह वैकल्पिक प्रकाश और अंधेरे वर्गों में विभाजित किया जा सकता है . आमतौर पर, आगर प्लेटों का उपयोग स्थानिक प्रकाश प्रवणता परख के लिए किया जाता है, लेकिन वैकल्पिक प्रकाश और अंधेरे वर्गों में विभाजित ट्यूबों का भी उपयोग किया जा सकताहै 10,14.
परख के पुराने संस्करण में, प्रकाश रोशनी आम तौर पर लार्वा के नीचे से निकलती है। हालांकि, नए संस्करणों में रोशनी काफी हद तक ऊपर से उत्पन्न होती है, क्योंकि लार्वा आंखें (उदाहरण के लिए, बोलविग के अंग जो कम या मध्यम प्रकाश तीव्रता16के प्रति संवेदनशील होते हैं) अपारदर्शी सेफैलोग्रियल कंकाल में होते हैं जिसकी ओर खुलते हैं ऊपरी मोर्चे. इससे लार्वा ऊपरी सामने की दिशाओं से प्रकाश के प्रति अधिक संवेदनशील हो जाता है. अस्थायी प्रकाश प्रवणता परख के लिए, प्रकाश तीव्रता क्षेत्र में स्थानिक रूप से एक समान होती है, लेकिन समय के साथ तीव्रता में परिवर्तन होता है। लौकिक वर्ग तरंग प्रकाश के अलावा (यानी, पर चमकती / बंद या मजबूत / कमजोर प्रकाश3,7), लौकिक रूप से अलग प्रकाश है कि तीव्रता में एक रैखिक रैंप के अनुरूप है भी8 लार्वा की संवेदनशीलता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है एक अस्थायी रूप से प्रकाश उत्तेजना बदल रहा है.
एक तीसरा प्रकार का फ़ोटोटैक्सिस परख दिशात्मक प्रकाश दृश्य नेविगेशन है, जिसमें ऊपर से 45 डिग्री7के कोण पर रोशनी शामिल होती है। केन एट अल7के काम से पहले, केवल मोटे मापदंडों जैसे प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में लार्वा की संख्या, मोड़ की आवृत्ति, और निशान लंबाई लार्वा फोटोटैक्सिस परख में गणना की गई थी। इस एक ही समूह के काम के बाद से, लार्वा phototaxis के लिए उच्च लौकिक संकल्प वीडियो रिकॉर्ड के विश्लेषण के साथ, phototaxis के दौरान लार्वा आंदोलन की विस्तृत गतिशीलता (यानी, लार्वा शरीर के विभिन्न भागों की तत्काल गति, दिशा शीर्षक, मोड़ कोण और इसी कोणीय वेग) का विश्लेषण किया गया है7. इस प्रकार, लार्वा फोटोटैक्सिस व्यवहार के अधिक विवरण की खोज की जा करने में सक्षम किया गया है. इन परखों में, समूहों में लार्वा का परीक्षण किया जाता है ताकि समूह प्रभावों को बाहर न रखा जा सके।
इस प्रोटोकॉल व्यक्तिगत प्रकाश उत्तेजना के लिए लार्वा व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. मुख्य प्रयोगात्मक सेट अप एक दृश्य उत्तेजना प्रणाली और अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली के होते हैं. दृश्य उत्तेजना प्रणाली में, एक एलईडी प्रकाश स्रोत एक agar प्लेट, जहां लार्वा का परीक्षण किया है पर एक दौर 2 सेमी व्यास प्रकाश स्थान उत्पन्न करता है. प्रकाश तीव्रता एक एलईडी ड्राइवर का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है। इमेजिंग प्रणाली एक अवरक्त कैमरा है कि तीन 850 एनएम अवरक्त एल ई डी है कि कैमरे के लिए रोशनी प्रदान करने के अलावा लार्वा के व्यवहार को दर्शाता भी शामिल है. कैमरे के लेंस कैमरे में प्रवेश करने से दृश्य उत्तेजना प्रणाली से प्रकाश ब्लॉक करने के लिए एक 850 एनएम बैंड-पास फिल्टर द्वारा कवर किया जाता है, जबकि अवरक्त प्रकाश कैमरे में प्रवेश करने की अनुमति दी है. इस प्रकार, इमेजिंग पर दृश्य उत्तेजना के हस्तक्षेप को रोका जाता है. इस परख में, पहले सहित एक अवधि के भीतर व्यक्तिगत लार्वा की तेजी से प्रतिक्रियाओं के व्यवहार विवरण, के दौरान, और प्रकाश में प्रवेश करने के बाद दर्ज कर रहे हैं और विश्लेषण.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Drosophila मेलेनोगैस्टर के लार्वा फोरेजिंग चरण के दौरान स्पष्ट प्रकाश-वाणकित व्यवहार दिखाते हैं। Drosophila लार्वा phototaxis पशु परिहार व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल लार्वा phototactic व्यवहार की जांच करने के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. प्रयोगात्मक सेट अप दो मुख्य भागों में शामिल हैं: एक दृश्य उत्तेजना प्रणाली है कि प्रकाश स्थान उत्पन्न करता है, और एक अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली है कि लार्वा प्रकाश परिहार की प्रक्रिया रिकॉर्ड. इस परख में प्रवेश करने से पहले लार्वा के व्यवहार की ट्रैकिंग की अनुमति देता है, मुठभेड़ के दौरान, और प्रकाश स्थान छोड़ने के बाद. मंदी, ठहराव, सिर कास्टिंग, और मोड़ सहित लार्वा आंदोलन का विवरण पर कब्जा कर लिया और इस विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रकाश स्थान परख का उपयोग तीसरे इनस्टार लार्वा के प्रकाश परिहार व्यवहार की जांच करने के लिए किया गया था जो मानक माध्यम पर 12 h/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ मानक माध्यम पर 25 डिग्री सेल्?...

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Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

इस प्रोटोकॉल Drosophila लार्वा phototactic व्यवहार की जांच करने के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. इस परख में, एक प्रकाश स्थान प्रकाश उत्तेजना के रूप में उत्पन्न होता है, और लार्वा प्रकाश परिहार की प्रक्रिया एक अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली द्वारा दर्ज की गई है.

प्रकाश स्पॉट आधारित परख Drosophila Larval Phototaxis के विश्लेषण के लिए

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

प्रकाश स्थान परख का उपयोग करके, लार्वा के लिए व्यवहार को पहले, दौरान और प्रकाश क्षेत्र में प्रवेश करने के बाद ट्रैक किया जा सकता है जिससे लार्वा आंदोलन के विस्तार का विश्लेषण किया जा सकता है। यह परख सरल और प्रदर्शन करने में आसान है। प्रकाश प्रतिक्रिया का परीक्षण केवल एक बार किया जाता है, ताकि प्रकाश अनुकूलन के किसी भी संभावित प्रभाव को बाहर रखा जा सके।आगर प्लेटों को तैयार करने के लिए, धीरे-धीरे और समान रूप से गर्म 1% एगर की लगभग चार मिलीमीटर मोटी परत के साथ 15 सेंटीमीटर पेट्री डिश के नीचे को कवर करें। प्लेट को कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें जब तक कि आगर जम न जाए। दृश्य उत्तेजना प्रणाली स्थापित करने के लिए, एक लोहे के फ्रेम पर एक तैयार एलईडी प्रकाश स्रोत क्लिप, ध्यान है कि प्रकाश डेस्कटॉप की ओर नीचे परियोजनाओं ।सिलेंडर को थोड़ा तब तक झुकाएं जब तक कि सिलेंडर प्लेन और वर्टिकल प्लेन के बीच का एंगल करीब 10 डिग्री न हो जाए। उच्च शक्ति एलईडी चालक के एलईडी एक प्लग के लिए 470 नैनोमीटर नीली एलईडी लाइट कनेक्ट करें और ड्राइवर चालू करें। चैनल 470 नैनोमीटर और क्लिक एलईडी का चयन करने के लिए ड्राइवर के ऊपरी दाहिने कोने में घुंडी बारी।जब स्क्रीन चेक प्रदर्शित करता है, तो डेस्कटॉप पर एक नीली रोशनी वाली जगह दिखाई देगी। ठीक क्लिक करें और प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करने के लिए घुंडी चालू करें। प्रकाश स्रोत के व्यास को दो सेंटीमीटर तक समायोजित करने के लिए प्रकाश स्रोत की स्थिति को ऊपर और नीचे ले जाएं।प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार प्रकाश तीव्रता का चयन करने के लिए घुंडी घुमाएं। जगह में अधिकतम और न्यूनतम प्रकाश शक्ति को मापने के लिए एक मानक फोटो डायोड पावर सेंसर के साथ एक कॉम्पैक्ट पावर मीटर कंसोल का उपयोग करें। प्रकाश शक्ति वास्तविक प्रयोग में अंधेरे में मापा करने की जरूरत है।फिर प्रकाश शक्ति रिकॉर्ड करें, इसे तीन बार मापें और औसत मूल्य का उपयोग करें। कल्पना प्रणाली स्थापित करने के लिए, डेस्कटॉप पर प्रकाश स्थान के ऊपर 10 सेंटीमीटर के बारे में एक लोहे की क्लिप के साथ एक उच्च संकल्प वेब कैमरा क्लैंप और डेस्कटॉप की ओर कैमरा लेंस के अभिविन्यास को समायोजित करें । कैमरे को यूएसबी इंटरफेस के जरिए विंडोज 7 चलाने वाले कंप्यूटर से कनेक्ट करें और कैमरे के ठीक नीचे डेस्कटॉप पर एगर प्लेट रखें ।AMCap 9.22 सॉफ्टवेयर खोलें, लाइट स्पॉट अपने आप AMCap विंडो में दिखाया जाएगा। कैमरे को थोड़ा छोड़ दिया या सही ले जाएँ सुनिश्चित करने के लिए कि प्रकाश स्थान खिड़की के केंद्र के पास है। कैमरे के तुरंत नीचे पांच से सात मिलीमीटर पर एक ८५० प्लस या माइनस तीन नैनोमीटर बैंडपास फिल्टर को ठीक करने के लिए एक क्लिप का उपयोग करें ।थाली के किनारे से पांच सेंटीमीटर दूर और प्लेट की ओर सामना कर रहे 70 डिग्री कोण पर एलईडी लेंस के साथ, आगर प्लेट के चारों ओर समान रूप से 850 नैनोमीटर की केंद्रीय तरंग दैर्ध्य के साथ तीन अवरक्त प्रकाश उत्पन्न एलईडी रखें। फिर अपने एसी के माध्यम से डीसी कनवर्टर्स को एक शक्ति स्रोत से एलईडी से जोड़ें। AMCap सॉफ्टवेयर के मेनू में, विकल्प, वीडियो डिवाइस का चयन करें, और प्रारूप पर कब्जा करें और कैप्चर किए गए वीडियो के पिक्सेल आकार को 600 और फ्रेम दर को 60 फ्रेम प्रति सेकंड के हिसाब से 800 तक सेट करें।फिल्टर निकालें और कैमरे के नीचे एक शासक जगह है। कैमरा फोकस तब तक समायोजित करें जब तक कि स्केल लाइन स्पष्ट न हो और वीडियो फ़ील्ड ऑफ व्यू और क्लिक कैप्चर, सेटअप और वीडियो कैप्चर की चौड़ाई के समानांतर हो, ताकि सेव पाथ का चयन किया जा सके। फिर 600 पिक्सेल के अनुरूप वास्तविक दूरी रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करने पर क्लिक करें और वास्तविक दूरी के लिए प्रत्येक पिक्सेल के अनुपात की गणना करें।इमेजिंग सेटअप के लिए लार्वा शुरू करने से पहले, प्रकाश की स्थिति का एक छोटा वीडियो प्राप्त करें और अनफ़िल्टर्ड नियंत्रण पृष्ठभूमि वीडियो प्रकाश क्षेत्र का नाम दें। फ़िल्टर को कैमरे के लेंस पर वापस रखें और लार्वा को स्पष्ट रूप से देखे जाने की अनुमति देते हुए यथासंभव कम सेटिंग पर प्रयोगात्मक डिवाइस से दूर एक प्रकाश चालू करें। संस्कृति माध्यम से कुछ लार्वा को हटाने के लिए एक चम्मच का उपयोग करें और धीरे-धीरे एक तिहाई इंस्टार लार्वा का चयन करें।डिस्टिल्ड पानी में लार्वा धोएं और लार्वा को आगर प्लेट के केंद्र में रखें। लारवा से किसी भी अतिरिक्त पानी को धीरे-धीरे निकालें और कमरे की रोशनी बंद कर दें। अवरक्त एलईडी प्रकाश को चालू करने से पहले लार्वा को अंधेरे वातावरण में दो मिनट के लिए स्वीकार करने की अनुमति दें।निम्नलिखित प्रकाश परिहार व्यवहार प्रयोग अंधेरे में किया जाना चाहिए। प्रदर्शन की सुविधा के लिए हम उज्ज्वल प्रकाश में फिल्माया । धीरे-धीरे लार्वा को प्लेट के केंद्र में ब्रश करें।जब लार्वा सीधे क्रॉल करना शुरू कर देता है, तो प्लेट को घुमाएं ताकि लार्वा सिर को प्रकाश स्थान की ओर बनाया जा सके। सेव पाथ का चयन करने के लिए कैप्चर, सेटअप और वीडियो कैप्चर पर क्लिक करें और रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करने पर क्लिक करें। लार्वा को क्रॉल करने की अनुमति दें, दर्ज करें, और प्रकाश स्थान छोड़ दें जब तक कि यह लगभग देखने के क्षेत्र से बाहर न हो जाए, और रिकॉर्डिंग बंद करें।फ़िल्टर को कैमरे से दूर ले जाएं और लाइट स्पॉट की स्थिति का एक छोटा वीडियो प्राप्त करें। फिर पोस्ट का नाम अनफ़िल्टर्ड वीडियो लाइट एरिया दो और प्रकाश क्षेत्र एक वीडियो के साथ इस वीडियो की तुलना करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लाइट स्पॉट स्थिति न बदले। यहां, पूंछ की गति के समय घटता, शरीर झुकने कोण और एक प्रतिनिधि लार्वा के शरीर झुकने की कोणीय गति देखी जा सकती है।लार्वा सिर कास्ट का आकार और, इसलिए, माता-पिता के नियंत्रण की तुलना में टिटनेस विषाक्त अभिव्यक्ति द्वारा बाधित ऑक्टोपेमिनेर्गिक न्यूरॉन्स के साथ तीसरे इंस्टार लार्वा में अधिकतम शरीर झुकने का कोण काफी कम हो जाता है जो यह दर्शाता है कि टीडीसी 2-Gal4 न्यूरॉन्स सामान्य लार्वा प्रकाश प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं। सफल छवि प्रसंस्करण के लिए, सुनिश्चित करें कि कैमरा प्रकाश को अवरुद्ध नहीं करता है और प्रकाश स्थान गोल और खिड़की के केंद्र के पास है। इस प्रक्रिया के बाद, ऑप्टोजेनेटिक्स को यह देखने के लिए किया जा सकता है कि विशिष्ट न्यूरॉन्स सक्रिय होने पर लार्वा कैसे प्रतिक्रिया देता है।इस परख का उपयोग करके, लार्वा आंदोलन के विवरण का विश्लेषण किया जा सकता है जिससे पर्यावरण के दूर प्रभाव और लार्वा प्रकाश परिहार व्यवहार पर आंतरिक कारकों का अध्ययन किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में लारवल सीएनएस के विच्छेदन

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity के उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए एक neuronal और astrocyte सह संस्कृति परख

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

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निगरानी लारवल में हार्ट फंक्शन ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शारीरिक अध्ययन के लिए

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

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की तैयारी ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं लाइट माइक्रोस्कोपी के लिए

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

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के विच्छेदन और धुंधला ड्रोसोफिला लारवल अंडाशय

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

अलग तैयारी से भ्रूण और लार्वा zebrafish कंकाल myofibers का विश्लेषण

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

की परीक्षा<em&gt; ड्रोसोफिला</emलाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा&gt; लारवल Tracheal टर्मिनल प्रकोष्ठों

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...