Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av Natural Science Foundation i Kina (31671074) og grunnleggende forskningsmidler for Zhejiang Provincial universiteter (2019XZZX003-12).

1. utarbeidelse av Drosophila larver
<ol><li>Forbered standard medium bestående av kokt korn måltid (73 g), agar (5,6 g), Soyabønne måltid (10 g), gjær (17,3 g), sirup (76 mL) og vann (1000 mL).</li>
	<li>Hev alle fluer ved 25 ° c på standard medium i et rom med en 12 h/12 h lys/mørk syklus.</li>
</ol>2. utarbeidelse av agar plater
<ol><li>Forbered 1,0% agar løsning. Veie 3 g av agar i et 500 mL beger med en balanse, legg deretter til 300 mL destillert vann. Plasser et folie ...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Denne protokollen presenterer lyspunkt analysen for å teste evnen til Drosophila larver å flykte fra lys. Denne analysen tillater sporing av atferden til larver før du går inn, under møter, og etter å ha forlatt en lys flekk. Detaljer om larvestadiet bevegelser kan fanges opp og analyseres. Lyset flekk analysen er meget enkel og besitte kraftig gjennomførbarhet. Kostnaden for hele enheten er ikke høy. I eksperimentet brukes LED-lys som lyskilde. Den kan erstattes med lyskilder av forskjellige bølgelengd...

Larvene av Drosophila melanogaster viser åpenbare lys-unngå atferd under foraging scenen. Drosophila larvestadiet phototaxis har vært under etterforskning, spesielt i de siste 50 år1,2,3,4,5,6,7 ,8. I de senere årene, til tross for at 1) mange neurons formidling larvestadiet lys unngåelse har blitt identifisert4,5,9,10,11,12 og 2) den komplette connectome av larvestadiet visuelle system ved oppløsning av synapser har blitt etablert13, de nevrale mekanismer underliggende larvestadiet phototaxis fortsatt i stor grad uklart.
En rekke atferds analyser har blitt brukt i å studere larvestadiet phototaxis. De kan i stor grad deles inn i to klasser: en som involverer romlige lys graderinger og den andre involverer Temporal lys gradienter. For romlige lys graderings analyser er arenaen inndelt i like mange seksjoner i lys og mørke. Arenaen kan deles inn i lyse og mørke halvdeler2,4 eller lyse og mørke kvadranter14,15, eller kan også skilles i alternative lyse og mørke firkanter som på et sjakkbrett7. Vanligvis er agar plater brukes til romlig lys gradient analysen, men rør som er delt inn i alternative lys og mørke seksjoner kan også brukes10,14.
I eldre versjon av analysene, lys belysning vanligvis stammer fra under larvene. Men belysning i nyere versjoner i stor grad stammer fra oven, siden larvestadiet øyne (f. eks, Bolwig organer som er følsomme for lavt eller middels lys intensitet16) finnes i ugjennomsiktig cephalopharyngeal skjelett med åpninger mot øvre front. Dette gjør Larvene mer følsomme for lys fra øvre front retninger enn fra nedenfor bak retninger7. For Temporal lys gradient analyser, er lys intensiteten romlig uniform i arenaen, men intensiteten endres over tid. I tillegg til Temporal Square Wave Light (dvs. blinkende på/av eller sterk/svakt lys3,7), timelig varierende lys som er i samsvar med en lineær rampe i intensitet er også brukt8 for å måle følsomheten av larver til en timelig skiftende lys stimulans.
En tredje type phototaxis analysen er retningsbestemt lys scape navigasjon, som innebærer belysning ovenfra i en vinkel på 45 °7. Før arbeidet med Kane et al.7, bare grov parametre som antall larver i lyse og mørke regioner, frekvens av snu, og Trail lengde ble beregnet i larvestadiet phototaxis analyser. Siden arbeidet med denne samme gruppen, med analyse av høy Temporal oppløsning video rekord for larvestadiet phototaxis, detaljert dynamikk av larvestadiet bevegelse under phototaxis (dvs. Instant hastigheter av ulike deler av larvestadiet kroppen, retning retning, snu vinkel og tilsvarende vinkel hastighet) har blitt analysert7. Således, flere detaljene av larvestadiet phototaxis opptreden ha blitt dugelig å bli oppdaget. I disse analysene testes Larvene i grupper slik at gruppe effekter ikke utelukkes.
Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for etterforskningen av larvestadiet atferdsmessige reaksjoner på individuell lys stimulering. Det viktigste eksperimentelle oppsettet består av et visuelt stimulerende system og infrarødt lysbasert bildesystem. I det visuelle stimulering systemet genererer en LED-lyskilde en rund 2 cm-diameter lys flekk på en agar plate, der Larven er testet. Lysstyrken kan justeres ved hjelp av en LED-driver. Bilde systemet inkluderer et infrarødt kamera som fanger opp oppførselen til Larven i tillegg til 3 850 NM infrarøde lysdioder som gir belysning for kameraet. Objektivet på kameraet er dekket av et 850 NM band-pass filter for å blokkere lys fra det visuelle stimulering systemet fra å komme inn i kameraet, mens det infrarøde lyset har lov til å gå inn i kameraet. Dermed forhindres interferens med visuell stimulering på bildebehandling. I denne analysen, den atferdsmessige detaljer om rask respons av individuelle larver innen en periode, inkludert før, under og etter inn i lyset er registrert og analysert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Larvene av Drosophila melanogaster viser åpenbare lys-unngå atferd under foraging scenen. Drosophila larvestadiet phototaxis kan brukes som modell for å studere dyr unngåelse oppførsel. Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for å undersøke larvestadiet phototactic oppførsel. Den eksperimentelle oppsett omfatter to hoveddeler: et visuelt stimulering system som genererer lys spot, og en infrarød lys-basert Imaging system som registrerer prosessen med larvestadiet lys unngåelse. Denne analysen tillater sporing av atferden til Larven før du går inn, under møter, og etter å ha forlatt lyspunktet. Detaljer om larvestadiet bevegelse inkludert retardasjon, pause, hode støping, og snu kan fanges opp og analyseres ved hjelp av denne metoden.

Ifølge protokollen, lys flekk analysen ble brukt til å undersøke lys unngåelse oppførsel av tredje skikkelsen Larven som ble reist ved 25 ° c på standard medium i et rom med en 12 h/12 h lys/mørk syklus. En enkel w1118 Larven ble testet ved hjelp av lyspunkt analysen ved 25,5 ° c. Den gjennomsnittlige lysstyrken til lyspunktet som ble generert av en 460 NM LED, var 0,59 μW/cm2. Hele prosessen med larvestadiet inn og ut av lys stedet ble spilt inn og analysert ved hjelp av SOS-pro...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for å undersøke Drosophila larvestadiet phototactic oppførsel. I denne analysen, en lys flekk er generert som lys stimulering, og prosessen med larvestadiet lys unngåelse er registrert av en infrarød lys-basert Imaging system.

Lett spot-basert analyse for analyse av Drosophila larvestadiet Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Ved hjelp av lyspunktanalysen kan oppførselen til larver spores før, under og etter å ha kommet inn i lysområdet slik at detaljene i larvebevegelsen kan analyseres. Denne analysen er enkel og enkel å utføre. Lysresponsen testes bare én gang, slik at enhver mulig effekt av lystilpasning kan utelukkes.For å forberede agarplatene, dekk sakte og jevnt bunnen av en 15 centimeter petriskål med et omtrent fire millimeter tykt lag med varmt 1% agar. La platen avkjøles ved romtemperatur til agaren er størknet. Hvis du vil konfigurere det visuelle stimuleringssystemet, klipper du en forberedt LED-lyskilde på en jernramme, og tar vare på at lyset projiserer ned mot skrivebordet.Vipp sylinderen litt til vinkelen mellom sylinderplanet og det vertikale planet er ca 10 grader. Koble det 470 nanometer blå LED-lyset til LED-lampen én plugg på led-driveren med høy effekt og slå på driveren. Vri knappen øverst til høyre på driveren for å velge kanal 470 nanometer og klikk på LED.Når skjermen viser en sjekk, vises et blått lyspunkt på skrivebordet. Klikk OK og vri på knappen for å justere intensiteten på lyset. Flytt plasseringen av lyskilden opp og ned for å justere diameteren på lyspunktet til to centimeter.Drei knotten for å velge lysintensiteten i henhold til de eksperimentelle kravene. Bruk en kompakt strømmålerkonsoll med en standard fotodiodekraftsensor for å måle den maksimale og minimale lyskraften på stedet. Lyskraften må måles i mørket i selve eksperimentet.Deretter registrerer du lyseffekten, måler den tre ganger og bruker gjennomsnittsverdien. For å sette opp imagining systemet, klemme et høyoppløselig webkamera med et jernklips ca 10 centimeter over lyspunktet på skrivebordet og justere retningen på kameralinsen mot skrivebordet. Koble kameraet til en datamaskin som kjører Windows 7 via et USB-grensesnitt, og plasser agarplaten på skrivebordet rett under kameraet.Åpne AMCap 9.22-programvaren, lyspunktet vises automatisk i AMCap-vinduet. Flytt kameraet litt til venstre eller høyre for å sikre at lyspunktet er nær midten av vinduet. Bruk et klipp til å fikse et 850 pluss eller minus tre nanometer bandpass filter på fem til syv millimeter rett under kameraet.Plasser tre infrarøde lys som genererer lysdioder med en sentral bølgelengde på 850 nanometer jevnt rundt agarplaten omtrent fem centimeter unna kanten av platen og med LED-linser i en 70 graders vinkel vendt mot platen. Koble deretter lysdiodene til en strømkilde via ac til DC-omformere. I menyen i AMCap-programvaren velger du alternativer, videoenhet og opptaksformat og angir pikselstørrelsen på den innspilte videoen til 800 x 600 og bildefrekvensen til 60 bilder per sekund.Fjern filteret og plasser en linjal under kameraet. Juster kamerafokuset til skalalinjen er klar og parallell til bredden på videofeltet for visning, og klikk på opptak, oppsett og videoopptak for å velge lagre banen. Klikk deretter start opptak for å registrere den faktiske avstanden som tilsvarer 600 piksler og beregne forholdet mellom hver piksel til den faktiske avstanden.Før du introduserer larven til bildeoppsettet, kan du skaffe deg en kort video av lysposisjonen og navngi det ufiltrerte kontrollbakgrunnsvideolysområdet en. Plasser filteret tilbake på kameralinsen og slå på et lys langt fra den eksperimentelle enheten på så lav innstilling som mulig, samtidig som larvene kan observeres tydelig. Bruk en skje til å fjerne noen larver fra kulturmediet og velg forsiktig en tredje instar larve.Vask larven i destillert vann og legg larven i midten av agarplaten. Fjern forsiktig overflødig vann fra larven og slå av lyset i rommet. La larven akklimatiseres i to minutter i det mørke miljøet før du slår på det infrarøde LED-lyset.Følgende lysunngåelsesatferdseksperiment må utføres i mørket. For enkelhets skyld av demonstrasjon vi filmet i det lyse lyset. Børst forsiktig larven til midten av platen.Når larven begynner å krype rett, roterer du platen for å gjøre larven hodet mot lyspunktet. Klikk på Opptak, oppsett og videoopptak for å velge lagre banen og klikk start opptak for å ta opp. La larven krype mot, gå inn og la lyspunktet være til det er nesten ute av synsfeltet, og klikk stopp opptak.Flytt filteret bort fra kameraet og få en kort video av lyspunktets posisjon. Deretter navngi innlegget analysen ufiltrert video lys område to og sammenligne denne videoen med lysområdet en video for å sikre at lyspunktposisjonen ikke endres. Her kan tidskurver av halehastigheten, kroppen bøyevinkel og vinkelhastighet på kroppen bøying av en representativ larve observeres.Størrelsen på larvehodet støpt og derfor maksimal kroppsbøyingsvinkel reduseres betydelig i tredje instar larver med okopaminerge nevroner hemmet av stivkrampe giftig uttrykk sammenlignet med foreldrekontroller som indikerer at Tdc2-Gal4 nevroner er nødvendige for en normal larval lysrespons. For vellykket bildebehandling må du kontrollere at kameraet ikke blokkerer lyset, og at lyspunktet er rundt og nær midten av vinduet. Etter denne prosedyren kan optogenetikk utføres for å observere hvordan larvene reagerer når spesifikke nevroner aktiveres.Ved hjelp av denne analysen kan detaljene for larvebevegelse analyseres slik at den ytre virkningen av miljø og interne faktorer på larval lys unngåelse atferd som skal studeres.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse av Embryonale og Larvesebrafisk Skeletal myofibers fra Dissosierte Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersøkelse av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Tracheal Terminal Cells ved lysmikroskopi

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...