Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pela Fundação de ciência natural da China (31671074) e fundos de pesquisa fundamentais para as universidades provinciais de Zhejiang (2019XZZX003-12).

1. preparação de larvas de Drosophila
<ol><li>Prepare o meio padrão constituído por farinha de milho cozida (73 g), Agar (5,6 g), farelo de soja (10 g), levedura (17,3 g), xarope (76 mL) e água (1000 mL).</li>
	<li>Levante todas as moscas a 25 ° c no meio padrão em um quarto com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.</li>
</ol>2. preparação de placas de agar
<ol><li>Prepare 1,0% de solução de agar. Pesar 3 g de agar em um copo de 500 mL com um equilíbrio, em seguida, adicione...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Este protocolo apresenta o ensaio de ponto de luz para testar a capacidade de larvas de Drosophila para escapar da luz. Este ensaio permite rastrear o comportamento das larvas antes de entrar, durante o encontro, e depois de deixar um ponto de luz. Detalhes do movimento larval podem ser capturados e analisados. O ensaio do ponto claro é muito simples e possui a pratiqubilidade forte. O custo de todo o dispositivo não é alto. No experimento, a luz LED é usada como fonte de luz. Ele pode ser substituído por f...

As larvas de Drosophila melanogaster mostram um comportamento óbvio de evitar a luz durante o estágio de forrageamento. Drosophila larval Phototaxis tem sido investigação, especialmente nos últimos 50 anos1,2,3,4,5,6,7 ,8. Nos últimos anos, apesar do fato de que 1) muitos neurônios que mediando a vacância clara larval foram identificados4,5,9,10,11,12 e 2) o conectoma completo do sistema visual larval na definição das sinapses foi estabelecido13, os mecanismos neural que subjacente Phototaxis larval permanecem pela maior parte obscuros.
Vários ensaios comportamentais têm sido utilizados no estudo de fototaxia larval. Podem ser divididos em grande parte em duas classes: um que envolve gradientes claros espaciais e o outro que envolve inclinações claras temporais. Para ensaios espaciais de gradiente de luz, a arena é dividida em número igual de seções em claro e escuro. A arena pode ser dividida em metades claras e escuras2,4ou quadrantes claros e escuros14,15, ou pode mesmo ser separado em quadrados claros e escuros alternativos como em um tabuleiro de damas7. Geralmente, as placas de agar são usadas para o ensaio de gradiente de luz espacial, mas os tubos que são divididos em seções leves e escuras alternadas também podem ser usados10,14.
Na versão mais antiga dos ensaios, a iluminação luminosa geralmente origina-se abaixo das larvas. Entretanto, a iluminação em umas versões mais novas origina pela maior parte de acima, desde que os olhos larval (por exemplo, os órgãos de bolwig que são sensíveis às intensidades claras baixas ou médias16) são contidos no esqueleto esqueleto opaco com aberturas para na frente superior. Isso faz com que as larvas mais sensíveis à luz de direções frontais superiores do que de baixo para trás direções7. Para ensaios de gradiente de luz temporal, a intensidade da luz é espacialmente uniforme na arena, mas a intensidade muda ao longo do tempo. Além do que a luz de onda quadrada temporal (isto é, piscando de ligar/desligar ou luz forte/fraca3,7), aluz temporally de variação que se conforma a uma rampa linear na intensidade é usada igualmente8 para medir a sensibilidade das larvas a um estímulo de luz temporalmente em mudança.
Um terceiro tipo de ensaio Phototaxis é a navegação luz direcional Scape, que envolve a iluminação de cima em um ângulo de 45 °7. Antes do trabalho de Kane et al.7, apenas parâmetros grosseiros como o número de larvas em regiões claras e escuras, frequência de torneamento e comprimento da trilha foram calculados em ensaios de fototaxia larval. Desde o trabalho deste mesmo grupo, com a análise de registro de vídeo de alta resolução temporal para Phototaxis larval, dinâmica detalhada do movimento larval durante Phototaxis (ou seja, velocidades instantâneas de diferentes partes do corpo larval, direção de posição, ângulo de giro e velocidade angular correspondente) foram analisados7. Assim, mais detalhes do comportamento larval Phototaxis têm sido capazes de ser descoberto. Nestes ensaios, as larvas são testadas em grupos para que os efeitos de grupo não sejam excluídos.
Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para a investigação de respostas comportáveis larval à estimulação clara individual. O principal conjunto experimental consiste em um sistema de estimulação visual e sistema de imagem à base de luz infravermelha. No sistema de estimulação visual, uma fonte de luz LED gera um ponto de luz redondo de 2 cm de diâmetro em uma placa de ágar, onde a larva é testada. A intensidade da luz pode ser ajustada usando um driver LED. O sistema de imagem inclui uma câmera infravermelha que captura o comportamento da larva, além de 3 850 nm LEDs infravermelhos que fornecem iluminação para a câmera. A lente da câmera é coberta por um filtro de banda-Pass 850 nm para bloquear a luz do sistema de estimulação visual de entrar na câmera, enquanto a luz infravermelha é permitida para entrar na câmera. Assim, a interferência da estimulação visual na imagem latente é impedida. Neste ensaio, os detalhes comportamentais das respostas rápidas de larvas individuais dentro de um período que inclui antes, durante, e após a entrada da luz são gravados e analisados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

As larvas de Drosophila melanogaster mostram um comportamento óbvio de evitar a luz durante o estágio de forrageamento. Os Phototaxis de Drosophila larval podem ser usados como um modelo para estudar o comportamento da vacância animal. Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para investigar o comportamento phototática larval. A set-up experimental inclui duas partes principais: um sistema de estimulação visual que gera o ponto de luz, e um sistema de imagem à base de luz infravermelha que registra o processo de evasão de luz larval. Este ensaio permite o rastreamento do comportamento da larva antes de entrar, durante o encontro, e depois de deixar o ponto de luz. Detalhes de movimento larval incluindo desaceleração, pausa, fundição de cabeça e torneamento podem ser capturados e analisados usando este método.

De acordo com o protocolo, o ensaio de ponto de luz foi utilizado para investigar o comportamento de evitação de luz de larvas de terceiro instar que foram levantadas a 25 ° c em meio padrão em uma sala com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Uma única larva de w1118 foi testada usando o ensaio do ponto claro em 25,5 ° c. A intensidade luminosa média do ponto luminoso gerado por um diodo emissor de luz de 460 nanômetro era 0,59 μW/cm2. Todo o processo de larval entrando e saindo d...

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Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para investigar o comportamento phototática da Drosophila larval. Neste ensaio, um ponto luminoso é gerado como a estimulação clara, e o processo da vacância clara larval é gravado por um sistema Light-based infravermelho da imagem latente.

Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Usando o ensaio de ponto de luz, o comportamento das larvas pode ser rastreado antes, durante e depois de entrar na área de luz permitindo que os detalhes do movimento larval sejam analisados. Este ensaio é simples e fácil de executar. A resposta à luz é testada apenas uma vez, de modo que qualquer possível efeito da adaptação da luz pode ser excluído.Para preparar as placas de ágar, cubra lentamente e uniformemente o fundo de uma placa de Petri de 15 centímetros com uma camada de aproximadamente quatro milímetros de espessura de ágar quente de 1%. Deixe a placa esfriar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique. Para configurar o sistema de estimulação visual, corte uma fonte de luz LED preparada em uma estrutura de ferro, tomando cuidado para que a luz se projeta em direção à área de trabalho.Incline o cilindro ligeiramente até que o ângulo entre o cilindro e o plano vertical esteja em torno de 10 graus. Conecte a luz LED azul de 470 nanômetros ao led um plugue do driver LED de alta potência e ligue o motorista. Gire o botão no canto superior direito do driver para selecionar o canal 470 nanômetros e clique em LED.Quando a tela exibir uma verificação, um ponto de luz azul aparecerá na área de trabalho. Clique em OK e gire o botão para ajustar a intensidade da luz. Mova a posição da fonte de luz para cima e para baixo para ajustar o diâmetro do ponto de luz para dois centímetros.Gire o botão para selecionar a intensidade da luz de acordo com os requisitos experimentais. Use um console de medidor de potência compacto com um sensor de alimentação de diodo fotográfico padrão para medir a potência máxima e mínima de luz no local. O poder de luz precisa ser medido no escuro no experimento real.Em seguida, registo a energia da luz, meça-a três vezes e use o valor médio. Para configurar o sistema de imaginação, aperte uma câmera web de alta resolução com um clipe de ferro cerca de 10 centímetros acima do ponto de luz na área de trabalho e ajuste a orientação da lente da câmera em direção à área de trabalho. Conecte a câmera a um computador executando o Windows 7 através de uma interface USB e coloque a placa de ágar na área de trabalho logo abaixo da câmera.Abra o software AMCap 9.22, o ponto de luz será mostrado automaticamente na janela AMCap. Mova a câmera ligeiramente para a esquerda ou para a direita para garantir que o ponto de luz esteja perto do centro da janela. Use um clipe para corrigir um filtro de bandpass de 850 mais ou menos três nanômetros a cinco a sete milímetros imediatamente abaixo da câmera.Coloque três LEDs geradores de luz infravermelha com um comprimento de onda central de 850 nanômetros uniformemente ao redor da placa de ágar a cerca de cinco centímetros de distância da borda da placa e com lentes LED em um ângulo de 70 graus voltado para a placa. Em seguida, conecte os LEDs a uma fonte de energia através de seus conversores AC a DC. No menu do software AMCap, selecione opções, dispositivo de vídeo e formato de captura e defina o tamanho do pixel do vídeo capturado para 800 por 600 e a taxa de quadros para 60 quadros por segundo.Remova o filtro e coloque uma régua sob a câmera. Ajuste o foco da câmera até que a linha de escala esteja clara e paralela à largura do campo de exibição de vídeo e clique na captura, configuração e captura de vídeo para selecionar o caminho de salvar. Em seguida, clique em iniciar a gravação para gravar a distância real correspondente a 600 pixels e calcular a razão de cada pixel para a distância real.Antes de introduzir a larva na configuração de imagem, adquira um pequeno vídeo da posição de luz e nomeie a área de luz de vídeo de fundo de controle não filtrada. Coloque o filtro de volta na lente da câmera e acenda uma luz longe do dispositivo experimental o mais baixo possível, enquanto ainda permite que as larvas sejam claramente observadas. Use uma colher para remover algumas larvas do meio de cultura e selecione delicadamente uma terceira larva instar.Lave a larva em água destilada e coloque a larva no centro da placa de ágar. Remova suavemente qualquer excesso de água da larva e desligue a luz do quarto. Deixe a larva se aclimatar por dois minutos no ambiente escuro antes de ligar a luz LED infravermelha.O seguinte experimento de comportamento de prevenção de luz precisa ser realizado no escuro. Para a conveniência da demonstração filmamos com a luz brilhante. Escove suavemente a larva para o centro da placa.Quando a larva começar a rastejar em linha reta, gire a placa para fazer a larva ir em direção ao ponto de luz. Clique em capturar, configurar e capturar vídeo para selecionar o caminho salvar e clicar em iniciar a gravação para gravar. Deixe a larva rastejar em direção, entrar e deixar o ponto de luz até que esteja quase fora do campo de visão e clique em parar de gravar.Mova o filtro para longe da câmera e adquira um pequeno vídeo da posição do ponto de luz. Em seguida, nomeie a área de luz de vídeo não filtrada de postagem dois e compare este vídeo com a área de luz um vídeo para garantir que a posição do ponto de luz não seja alterada. Aqui, podem ser observadas curvas de tempo da velocidade da cauda, ângulo de dobra corporal e velocidade angular de dobra corporal de uma larva representativa.O tamanho da cabeça larval lançada e, portanto, o ângulo máximo de dobra corporal é significativamente reduzido em terceira larva instar com neurônios octoaminérgicos inibidos pela expressão tóxica do tétano em comparação com os controles parentais indicando que os neurônios Tdc2-Gal4 são necessários para uma resposta normal de luz larval. Para um processamento de imagem bem-sucedido, certifique-se de que a câmera não bloqueie a luz e que o ponto de luz esteja redondo e perto do centro da janela. Após este procedimento, a optogenética pode ser realizada para observar como as larvas reagem quando neurônios específicos são ativados.Por meio desse ensaio, os detalhes do movimento larval podem ser analisados permitindo que o impacto distante do meio ambiente e dos fatores internos sobre o comportamento de prevenção da luz larval seja estudado.

Research

JoVE Journal

Biology

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