Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Este trabajo cuenta con el apoyo de la fundación de ciencias naturales de China (31671074) y los Fondos De Investigación Fundamental para las Universidades Provinciales de Zhejiang (2019XZZX003-12).

1. Preparación de larvas de Drosophila
<ol><li>Preparar un medio estándar que consista en harina de maíz hervida (73 g), agar (5,6 g), harina de soja (10 g), levadura (17,3 g), jarabe (76 ml) y agua (1000 ml).</li>
	<li>Levante todas las moscas a 25 oC en un medio estándar en una habitación con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.</li>
</ol>2. Preparación de placas de agar
<ol><li>Prepare una solución de agar del 1,0%. Pesar 3 g de agar en un vaso de precipitados de 500 ml c...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Este protocolo presenta el ensayo de punto ligero para probar la capacidad de las larvas de Drosophila para escapar de la luz. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de las larvas antes de entrar, durante el encuentro y después de salir de un punto de luz. Los detalles del movimiento larvario pueden ser capturados y analizados. El ensayo de punto de luz es muy simple y posee una fuerte practicidad. El costo de todo el dispositivo no es alto. En el experimento, la luz LED se utiliza como fuente de...

Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila larval phototaxis ha estado bajo investigación, especialmente en los últimos 50 años1,2,3,4,5,6,7 ,8. En los últimos años, a pesar de que 1) muchas neuronas que median la evitación de la luz larval han sido identificadas4,5,9,10,11,12 y 2) el conectomotor completo del sistema visual larvaria a la resolución de las sinapsis se ha establecido13, los mecanismos neuronales subyacentes a la fototaxis larvaria siguen siendo en gran medida poco claros.
Se han utilizado varios ensayos conductuales para estudiar la fototaxis larvarios. Se pueden dividir en gran medida en dos clases: una que involucra gradientes de luz espacial y la otra que implica gradientes de luz temporales. Para ensayos de gradiente de luz espacial, la arena se divide en el mismo número de secciones en luz y oscuridad. La arena se puede dividir en mitades claras y oscuras2,4 o cuadrantes claros y oscuros14,15, o incluso se puede separar en cuadrados alternativos de luz y oscuridad como en un tablero de ajedrez7. Por lo general, las placas de agar se utilizan para el ensayo de gradiente de luz espacial, pero los tubos que se dividen en secciones alternas de luz y oscuridad también se pueden utilizar10,14.
En la versión anterior de ensayos, la iluminación ligera generalmente se origina desde debajo de las larvas. Sin embargo, la iluminación en versiones más recientes se origina en gran medida desde arriba, ya que los ojos larvarios (por ejemplo, los órganos de Bolwig que son sensibles a intensidades de luz bajas o medias16)están contenidos en el esqueleto cefalofaríngeo opaco con aberturas hacia el frente superior. Esto hace que las larvas sean más sensibles a la luz desde las direcciones frontales superiores que desde abajo detrás de las direcciones7. Para los ensayos de gradiente de luz temporal, la intensidad de la luz es espacialmente uniforme en la arena, pero la intensidad cambia con el tiempo. Además de la luz de onda cuadrada temporal (es decir, luz intermitente encendida/apagada o fuerte/débil3,7), la luz que varía temporalmente que se ajusta a una rampa lineal en intensidad también se utiliza8 para medir la sensibilidad de las larvas a una temporalmente cambiante estímulo de la luz.
Un tercer tipo de ensayo de fototaxis es la navegación de paisaje de luz direccional, que implica la iluminación desde arriba en un ángulo de 45o7. Antes del trabajo de Kane et al.7, sólo se calcularon parámetros gruesos como el número de larvas en las regiones claras y oscuras, la frecuencia de giro y la longitud del sendero en ensayos de fototaxis larvarios. Desde el trabajo de este mismo grupo, con el análisis de registro de vídeo de alta resolución temporal para fototaxis larvarios, dinámica detallada del movimiento larvario durante la fototaxis (es decir, velocidades instantáneas de diferentes partes del cuerpo larvario, dirección de rumbo, ángulo de giro y la velocidad angular correspondiente) se han analizado7. Por lo tanto, más detalles del comportamiento de la fototaxis larval han sido capaces de ser descubiertos. En estos ensayos, las larvas se prueban en grupos para que no se excluyan los efectos de grupo.
Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para la investigación de las respuestas conductuales larvales a la estimulación lupita individual. La configuración experimental principal consiste en un sistema de estimulación visual y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja. En el sistema de estimulación visual, una fuente de luz LED genera un punto de luz redondo de 2 cm de diámetro en una placa de agar, donde se prueba la larva. La intensidad de la luz se puede ajustar mediante un controlador LED. El sistema de imágenes incluye una cámara infrarroja que captura el comportamiento de la larva, además de tres LED infrarrojos de 850 nm que proporcionan iluminación para la cámara. La lente de la cámara está cubierta por un filtro de paso de banda de 850 nm para impedir que la luz del sistema de estimulación visual entre en la cámara, mientras que la luz infrarroja puede entrar en la cámara. Por lo tanto, se previene la interferencia de la estimulación visual en la toma de imágenes. En este ensayo, se registran y analizan los detalles de comportamiento de las respuestas rápidas de las larvas individuales dentro de un período que incluye antes, durante y después de entrar en la luz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila fototaxis larval se puede utilizar como modelo para estudiar el comportamiento de evitación animal. Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para investigar el comportamiento fototáctico larvario. La configuración experimental incluye dos partes principales: un sistema de estimulación visual que genera el punto de luz y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja que registra el proceso de evitación de la luz larval. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de la larva antes de entrar, durante el encuentro y después de salir del punto de luz. Los detalles del movimiento larvario, incluyendo la desaceleración, la pausa, la fundición de la cabeza y el torneado, se pueden capturar y analizar utilizando este método.

De acuerdo con el protocolo, el ensayo de punto de luz se utilizó para investigar el comportamiento de evitación de la luz de la larva de tercera estrella que se elevó a 25 oC en un medio estándar en una habitación con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Una sola larva w1118 fue probada usando el ensayo de punto de luz a 25,5 oC. La intensidad lumínica media del punto de luz generado por un LED de 460 nm fue de 0,59 W/cm2. Todo el proceso de entrada y salida larval del punto de l...

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Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Usando el ensayo de punto de luz, el comportamiento de las larvas se puede rastrear antes, durante y después de entrar en el área de luz permitiendo analizar el detalle del movimiento larval. Este ensayo es simple y fácil de realizar. La respuesta de la luz se prueba una sola vez, de modo que cualquier posible efecto de adaptación de la luz puede ser excluido.Para preparar las placas de agar, cubra lenta y uniformemente la parte inferior de una placa petri de 15 centímetros con una capa de aproximadamente cuatro milímetros de espesor de 1% de agar caliente. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente hasta que el agar se haya solidificado. Para configurar el sistema de estimulación visual, sujete una fuente de luz LED preparada en un marco de hierro, teniendo cuidado de que la luz se proyecta hacia el escritorio.Incline ligeramente el cilindro hasta que el ángulo entre el plano del cilindro y el plano vertical sea de unos 10 grados. Conecte la luz LED azul de 470 nanómetros al LED un enchufe del controlador LED de alta potencia y encienda el controlador. Gire la perilla en la esquina superior derecha del controlador para seleccionar el canal 470 nanómetros y haga clic en LED.Cuando la pantalla muestra una comprobación, aparecerá un punto de luz azul en el escritorio. Haga clic en Aceptar y gire la perilla para ajustar la intensidad de la luz. Mueva la posición de la fuente de luz hacia arriba y hacia abajo para ajustar el diámetro del punto de luz a dos centímetros.Gire el mando para seleccionar la intensidad de la luz de acuerdo con los requisitos experimentales. Utilice una consola de medidor de potencia compacta con un sensor de potencia de diodo fotográfico estándar para medir la potencia máxima y mínima de la luz en el lugar. La potencia lumída necesita medirse en la oscuridad en el experimento real.A continuación, registre la potencia de la luz, mida tres veces y utilice el valor promedio. Para configurar el sistema de imaginación, sujete una cámara web de alta resolución con un clip de hierro unos 10 centímetros por encima del punto de luz en el escritorio y ajuste la orientación de la lente de la cámara hacia el escritorio. Conecte la cámara a un ordenador con Windows 7 a través de una interfaz USB y coloque la placa de agar en el escritorio justo debajo de la cámara.Abra el software AMCap 9.22, el punto de luz se mostrará automáticamente en la ventana AMCap. Mueva la cámara ligeramente a la izquierda o a la derecha para asegurarse de que el punto de luz está cerca del centro de la ventana. Utilice un clip para fijar un filtro de paso de banda de 850 más o menos tres nanómetros a cinco a siete milímetros inmediatamente debajo de la cámara.Coloque tres LED de generación de luz infrarroja con una longitud de onda central de 850 nanómetros uniformemente alrededor de la placa de agar a unos cinco centímetros del borde de la placa y con lentes LED en un ángulo de 70 grados orientado hacia la placa. A continuación, conecte los LED a una fuente de alimentación a través de sus convertidores de CA a CC. En el menú del software AMCap, seleccione las opciones, el dispositivo de vídeo y el formato de captura y establezca el tamaño de píxel del vídeo capturado en 800 por 600 y la velocidad de fotogramas en 60 fotogramas por segundo.Retire el filtro y coloque una regla debajo de la cámara. Ajuste el enfoque de la cámara hasta que la línea de escala esté clara y paralela al ancho del campo de visión de vídeo y haga clic en captura, configuración y captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado. A continuación, haga clic en Iniciar grabación para grabar la distancia real correspondiente a 600 píxeles y calcular la relación de cada píxel con la distancia real.Antes de introducir la larva en la configuración de imágenes, adquiera un video corto de la posición de la luz y nombre el área de luz de vídeo de fondo de control sin filtrar uno. Coloque el filtro de nuevo en la lente de la cámara y encienda una luz lejos del dispositivo experimental a un ajuste lo más bajo posible mientras permite observar claramente las larvas. Use una cuchara para eliminar algunas larvas del medio de cultivo y seleccione suavemente una larva de tercera estrella.Lave la larva en agua destilada y coloque la larva en el centro de la placa de agar. Retire suavemente el exceso de agua de la larva y apague la luz de la habitación. Deje que la larva se aclimate durante dos minutos en el ambiente oscuro antes de encender la luz LED infrarroja.El siguiente experimento de comportamiento de evitación de la luz debe llevarse a cabo en la oscuridad. Para la comodidad de la demostración filmamos con la luz brillante. Cepille suavemente la larva hasta el centro de la placa.Cuando la larva comience a gatear recta, gire la placa para hacer que la larva se dirija hacia el punto de luz. Haga clic en captura, configuración y captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado y haga clic en Iniciar grabación para grabar. Permita que la larva se arrastre hacia, entre y salga del punto de luz hasta que esté casi fuera del campo de visión y haga clic en Detener grabación.Aleje el filtro de la cámara y adquiera un vídeo corto de la posición del punto de luz. A continuación, asigne al campo el nombre el área de luz de vídeo sin filtrar del ensayo y compare este vídeo con el área de luz de un vídeo para asegurarse de que no se cambia la posición del punto de luz. Aquí, se pueden observar curvas de tiempo de la velocidad de la cola, ángulo de flexión del cuerpo y velocidad angular de la flexión del cuerpo de una larva representativa.El tamaño de la cabeza larvaria fundida y, por lo tanto, el ángulo máximo de flexión del cuerpo se reduce significativamente en larvas de tercera estrella con neuronas octopaminerérgicas inhibidas por la expresión tóxica del tétanos en comparación con los controles parentales que indican que las neuronas Tdc2-Gal4 son necesarias para una respuesta normal a la luz larval. Para un procesamiento de imagen correcto, asegúrese de que la cámara no bloquee la luz y de que el punto de luz sea redondo y cerca del centro de la ventana. Después de este procedimiento, se puede realizar optogenética para observar cómo reaccionan las larvas cuando se activan neuronas específicas.Usando este ensayo, los detalles del movimiento larval pueden ser analizados permitiendo estudiar el impacto lejano del medio ambiente y de los factores internos en el comportamiento de evitación de la luz larval.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

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Investigación

Biología

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