Name: light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (31671074) ve Zhejiang İl Üniversiteleri (2019XZZX003-12) için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.

1. Drosophila larvalarının hazırlanması
<ol><li>Haşlanmış mısır unu (73 g), agar (5,6 g), soya küse (10 g), maya (17,3 g), şurup (76 mL) ve sudan (1000 mL) oluşan standart ortam hazırlayın.</li>
	<li>12 h/12 h açık/koyu çevrimli bir odada standart ortamda tüm sinekleri 25 °C'de kaldırın.</li>
</ol>2. Agar plakalarının hazırlanması
<ol><li>%1.0 agar çözeltisi hazırlayın. Bir denge ile 500 mL beher agar 3 g tartın, sonra distile su 300 mL ekleyin. Suyun buh...

<ol>
	<li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila.">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).</li><li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation.">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li><li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+behavior:+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions.">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).</li><li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues.">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference.">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113 (2013).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference.">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance.">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li><li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit.">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li><li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae.">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors.">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642 (2012).</li></ol>

Bu protokol, Drosophila larvalarının ışıktan kaçabilme yeteneğini test etmek için ışık noktası testini sunuyor. Bu teşbit, larvaların girilmeden önce, karşılaşma sırasında ve ışık noktasını terk ettikten sonra davranışlarının izlenmesini sağlar. Larva hareketinin ayrıntıları yakalanabilir ve analiz edilebilir. Işık nokta sıcazarlığı çok basittir ve güçlü pratiktedir. Tüm cihazın maliyeti yüksek değildir. Deneyde, LED ışığı ışık kaynağı olarak kullanılır....

Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksis, özellikle son 50 yıl içinde1,2,3,4,5,6,7 soruşturma altında olmuştur ,8. Son yıllarda, 1) larva ışık kaçınma aracılık birçok nöronlar tespit edilmiştir olmasına rağmen4,5,9,10,11,12 ve 2) sinapsçözünen larva görme sisteminin komple konektom13kurulmuştur , larva fototaksis altında yatan nöral mekanizmalar büyük ölçüde belirsiz kalır.
Larva fototaksilerinin incelenmesinde bir takım davranışsal tahliller kullanılmıştır. Bunlar büyük ölçüde iki sınıfa ayrılabilir: biri uzaysal ışık gradyanlarını, diğeri de zamansal ışık gradyanlarını içeren. Uzamsal ışık degrade ssays için, arena ışık ve karanlık bölümlerin eşit sayıda ayrılır. Arena açık ve koyu yarıya bölünebilir2,4 veya açık ve koyu dörtlü14,15, hatta bir damatahtası7 gibi alternatif ışık ve karanlık kareler ayrılabilir . Genellikle, agar plakaları mekansal ışık gradyan tsay için kullanılır, ancak alternatif ışık ve karanlık bölümlere bölünmüş tüpler de kullanılabilir10,14.
Tahlillerin eski versiyonunda, ışık aydınlatması genellikle larvaların altından kaynaklanır. Ancak, yeni versiyonlarda aydınlatma büyük ölçüde yukarıdan kaynaklanır, çünkü larva gözleri (örneğin, bolwig'in düşük veya orta ışık yoğunluklarına duyarlı organları16)opak sefaopharyngeal iskelette bulunan ve açıklıkları olan üst cephe. Bu da larvaları üst cephe yönlerden gelen ışığa karşı daha duyarlı halegetirir. Zamansal ışık degrade syon için, ışık yoğunluğu arenada mekansal olarak düzgündür, ancak yoğunluk zamanla değişir. Temporal kare dalga ışığına ek olarak (örn. yanıp sönen açık/kapalı veya güçlü/zayıf ışık3,7), yoğunlukta doğrusal bir rampaya uyan zamansal değişen ışık da larvaların şiddetini ölçmek için8 zamansal olarak değişen ışık uyarıcı.
Fototaksit tsay üçüncü bir türü yön ışık scape navigasyon, 45 °7bir açıyla yukarıdan aydınlatma içerir. Kane ve ark.7çalışmalarından önce, larva sayısı, dönüş sıklığı ve iz uzunluğu gibi kaba parametreler larva fototaksis tahlillerinde hesaplanmıştır. Bu aynı grubun çalışmalarından bu yana, larva fototaksisleri için yüksek zamansal çözünürlüklü video kaydının analizi ile, fototaksis sırasında larva hareketinin ayrıntılı dinamikleri (yani larva gövdesinin farklı kısımlarının anlık hızları, yön başlığı, dönüş açısı ve buna karşılık gelen açısalhız) 7 analiz edilmiştir. Böylece larva fototaksisi davranışının daha fazla ayrıntısı keşfedilebilmiştir. Bu tahlillerde larvalar gruplar halinde test edilir, böylece grup etkileri dışlanmaz.
Bu protokol, bireysel ışık stimülasyonuna larva davranışsal yanıtların araştırılması için bir ışık noktası teşpiği sunar. Ana deneysel kurulum görsel stimülasyon sistemi ve kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi oluşur. Görsel stimülasyon sisteminde, bir LED ışık kaynağı larva test edildiği bir agar plaka üzerinde yuvarlak 2 cm çapında ışık noktası oluşturur. Işık yoğunluğu bir LED sürücüsü kullanılarak ayarlanabilir. Görüntüleme sistemi, kamera için aydınlatma sağlayan üç adet 850 nm kızılötesi LED'e ek olarak larvanın davranışını yakalayan bir kızılötesi kamera içerir. Kameranın merceği, görsel stimülasyon sisteminden gelen ışığın kameraya girmesini engellemek için 850 nm bant geçiş filtresi ile kaplanırken, kızılötesi ışığın kameraya girmesine izin verilir. Böylece görüntülemede görsel uyarılmanın girişime karışması önlenmiş olur. Bu testte, ışık tan önce, sırasında ve girdikten sonra dahil olmak üzere bir süre içinde bireysel larvaların hızlı tepkilerinin davranış detayları kaydedilir ve analiz edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>850 nm &#177; 3 nm infrared-light-generating LED</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>PM100A</td>
			<td>Compatible Sensors: Photodiode and Thermal 
			Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W 
			Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 &#956;m Display Refresh Rate: 20 Hz 
			Bandwidtha: DC-100 kHz 
			Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA 
			Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC to DC converter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S120VC</td>
			<td>Aperture Size: &#216;9.5 mm 
			Wavelength Range: 200-1100 nm 
			Power Range: 50 nW-50 mW 
			Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) 
			Linearity: &#177;0.5% 
			Measurement Uncertaintyc: &#177;3% (440-980 nm), &#177;5% (280-439 nm), &#177;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>DC2100</td>
			<td>LED Current Range: 0-2 A 
			LED Current Resolution: 1 mA 
			LED Current Accuracy: &#177;20 mA 
			LED Forward Voltage: 24 V 
			Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave 
			Modulation: Arbitrary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimated LED blue light&#160;</td>
			<td>ELP, China</td>
			<td>USBFHD01M</td>
			<td>Max. Resolution: 1920X1080 
			F6.0 mm 
			Sensor: 1/2.7&#34; CMOS OV2710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact power meter console&#160;</td>
			<td>Ocean Optics, USA</td>
			<td>USB2000+(RAD)</td>
			<td>Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm 
			Weight: 190 g 
			Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) 
			Wavelength range: 200-850 nm 
			Integration time: 1 ms &#8211; 65 seconds (20 seconds typical) 
			Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition 
			Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) 
			Dark noise: 50 RMS counts 
			Grating: 2 (250 &#8211; 800 nm) 
			Slit: SLIT-50 
			Detector collection lens: L2 
			Order-sorting: OFLV-200-850 
			Optical resolution: ~2.0 nm FWHM 
			Stray light: &#60;0.05% at 600 nm; &#60;0.10% at 435 nm 
			Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Driver</td>
			<td>Minhongshi, China</td>
			<td>MHS-48XY</td>
			<td>Working voltage: DC12V 
			Central wavelength: 850nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution web camera</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>MWWHL4</td>
			<td>Color: Warm White 
			Correlated Color Temperature: 3000 K 
			Test Current for Typical LED Power: 1000 mA 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Bandwidth (FWHM): N/A 
			Electrical Power: 3000 mW 
			Viewing Angle (Full Angle): 120&#730; 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: &#62;50 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupa: RG1 &#8211; Low Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Warm White</td>
			<td>Mega-9, China</td>
			<td>BP850/22K</td>
			<td>&#216;25.4(+0~-0.1) mm 
			Bandwidth: 22&#177;3nm 
			Peak transmittance:80% 
			Central wavelength: 850nm&#177;3nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>Noel Danjou</td>
			<td>Amcap9.22</td>
			<td>AMCap&#160;is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most&#160;Video-for-Windowsand&#160;DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard photodiode power sensor&#160;</td>
			<td>Super Dragon, China</td>
			<td>YGY-122000</td>
			<td>Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A 
			Output: DC 12V 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>M470L3-C1</td>
			<td>Color: Blue 
			Nominal Wavelengtha: 470 nm 
			Bandwidth (FWHM): 25 nm 
			Maximum Current (CW): 1000 mA 
			Forward Voltage: 3.2 V 
			Electrical Power (Max): 3200 mW 
			Emitter Size: 1 mm x 1 mm 
			Typical Lifetime: 100 000 h 
			Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 &#176;C 
			Storage Temperature: -40 to 70 &#176;C 
			Risk Groupb: RG2 &#8211; Moderate Risk Group</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal power sensor&#160;</td>
			<td>Thorlabs, USA</td>
			<td>S401C</td>
			<td>Wavelength range: 190 nm-20 &#956;m 
			Optical power range:10 &#956;W-1 W(3 Wb) 
			Input aperture size: &#216;10 mm 
			Active detector area: 10 mm x 10 mm 
			Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) 
			Linearity: &#177;0.5%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light spot-based assay for analysis of drosophila larval phototaxis

Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksiler hayvan kaçınma davranışı çalışma için bir model olarak kullanılabilir. Bu protokol larva fototaktik davranışını araştırmak için bir ışık noktası teşp. Deneysel kurulum iki ana bölümden oluşur: ışık noktasını oluşturan bir görsel stimülasyon sistemi ve larva ışıktan kaçınma işlemini kaydeden kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi. Bu teşbit, larvanın ışık noktasını girmeden, karşılaşmadan önce ve ışık noktasından ayrıldıktan sonra izlenmesini sağlar. Yavaşlama, duraklama, baş dökümü ve tornalama gibi larva hareketinin ayrıntıları bu yöntemle yakalanabilir ve analiz edilebilir.

Protokole göre, ışık noktası teşbi, 12 h/12 h ışık/karanlık çevrimi olan bir odada standart ortamda 25 °C'de yükseltilen üçüncü yıldız larvasının ışık kaçınma davranışını araştırmak için kullanılmıştır. Tek bir w1118 larva sıcanda 25.5 °C'de ışık noktası testi kullanılarak test edilmiştir. 460 nm LED tarafından üretilen ışık noktasının ortalama ışık yoğunluğu 0,59 μW/cm2idi. Larva giriş ve ışık nokta çıkarken tüm süreç kayd...

Watch this Scientific Journal Video about Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis at JoVE.com

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Işık noktası teşbesi kullanılarak larvaların davranışı, larva hareketinin ayrıntılarının analiz edilmesine izin vererek ışık alanına girmeden önce, sırasında ve girdikten sonra izlenebilir. Bu titrebasit ve gerçekleştirmek kolaydır. Işık tepkisi yalnızca bir kez test edilir, böylece ışık adaptasyonunun olası etkileri dışlanabilir.Agar plakaları hazırlamak için, yavaş ve eşit sıcak% 1 agar yaklaşık dört milimetre kalınlığında tabaka ile 15 santimetre Petri çanak alt kapağı. Agar katılanına kadar tabağın oda sıcaklığında soğumasını bekleyin. Görsel stimülasyon sistemini kurmak için, ışığın masaüstüne doğru yansamasını göz önüne alarak, hazırlanmış bir LED ışık kaynağını demir bir çerçeveye takın.Silindir düzlemi ile dikey düzlem arasındaki açı yaklaşık 10 derece olana kadar silindiri hafifçe yatırın. 470 nanometre mavi LED ışığını yüksek güçlü LED sürücüsünün LED tek fişe bağlayın ve sürücüyü açın. Kanal 470 nanometreseçmek için sürücünün sağ üst köşesindeki düğmesini çevirin ve LED'i tıklatın.Ekran bir çek görüntülediğinde, masaüstünde mavi bir ışık noktası görünür. Tamam'ı tıklatın ve ışığın yoğunluğunu ayarlamak için düğmesini çevirin. Işık noktasının çapını iki santimetreye ayarlamak için ışık kaynağının konumunu yukarı ve aşağı hareket ettirin.Deneysel gereksinimlere göre ışık yoğunluğunu seçmek için düğümü döndürün. Spottaki maksimum ve minimum ışık gücünü ölçmek için standart fotoğraf diyot güç sensörüne sahip kompakt bir güç ölçer konsolu kullanın. Işık gücünün gerçek deneyde karanlıkta ölçülmesi gerekir.Daha sonra ışık gücünü kaydedin, üç kez ölçün ve ortalama değeri kullanın. Hayal sistemini kurmak için, yüksek çözünürlüklü bir web kamerayı masaüstündeki ışık noktasının yaklaşık 10 santimetre üzerinde demir klipsle kenetleyin ve kamera merceğinin masaüstüne doğru yönünü ayarlayın. Kamerayı USB arabirimi üzerinden Windows 7 çalıştıran bir bilgisayara bağlayın ve agar plakasını kameranın hemen altına masaüstüne yerleştirin.AMCap 9.22 yazılımını açın, ışık noktası AMCap penceresinde otomatik olarak gösterilir. Işık noktasının pencerenin merkezine yakın olduğundan emin olmak için kamerayı hafifçe sola veya sağa hareket ettirin. Kameranın hemen altında 5 ila 7 milimetrelik bir 850 artı veya eksi üç nanometre bandpass filtresini düzeltmek için bir klip kullanın.Agar plakasının etrafına 850 nanometrelik merkezi dalga boyuna sahip üç kızılötesi ışık üreten LED'leri plakanın kenarından yaklaşık beş santimetre uzağa ve plakaya doğru bakan 70 derecelik bir açıyla LED lenslerle yerleştirin. Daha sonra LED'leri AC'leri aracılığıyla dc dönüştürücülerine bir güç kaynağına bağlayın. AMCap yazılımının menüsünde seçenekleri, video aygıtını ve yakalama biçimini seçin ve yakalanan videonun piksel boyutunu 800'e 600'e, kare hızını ise saniyede 60 kare olarak ayarlayın.Filtreyi çıkarın ve kameranın altına bir cetvel yerleştirin. Ölçek çizgisi net olana ve video alanının genişliğine paralel olana kadar kamera odağı ayarlayın ve kaydetme yolunu seçmek için yakalama, kurulum ve video yakalamayı tıklatın. Ardından, 600 piksele karşılık gelen gerçek mesafeyi kaydetmek ve her pikselin gerçek uzaklık oranını hesaplamak için kayıt başlat'ı tıklatın.Larvayı görüntüleme kurulumuna tanıtmadan önce, ışık konumunun kısa bir videosunu edinin ve filtrelenmemiş kontrol arka plan video ışık alanı nın adını adlandırın. Filtreyi kamera merceği üzerine geri yerleştirin ve larvaların net bir şekilde gözlemlenebilmesine izin verirken deneysel cihazdan mümkün olduğunca düşük bir ayarda Bir ışık açın. Kültür ortamı bazı larvaları kaldırmak ve yavaşça üçüncü bir yıldız larva seçmek için bir kaşık kullanın.Larvayı distile suda yıkayın ve larvayı agar plakasının ortasına yerleştirin. Larvadaki fazla suyu yavaşça çıkarın ve odanın ışığını kapatın. Kızılötesi LED ışığını açmadan önce larvanın karanlık ortamda iki dakika boyunca alışmasını bekleyin.Aşağıdaki ışık kaçınma davranışı deneyi karanlıkta yapılmalıdır. Gösterinin kolaylığı için parlak ışıkta filme aldık. Larvayı tabağın ortasına doğru hafifçe fırçalayın.Larva düz sürünmeye başladığında, larvanın ışık noktasına doğru yönelmesi için plakayı döndürün. Kaydet yolunu seçmek için yakalama, kurulum ve video yakalama'yı tıklatın ve kaydetmek için kayıt başlat'ı tıklatın. Larvanın görüş alanının dışına çıkana kadar ışık noktasını doğru sürünmesine, girmesine ve bırakmasını bekleyin ve kaydı durdur'u tıklatın.Filtreyi kameradan uzağa taşıyın ve ışık noktasının konumunun kısa bir videosunu edinin. Sonra post tsay filtresiz video ışık alanı iki adı ve ışık nokta konumunu değişmedi emin olmak için ışık alanı bir video ile bu videoyu karşılaştırın. Burada kuyruk hızının zaman eğrileri, gövde bükme açısı ve temsili bir larvanın gövde bükme açısal hızı görülebilir.Larva kafa döküm boyutu ve bu nedenle, maksimal vücut bükme açısı önemli ölçüde tdc2-Gal4 nöronlar normal bir larva ışık yanıtı için gerekli olduğunu gösteren ebeveyn kontrolleri ile karşılaştırıldığında tetanoz toksik ekspresyonu ile inhibe ahtapotaminjik nöronlar ile üçüncü instar larvaları azalır. Başarılı görüntü işleme için kameranın ışığı engellemediğinden ve ışık noktasının yuvarlak ve pencerenin merkezine yakın olduğundan emin olun. Bu işlemden sonra, belirli nöronlar aktive edildiğinde larvaların nasıl tepki verdiğini gözlemlemek için optogenetik yapılabilir.Bu analiz kullanılarak, larva hareketinin ayrıntıları analiz edilerek çevresel ve iç faktörlerin larva ışıktan kaçınma davranışı üzerindeki uzak etkisi nin incelenmesine olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

İncelenmesi<em&gt; Drosophila</emIşık Mikroskopi tarafından&gt; Larva Trakeal Terminal Hücreleri

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...