Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dalla fondazione di scienze naturali della Cina (31671074) e dai Fondi di Ricerca fondamentali per le Università Provinciali di zhejiang (2019X-X003-12).

1. Preparazione delle larve di Drosophila
<ol><li>Preparare il mezzo standard costituito da farina di mais bollito (73 g), agar (5,6 g), farina di soia (10 g), lievito (17,3 g), sciroppo (76 mL) e acqua (1000 mL).</li>
	<li>Sollevare tutte le mosche a 25 gradi centigradi su un supporto standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h.</li>
</ol>2. Preparazione di piatti di agar
<ol><li>Preparare la soluzione agar 1.0%. Pesare 3 g di agar in un becher da 500 mL con una bil...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Questo protocollo presenta il saggio light spot per testare la capacità delle larve di Drosophila di fuggire dalla luce. Questo analisi consente di tracciare il comportamento delle larve prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato un punto luce. I dettagli del movimento larvale possono essere catturati e analizzati. L'anamante del punto luce è molto semplice e possiede una forte praticabilità. Il costo dell'intero dispositivo non è elevato. Nell'esperimento, la luce LED viene utilizzata come so...

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. Drosophila fototaxis larvaè è stato in fase di indagine, soprattutto negli ultimi 50 anni1,2,3,4,5,6,7 ,8. Negli ultimi anni, nonostante il fatto che 1) molti neuroni che mediano l'elusione della luce larvale sono stati identificati4,5,9,10,11,12 e 2) il connettoma completo del sistema visivo larvale alla risoluzione delle sinapsi è stato stabilito13, i meccanismi neurali alla base della fototaxis larvale rimangono in gran parte poco chiari.
Un certo numero di saggi comportamentali sono stati utilizzati nello studio fototassi larvali. Possono essere in gran parte divisi in due classi: una che coinvolge gradienti di luce spaziale e l'altra che coinvolge gradienti di luce temporale. Per i saggi di gradiente di luce spaziale, l'arena è divisa in un numero uguale di sezioni in chiaro e buio. L'arena può essere divisa in metà chiara e scura2,4 o quadranti chiari e scuri14,15, o può anche essere separato in quadrati luminosi e scuri alternativi come su una scacchiera7. Di solito, piastre di agar sono utilizzati per il saggio di gradiente di luce spaziale, ma tubi che sono divisi in sezioni chiare e scure alternate possono anche essere utilizzati10,14.
Nella versione precedente dei saggi, l'illuminazione leggera proviene generalmente da sotto le larve. Tuttavia, l'illuminazione nelle versioni più recenti ha origine in gran parte dall'alto, poiché gli occhi larvali (ad esempio, gli organi del Bolwig sensibili alle intensità di luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyngeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalofario opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalophariongeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media16 la parte anteriore superiore. Questo rende le larve più sensibili alla luce dalle direzioni anteriori superiori rispetto al basso dietro le direzioni7. Per i saggi di sfumatura di luce temporale, l'intensità della luce è spazialmente uniforme nell'arena, ma l'intensità cambia nel tempo. Oltre alla luce temporale ad onde quadrate (cioè lampeggiante on/off o luce forte/debole3,7), la luce temporaneamente variabile che si conforma ad una rampa lineare di intensità viene utilizzata anche8 per misurare la sensibilità delle larve ad un temporaneamente cambiando lo stimolo leggero.
Un terzo tipo di analisi fototaxis è la navigazione direzionale del paesaggio leggero, che coinvolge l'illuminazione dall'alto con un angolo di 45s7. Prima del lavoro di Kane et al.7, solo parametri grossolani come il numero di larve nelle regioni chiare e scure, la frequenza di tornitura e la lunghezza del sentiero sono stati calcolati in analisi fototassis larvali. Dal lavoro di questo stesso gruppo, con l'analisi della registrazione video ad alta risoluzione temporale per fototassi larvali, la dinamica dettagliata del movimento larvale durante il phototaxis (cioè velocità istantanee di diverse parti del corpo larvale, direzione di direzione, angolo di tornitura e la corrispondente velocità angolare) sono stati analizzati7. Così, più dettagli del comportamento fototassi larva sono stati in grado di essere scoperti. In questi saggi, le larve sono testate in gruppi in modo che gli effetti di gruppo non siano esclusi.
Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per lo studio delle risposte comportamentali larve alla stimolazione della luce individuale. Il principale set-up sperimentale consiste in un sistema di stimolazione visiva e in un sistema di imaging a luce infrarossa. Nel sistema di stimolazione visiva, una sorgente luminosa a LED genera un punto luminoso rotondo di 2 cm di diametro su una piastra di agar, dove viene testata la larva. L'intensità della luce può essere regolata utilizzando un driver LED. Il sistema di imaging include una telecamera a infrarossi che cattura il comportamento della larva oltre a tre LED a infrarossi da 850 nm che forniscono illuminazione per la fotocamera. L'obiettivo della fotocamera è coperto da un filtro passa-banda di 850 nm per impedire che la luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva entri nella fotocamera, mentre la luce infrarossa può entrare nella fotocamera. Pertanto, l'interferenza della stimolazione visiva sull'imaging è prevenuta. In questo saggio, i dettagli comportamentali delle risposte veloci delle singole larve entro un periodo compreso prima, durante e dopo l'immissione della luce vengono registrati e analizzati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. La fototassia larvale della Drosophila può essere usata come modello per studiare il comportamento di evitamento degli animali. Questo protocollo introduce un saggio spot per studiare il comportamento fototattico larvale. Il set-up sperimentale include due parti principali: un sistema di stimolazione visiva che genera la luce leggera e un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa che registra il processo di prevenzione della luce larvale. Questo analisi consente di tracciare il comportamento della larva prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato il punto luce. I dettagli del movimento larvale, tra cui decelerazione, pausa, colata e tornitura della testa, possono essere catturati e analizzati utilizzando questo metodo.

Secondo il protocollo, il saggio di luce è stato utilizzato per studiare il comportamento di elusione della luce della terza larva instella che sono stati allevati a 25 gradi centigradi su un mezzo standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h. Una singola larva w1118 è stata testata utilizzando l'assaggio del punto luce a 25,5 gradi centigradi. L'intensità media della luce del punto luce generata da un LED di 460 nm è stata di 0,59 w/cm2. L'intero processo di entrata e...

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Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Utilizzando il saggio del punto luce, il comportamento per le larve può essere monitorato prima, durante e dopo essere entrato nell'area luminosa consentendo di analizzare il dettaglio del movimento larvale. Questo test è semplice e facile da eseguire. La risposta alla luce viene testata una sola volta, in modo da escludere qualsiasi possibile effetto dell'adattamento alla luce.Per preparare le piastre di agar, coprire lentamente e uniformemente il fondo di una piastra di Petri di 15 centimetri con uno strato di circa quattro millimetri di agar caldo dell'1%. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente fino a quando l'agar non si è solidificato. Per configurare il sistema di stimolazione visiva, agganciare una sorgente luminosa LED preparata su un telaio in ferro, facendo attenzione che la luce si progetti verso il desktop.Inclinare leggermente il cilindro fino a quando l'angolo tra il piano del cilindro e il piano verticale è di circa 10 gradi. Collegare la luce LED blu 470 nanometri al LED una spina del driver LED ad alta potenza e accendere il driver. Ruotare la manopola nell'angolo superiore destro del driver per selezionare il canale 470 nanometri e fare clic su LED.Quando lo schermo visualizza un controllo, sul desktop apparirà una macchia di luce blu. Fare clic su OK e ruotare la manopola per regolare l'intensità della luce. Spostare la posizione della sorgente luminosa su e giù per regolare il diametro del punto luce a due centimetri.Ruotare la manopola per selezionare l'intensità della luce in base ai requisiti sperimentali. Utilizza una console del misuratore di potenza compatta con un sensore di potenza del diodo fotografico standard per misurare la massima e minima potenza della luce nel punto. La potenza della luce deve essere misurata al buio nell'esperimento reale.Quindi registrare la potenza della luce, misurarla tre volte e utilizzare il valore medio. Per impostare il sistema di immaginazione, bloccare una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro di circa 10 centimetri sopra il punto luce sul desktop e regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer che esegue Windows 7 tramite un'interfaccia USB e posizionare la piastra agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.Aprire il software AMCap 9.22, il punto luce verrà visualizzato automaticamente nella finestra AMCap. Spostare la fotocamera leggermente a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luce si trova vicino al centro della finestra. Utilizzare una clip per fissare un filtro passa banda di 850 più o meno tre nanometri a cinque-sette millimetri immediatamente sotto la fotocamera.Posizionare tre LED generatori di luce infrarossa con una lunghezza d'onda centrale di 850 nanometri uniformemente intorno alla piastra di agar a circa cinque centimetri di distanza dal bordo della piastra e con lenti a LED con un angolo di 70 gradi rivolto verso la piastra. Quindi collegare i LED a una fonte di alimentazione attraverso i convertitori CA-DC. Nel menu del software AMCap, selezionare le opzioni, il dispositivo video e il formato di acquisizione e impostare la dimensione in pixel del video acquisito su 800 per 600 e la frequenza fotogrammi su 60 fotogrammi al secondo.Rimuovere il filtro e posizionare un righello sotto la fotocamera. Regolare lo stato attivo della fotocamera fino a quando la linea di scala non è chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video e fare clic su acquisizione, configurazione e acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio. Quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva.Prima di introdurre la larva nella configurazione di imaging, acquisire un breve video della posizione della luce e denominare l'area della luce video di sfondo del controllo non filtrata. Riposizionare il filtro sull'obiettivo della fotocamera e accendere una luce lontana dal dispositivo sperimentale a un'impostazione il più bassa possibile, consentendo comunque di osservare chiaramente le larve. Usa un cucchiaio per rimuovere alcune larve dal mezzo di coltura e selezionare delicatamente una terza larva instar.Lavare la larva in acqua distillata e posizionare la larva al centro del piatto di agar. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva e spegnere la luce della stanza. Lasciare che la larva si acclimati per due minuti nell'ambiente buio prima di accendere la luce LED infrarossa.Il seguente esperimento di comportamento di elusione della luce deve essere effettuato al buio. Per comodità di dimostrazione abbiamo girato alla luce intensa. Spazzolare delicatamente la larva al centro del piatto.Quando la larva inizia a strisciare dritta, ruota la piastra per far testare la larva verso il punto luce. Fare clic su acquisizione, configurazione e acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio e fare clic su Avvia registrazione per registrare. Consentire alla larva di strisciare verso, entrare e lasciare il punto luce fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo e fare clic su Interrompi registrazione.Allontanare il filtro dalla fotocamera e acquisire un breve video della posizione del punto luce. Quindi denominare l'area della luce video non filtrata del post due e confrontare questo video con l'area luminosa di un video per assicurarsi che la posizione del punto luce non sia cambiata. Qui, si possono osservare curve del tempo della velocità della coda, angolo di piegatura del corpo e velocità angolare di piegatura del corpo di una larva rappresentativa.La dimensione della testa larvale fusa e, quindi, l'angolo massimo di flessione del corpo è significativamente ridotto in terze larve instar con neuroni octopaminergici inibiti dall'espressione tossica del tetano rispetto al controllo parentale che indica che i neuroni Tdc2-Gal4 sono necessari per una normale risposta della luce larvale. Per un'elaborazione corretta delle immagini, assicurarsi che la fotocamera non blocchi la luce e che il punto luce sia rotondo e vicino al centro della finestra. Seguendo questa procedura, l'optogenetica può essere eseguita per osservare come reagiscono le larve quando vengono attivati neuroni specifici.Usando questo saggio, i dettagli del movimento larvale possono essere analizzati consentendo di studiare l'impatto lontano dei fattori ambientali e interni sul comportamento di elusione della luce larvale.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

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The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

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The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

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Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Esame della<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...