Name: prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
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这项研究与注册为ANP 21005-4的正在进行的研发项目"PROBIO-DEEP - 石油和天然气勘探对深海海洋生物生物体的潜在影响的调查"和潜在生物指标的选择一起进行。bioremediation processes for these ecosystems" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) – "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos由壳牌巴西公司根据ANP研发税赞助的"经济生态研究"，其"经济投资局"提交人还感谢国家最高人民会议（CNPq）和科尔德纳·德阿佩尔费奥阿门托·德内维尔高级委员会（卡米拉·梅西亚斯、菲利普·罗萨多和恩里克·弗拉戈索·多斯桑托斯） 的财政支助，提供的图像。

1. 水和珊瑚的收集和储存，用于微生物隔离
注：必须测量采样点的坐标和温度。如果可能，盐度、pH、深度和光强度等元数据也有助于找到微调的培养方法以及未来对数据的解释。为获得可靠的结果，请尽可能将样品存储在最短时间内。如果样品没有保持在适当的温度和/或长期储存，水/珊瑚微生物群可能会有很大变化。如果在收集后没有立即执行隔离步骤，则在处理之前将样品保持在 4°C 至关重要。样品储存的时间越长，即使在4°C下，微生物群落的变化也越多。
<ol><li>样品和储存海水。<ol>
<li>从每个目标取样点收集至少三次水的500 mL水样。最好使用带螺丝帽的无菌瓶。</li>
		<li>如果在收集后立即处理水，请暂时将瓶子放在 RT 上。如果稍后进行样品处理，请将瓶子保持在 4°C。</li>
	</ol>
</li>
	<li>样品和储存珊瑚。<ol>
<li>使用无菌钳切割来自水样同一取样地点的珊瑚碎片。为避免污染，请仅用无菌手套触摸珊瑚。</li>
		<li>使用 20 mL 无菌盐碱溶液（蒸馏水中的 3% NaCl）或人工海水冲洗样品珊瑚片段，以去除海水中松散附着的自由生活细菌。</li>
		<li>使用钳子，将每个珊瑚碎片放入一个无菌的250~500 mL容器中，带有一个含有无菌盐溶液的螺丝帽。</li>
		<li>在实验室中，使用无菌钳子和钳子，使用无用 100 mm x 20 mm 培养皿在称重秤上称量 5 克的珊瑚碎片。</li>
		<li>将5克珊瑚样品转移到无菌砂浆中，并用无菌虫将其浸渍。</li>
		<li>使用无菌铲，将浸渍样品转移到含有45 mL 3%NaCl无菌溶液和10+15玻璃珠5毫米的无菌培养瓶中。使用45 mL无菌盐水溶液中的一部分清洗砂浆，并回收最大量的黄麻。</li>
		<li>在取样点的水温下，将烧瓶保持恒定搅拌（150 x g）16小时。 注：对于浅水珊瑚，最佳温度为24~28°C。此步骤将分离出不同珊瑚室的微生物，例如附着在宿主细胞上的微生物，或生活在组织和骨骼内的微生物。此步骤后，不应存储珊瑚黄斑，并且必须立即执行隔离步骤。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 从海水和/或珊瑚中分离EE2降解细菌
<ol><li>选择细菌。 注：在步骤1.1.2和1.2.7之后，海水中从不同珊瑚海酸盐分离的微生物浓度将是未知的和可变的。为了保证含有琼脂培养基的培养皿中个别微生物菌落的隔离，需要连续稀释。<ol>
<li>在珊瑚样品无菌盐碱溶液中执行高达10-9的连续稀释，对水样进行多达10-6的稀释。移液器在丢弃尖端之前向上和向下稀释 5 倍。涡流样品每次5s，然后执行下一次序列稀释。</li>
		<li>在含有 3% NaCl 液化肉汤 （LB） 琼脂介质的培养皿上，每个稀释剂 100 μL，并盘。 注：使用海洋琼脂（MA）作为替代介质。为了获得可靠的结果，需要每个稀释的三次。</li>
		<li>在目标温度下（例如，26 °C）孵育板1~3天。每天检查一次盘子。</li>
		<li>使用条纹板技术选择并隔离在新板上呈现明显生长形态的菌落。根据需要多次重复此步骤，使纯菌群在盘子上生长。</li>
		<li>如果步骤 2.3.1 没有立即继续执行该过程，则如第 2.2 节所述，在 4°C 或甘油中储存隔离物。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备甘油库存。 注：此步骤是可选的，可用于长期细菌储存。<ol>
<li>从新鲜板或储存在 4°C 的板中挑选单个菌落，并在 2 mL 无菌 LB 介质中独立接种。</li>
		<li>将管子置于恒定搅拌（150 x g）下，在 24~28 °C 过夜 （ON）。</li>
		<li>从步骤2.2.2和无菌甘油加入1 mL的细菌培养物，最终浓度为20%，至2 mL冷冻液中。</li>
		<li>使低温在 4°C 时保持打开。</li>
		<li>将甘油细菌库存置于-80°C，直到需要为止。</li>
	</ol>
</li>
	<li>执行 EE2 降级能力测试。<ol>
<li>激活 LB 肉汤或替代介质中的隔离物。为此，从储存在4°C的新鲜板或板中挑选单个菌落，接种2 mL的无菌LB介质。如果是甘油库存，首先在LB琼脂板上繁殖，在24~28°CON孵育，使单个菌落生长。将含有LB介质的管子置于恒定搅拌（150 x g）下，温度为24~28 °C。</li>
		<li>细菌生长后，在室温（RT）下，在8，000 x g下将细胞离心8分钟，从而颗粒细胞。丢弃上清液，轻轻上下移液，将细胞重新悬浮在相同体积（2 mL）的盐水中，以清洗剩余的LB汤。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 两次，以确保没有碳源的痕迹，在相同体积的盐溶液中重新悬浮细胞。例如，如果它以 2 mL 培养法启动，则在 2 mL 盐溶液的最终体积中重新悬浮细胞。</li>
		<li>接种洗涤和再悬浮的细胞在最小布什内尔哈斯培养基（BH Broth）含有EE2作为唯一的碳源59。 注：EE2在培养基中溶解在乙醇中，最终浓度为5mg/L。如果需要，更改污染物类型和/或浓度。</li>
		<li>在LB琼脂介质33上，通过600nm的光学密度和/或菌落形成单元（CFU）评估细菌生长，培养16~72小时。 注：或者，微生物可以直接在含有EE2或其他化合物的最小介质上分离，作为唯一的碳源。此步骤将指导选择，并避免不良增长。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 从海水和/或珊瑚中分离油降解细菌
<ol><li>准备含有油水溶性分数（oWSF）和油水不溶性分数（oWIF）的最小介质作为唯一的碳源21。<ol>
<li>在500 mL无菌蒸馏水中加入1⁄2%的原油。使用底部打开的过滤瓶将可溶性分数从不溶性分数的上层中拉出。</li>
		<li>将混合物在24~28°C下保持150 x g的恒定搅拌，持续48小时。</li>
		<li>将含有原油馏分的滤瓶放在稳定的表面上，等待10~20分钟，以便进行可溶性和不溶性分数分离。</li>
		<li>将 oWSF 转移到新的无菌烧瓶中，通过打开底部过滤器烧瓶并取出可溶性馏分来节省 oWIF。</li>
		<li>使用上一步中回收的所有 oWSF （+400 mL），制备 1 L 的 BH Agar 最小介质，其中含有 oWSF 作为唯一的碳源。</li>
		<li>使用步骤 3.1.4 中烧瓶中剩余的 oWIF，制备 1 L 的 BH Agar 最小介质，其中含有 oWIF 作为唯一的碳源。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分离 oWSF 和 oWIF 降解细菌。<ol>
<li>分别使用步骤1.1.2和1.2.7中的水和珊瑚浸渍，在步骤2.1.1所述无菌盐溶液中稀释至10-6的样品。</li>
		<li>在含有BH-oWSF和BH-oWIF琼脂介质的培养皿上，每个稀释剂的移液器100μL，并盘上它们。</li>
		<li>重复步骤 2.1.3 到步骤 2.1.5 中描述的步骤。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 联盟成员选择
<ol><li>提取并测序DNA进行分类鉴定。<ol>
<li>如步骤 2.3.1 所述，激活甘油中储存的隔离物。</li>
		<li>使用DNA提取试剂盒提取DNA（见材料表）。</li>
		<li>使用引物 27f （5°-AGA GTGA TGA TGA TGA TGG CTC AG-3+） 和 1492r （5°-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3+） 扩增 16S rRNA 基因。</li>
		<li>根据以下方案执行50μL PCR反应：5μL的10x聚合酶缓冲液，2mMMgCl2，0.2 mM dNTPs，每个引物5 mM，10 ng基因组DNA和2.5 U的塔克DNA聚合酶。添加阴性对照（即空白DNA提取和没有模板DNA的PCR反应），以确保没有污染。</li>
		<li>设置以下热循环步骤：在 94°C 下进行第一次变性循环 4 分钟;在94°C下循环35次，1分钟，然后是50°C1分钟，72°C为2.5分钟;在 72 °C 下，最后延长周期为 10 分钟。</li>
		<li>使用 80 V 检查 1.2% 甘蔗凝胶中的阿加龙完整性。</li>
		<li>凝胶使用凝胶纯化试剂盒纯化样品（见材料表）。</li>
		<li>使用荧光计量化 PCR 产品。</li>
		<li>发送产品进行排序。 注：为了更好地分类分类，建议使用 Sanger 方法60，因为它提供长序列。通用引源27f和1492r可用于放大几乎整个长度的16S rRNA基因61。如果无法使用一对引漆组装连体，则应考虑序列中间的一个额外对。</li>
	</ol></li>
	<li>确定增长曲线。<ol>
<li>如步骤 2.3.1 中所述，激活步骤 2.2.5 中甘油库存中的分离物，但使用 5 mL 而不是 2 mL。</li>
		<li>将生长的 5 mL 培养法的 1%（v/v）从步骤 4.2.1 添加到包含 100 mL 3% LB 介质的 250 mL 烧瓶中。确保准备负对照的三联体（无接种）。</li>
		<li>将烧瓶置于24~28°C的恒定搅拌下，置于培养箱中（ 150 x g）。</li>
		<li>每 4 小时服用 1 mL 等分 48 小时。如果菌株存在高增长率，则减少 4 h 的间隔。</li>
		<li>测量 600 nm 波长的光学密度 （OD） 估计，从富介质板上镀的串行稀释液（每个板中应接种 100 μL 并归化为 1 mL 的体积）中计数的菌群形成单元 （CFU）。</li>
		<li>绘制OD和CFU曲线，并分析每个应变的OD/CFU的相关性。从现在开始，根据 OD 值计算单元格数。</li>
	</ol></li>
	<li>执行对抗测试。<ol>
<li>如步骤 2.3.1 所述激活隔离物。</li>
		<li>沿着含有琼脂介质的板的中间一次接种一个菌株，而与中央介质垂直的其他菌株。重复，直到每个选定的微生物菌株测试所有其他。</li>
		<li>在 24-28 °C 孵育板并每天监测它们，以观察指示对抗性活动的潜在光晕。如果观察到光晕指示两个菌株之间的对抗性活动，则应排除其中一个。</li>
	</ol></li>
	<li>执行联合体程序集。<ol>
<li>如步骤 2.3.1 所述激活隔离物。</li>
		<li>在3，500 x g下粒细胞，在同等体积的盐水溶液中轻轻清洗2倍。以同等体积重新悬浮细胞（即，如果最终体积为 2 mL 的细胞，请使用 2 mL 的盐水溶液清洗细胞，并在 2 mL 的最终体积中重新悬浮它们）。</li>
		<li>在 100 mL 3% NaCl LB 介质中接种 1 mL 培养物，并在 150 x g 下孵育ON。
</li>
		<li>重复步骤 4.5.2，接种 10 L 培养、洗涤和重新悬浮的 10 L 培养物。在无菌空气提升生物反应器中孵育ON，从泵接收过滤空气。如果需要更多的文化，总是接种1%的成人文化在新鲜的媒体。</li>
		<li>在 4°C 下以 8，000 x g的离心培养物 8 分钟。离心后丢弃上清液。</li>
		<li>清洗颗粒，在500 mL无菌盐水溶液中轻轻重新悬浮细胞。</li>
		<li>重复步骤 4.5.5 和 4.5.6。</li>
		<li>在100 mL的盐水溶液中重新悬浮每个单独培养，并测量OD以估计细胞数量。</li>
		<li>计算达到107细胞mL-1的最终浓度所需的每种培养的体积。</li>
		<li>执行CFU计数丰富的媒体，以最终确认细胞的生存能力和浓度。</li>
		<li>在无菌烧瓶中混合每个单独培养液的同等体积，并将联合体与50 mL 无菌管中等分。</li>
		<li>保持在4°C，直到接种。 注：准备联合体组装尽可能新鲜，以确保单元仍然可行。或者，CFU 计数可以在接种前执行。为了组建一个理想的联合体，有必要使用具有不同和互补代谢能力的分离物。通常，6-10 个隔离物用于形成联营集团，但此数量会因成员的特征和目的而异。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 检测珊瑚的假定有益特性
<ol><li>通过在LB琼脂板上条纹它们，并在24°28°C ON孵育它们，使其有单一菌落生长，从而激活甘油库存中的分离物。从板中挑选单个菌落，并在 2 mL 无菌 LB 介质中接种。在24~28°C打开时，将含有LB介质的管置于恒定搅拌（150 x g）下。</li>
	<li>执行 DNA 提取，如第 4.1 节所述，以便通过 PCR 检测潜在有益基因。 注：PCR反应条件和引源取决于靶向基因。表1描述了测试单个菌株的BMC特性和PCR检测潜在有益基因的方法。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

在过去50年中，生物修复方法得到了大量探索。例如，在几个不同生境的细菌、蓝藻、微藻和真菌中，有200多个微生物被指定为能够指示油碳氢化合物的存在和/或降解油碳氢化合物62、63、64.此外，对环境和人类造成影响的其他化合物，如塑料、双酚A、内分泌干扰物和重金属，是生物修复技术发展的目标65，66。 67.另一方面，海洋益生菌的发展仅限于对经济有明显影响的领域，如水产养殖中的鱼类益生菌68、69。然而，为保护珊瑚礁、支持渔业、旅游业和其他有利可图的活动的海洋生态系统而对有益微生物的隔离和定性，开始受到重视。在这里，一个廉价、简单和容易获取的协议，用于选择降解污染物的微生物，这些微生物也可以为当地海洋生态系统，特别是假定有益于珊瑚的微生物（pBMCs）提供潜在的有益特性。描述。
此外，这里展示的方法对多种化合物和不同类型的微生物来源具有很强的适应性。通过替换添加到最小介质中的唯一碳源，可以针对不同的污染物。为此，应以所需的浓度添加其他化合物，而不是油或EE2。这将是为目标污染物分离降解剂的选择性压力。例如，能够降解其他类内分泌干扰物的微生物已经使用同样的方法选择和测试70。此外，其他海洋和陆地生物，如海绵和植物71，72，以及不同类型的环境样本，如土壤，燃料和岩石，可以作为降解微生物来源25， 73，74.例如，可以从不同的土壤和沉积物样本25、54、63、64、75中检测和分离碳氢化合物降解细菌。最后，在介质中稍作修改，细菌以外的微生物可以很容易地选择为降解微生物。例如，有76种能够有效降解雌激素化合物的微藻菌株被报道为76。
理想情况下，生物修复-益生菌联合体必须为每个特定的化合物或区域组装。与原生条件相比，在特定环境中生长的微生物在新地点的生长情况可能并不相同。由于研究人员尚未发现可在所有不同环境条件下有效应用的产品，因此应针对每种具体情况进行新的联营公司组装。这将类似于个性化药物，用于环境定制恢复。因此，建立具有潜在益生菌特性和降解能力的微生物菌株中央银行是这一领域取得进展的关键步骤。这一举措将节省时间和工作，促进世界各地新特定财团的组装。
与珊瑚相关的微生物（即微藻、细菌、古生物、真菌和病毒）在维持宿主平衡方面具有复杂而复杂的作用。环境压力因素，如污染，也会破坏珊瑚微生物群的稳定，导致生物菌发育不良，从而可能导致疾病和死亡。珊瑚微生物群支持珊瑚健康的机制开始显现。这些机制是了解珊瑚耐受性和对环境压力的复原力，从而促进珊瑚礁持久性和保存性的关键。此外，该领域的发现将有助于了解一般宿主-微生物群落相互作用，这可能有助于在其他领域制定更好的益生菌和增进健康的战略。更好地研究这些益生菌接种在压力事件期间如何干扰代谢组织的健康也很重要。例如，表明珊瑚性能增强的工作是由于益生菌，而不是仅仅使用细菌作为食物来源的珊瑚。
同时，发展新的联营集团交付办法和改进现有办法也非常重要。联合体固定的替代方法以及创新方法，如接种珊瑚食物（即艺术血症和轮状体）和用作载体，是大有希望的。这些运载系统也可以加以改造，以针对其他海洋生物，对海洋益生菌领域的成功至关重要。
减少污染和珊瑚礁持续存在是定期举行的环境会议强调的两个主要议题。联合国发表的《2030年议程》是一份文件，其中描述了社会为创造可持续未来而应实现的全球目标，并为每个问题专门提出具体目标。虽然目标6强调了通过减少污染改善水质的重要性，但目标14强调了养护和可持续利用海洋和海洋资源的相关性77。在这方面，珊瑚礁保护取决于在不久的将来应实现的变化，包括减轻污染。这是非常重要的，因为大多数大规模的珊瑚损失发生时，其他因素被添加到气候事件，如当地生境破坏和污染78，79。本文表明，生物修复和pBMC接种相结合，降解特定污染物是可能的，同时可以增加珊瑚对污染物和其他问题的抵抗力和复原力。优化现有议定书和（或）开发组合或独立应用的创新方法，对于确定海洋生态系统的未来至关重要。

污染是影响全球人类、动物和植物健康的主要问题。虽然污染可能是自然的，如火山灰1，人类活动是大多数污染的主要原因。人为活动正在污染土壤、水和空气，直接或间接导致近2 000万人过早死亡2，每年造成数十亿种其他形式的生命死亡。即使在地球上最偏远的地区，也存在污染物。例如，在深海无脊椎动物和极地哺乳动物中分别发现了重金属和持久性有机化合物，分别为3、4。
海洋环境尤其受到污染的影响。长期以来，人们一直认为海洋不会受到影响，而且由于其大量的水量，它将继续提供无穷无尽的货物。为此，各类行业和机构在水体中自由释放废物长达几个世纪6，7。各类污染物，如塑料8、合成激素9、农药10、油11、营养物质12、重金属3、放射性废物13等，均被报告为影响海洋生态系统。在这方面，珊瑚礁是海洋环境中最重要和最敏感的生态系统之一。珊瑚礁是沿海保护者，通过在养分循环和气候控制中发挥重要作用，对数千种海洋物种的发展至关重要。珊瑚礁也通过提供鱼类、商品和旅游业等为经济做出贡献。例如，45亿人依赖海洋鱼类作为主要食物来源16，珊瑚礁大大支持海洋鱼类。
无论珊瑚礁在生态、社会和经济上的重要性如何，珊瑚礁正在遭到17、18的毁灭。人为活动是造成珊瑚死亡的三个主要原因的主要原因：气候变化、过度捕捞和水污染19。尽管努力减缓全球变暖固步重要，但努力尽量减少局部污染，包括水污染也很重要，因为当地污染会严重促进珊瑚减少20。因此，迫切需要制定战略，增加珊瑚的寿命，从而为珊瑚提供额外的适应和生存时间。
在这方面，极为重要的是找到解决办法，尽量减少污染，并制定战略，提高珊瑚的适应性。修复海洋污染物的战略非常多样化，可以分为物理、化学和生物方法。物理方法是有帮助的。然而，它们并不总是有效的。例如，塑料废物可以通过物理去除来最小化，而水溶性化合物需要其他方法加以消除。此类化合物的例子包括石油工业活动和泄漏释放的原油，以及其他微污染物，如合成激素，通常用作口服避孕药中的雌激素成分，并存在于污水中 2122.使用化学物质来减少污染可以解决一个具体问题，但它也可能构成额外的污染源。化学分散剂就是这种情况，这种分散剂可以减轻石油污染，因为石油污染对海洋生态系统的毒性甚至比石油污染本身还要严重。由于这些原因，与其他方法相比，生物方法具有若干优点。生物修复是生物或其代谢产物将污染物转化为毒性较小或无毒形式的能力。使用生物方法的主要优点是可持续性、相对低成本、生态友好性，而且它们可应用于不同的生态系统，对环境造成最小或更少的影响21 25，26，27.
此外，环境中微生物群落的操纵允许额外的潜在优势。有与宿主相关的微生物群落，并且对其健康至关重要。众所周知，这些相关的共生微生物群落是维持宿主平衡所必需的19。这些相关微生物的操纵已经为植物和哺乳动物等宿主进行了很好的探索，但珊瑚益生菌的使用仍然是新颖的。珊瑚也承载、相互作用，并依靠大量和特定的微生物种群来生存。这些微生物群落在珊瑚的健康和生物发育中的作用正在积极研究中，但还远远没有完全理解。最流行的假说之一被称为珊瑚益生菌假说。它表明共生微生物与环境条件之间存在动态关系，从而选择最有利的珊瑚元体31。根据这一信息，提出了关键的潜在益生菌机制，以及分离、操作和为珊瑚（BmCs）提供多种用途的有益微生物的策略，并测试了33个。这些潜在的有益特性包括耐温度升高、保护活性氧物种（ROS）、固氮、抗污染物和生物控制病原体等32。
本研究侧重于选择小轮车和自由生物微生物，它们具有降解海洋环境中常见的两种污染物的能力：合成雌激素17a-乙酯醇（EE2）和原油。含有激素活性剂的污染物通常存在于水体34，35，36，37，38，39，4041，42.其中，合成雌激素内分泌干扰化合物（EDCs）模仿雌激素对靶细胞的作用，对动物造成多种影响，包括乳腺癌、不孕症和雌激素症9。EE2由于口服避孕药被人类排泄。传统污水处理厂不会从污水中去除，即使在非常低的浓度（例如，ng/L 或 μg/L）43、44、45中，也会产生负面影响。关于雌激素对珊瑚生理的影响，人们知之甚少。然而，在其他海洋无脊椎动物，如海绵，甲壳类和软体动物，雌激素被报告造成一些主要与繁殖有关的负面影响，如发育和/或刺激配子，改变酶和软体动物蛋白质作用，胚胎过程中的问题，和其他人48，49，50，51，52。EE2污染造成的负面后果突出表明，必须制定可持续的办法，在不影响海洋生物的情况下从环境中清除这种化合物。
与此同时，由于石油目前占世界消耗能源的近40%，因此，长期污染和漏油往往发生在11号礁石区附近。据报道，石油污染对海洋动物、鸟类、植物和人类造成负面影响54、55、56、57。在珊瑚上，它导致漂白，降低幼虫对热应力的抵抗力，破坏微生物相关群落21，并引起组织坏死。此外，化学分散剂，一种石油公司通常用来补救漏油的石油补救技术，对珊瑚的毒性甚至比石油本身还要严重。相比之下，从珊瑚中分离出的有益微生物在宿主健康中起着至关重要的作用。然而，必须更好地探索这些潜在的益生菌的操纵，以调查可能的负面副作用和代谢能力，可以筛选，以提高代谢组织的健康。在此背景下，诸如对珊瑚病原体的抗菌活性、生产催化酶以对抗氧化应激、降解尿素的能力（可能在钙化过程中发挥重要作用）以及基因的存在等特征赋予潜在的有益特征，除其他外，必须成为调查的重点。在这里，我们展示如何利用生物修复和益生菌来同时减轻污染的影响，提高珊瑚健康。开发创新办法，作为干预措施，增加海洋物种的持久性，是朝着一个更可持续、更健康的地球迈出的一步。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 mL PYREX Media Storage Bottle</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1743E20/1395-500</td>
			<td>Used to sample water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Aspirator Bottles</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1234B28/1220-2X</td>
			<td>Used to separate the oil fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-inch wire cutter plier</td>
			<td>thomas scientific/Restek</td>
			<td>1173Y64/23033</td>
			<td>Used to cut coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17a-Ethinylestradiol</td>
			<td>LGC Standards</td>
			<td>DRE-C13245100</td>
			<td>Used as the only carbon source to make the selective media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PCT0901-1KG</td>
			<td>Used to make solid media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell Haas Broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M350-500G</td>
			<td>Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td>
			<td>4882H35/26500-125</td>
			<td>Used to incubate coral macerate with glass beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28903470</td>
			<td>Used to purify PCR products before sending them for sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1177Q81/07DP1070</td>
			<td>Used to detach the microorganisms from coral structures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Needed to work at sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245-1KG</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M384-500G</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital-Shaker Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate liquid media and oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar and Pestle</td>
			<td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td>
			<td>1201U69/JMD150</td>
			<td>Used to macerate coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to centrifuge bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to measure optical density of bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Used for microbial strains DNA extraction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation

污染影响所有生物群系。海洋环境受到的影响特别大，特别是珊瑚礁，这是地球上最敏感的生态系统之一。在全球范围内，有45亿人在经济上依赖海洋，他们的大部分生计由珊瑚礁提供。珊瑚非常重要，因此它们的灭绝会带来灾难性的后果。有几种可能的解决方案可以修复海洋污染物和局部污染，包括生物修复。生物修复是生物降解污染物的能力。该方法具有若干优点，如可持续性、相对较低的成本，以及它可以应用于不同的生态系统，对环境造成的影响最小。作为额外的优势，内源微生物群的操纵，包括对珊瑚的假定有益微生物（pBMCs），可能对海洋动物具有益生菌效应。在这方面，生物补救和pBMC接种两种方法相结合是大有希望的。这一战略将促进可能对珊瑚和其他微生物有害的特定污染物的降解，同时提高宿主应对污染和其他威胁的抵抗力和复原力。该方法侧重于选择pMMC来降解两种污染物：合成雌激素17a-乙酯醇（EE2）和原油。据报道，这两种动物都对海洋动物（包括珊瑚和人类）产生了负面影响。该协议描述了如何分离和测试能够降解特定污染物的细菌，然后描述如何检测这些相关微生物对其珊瑚宿主的一些假定有益特性。此处描述的方法相对便宜，易于执行，适应性很强。几乎任何类型的可溶性靶化合物都可以代替EE2和油。

根据本文描述的方法，有可能从不同的水源中分离出微生物和具有假定的BMC特性的珊瑚核素，并能够降解不同类别的污染物（图1）。利用从里约热内卢联邦大学环境卫生实验中心（SSA-UFRJ）收集的污水处理厂水样，并根据此处介绍的程序，33种能够降解EE2的细菌菌株最终浓度为5mg/L（图2A）。此外，使用技术选择油降解细菌，20个菌株能够降解oWSF（图2B）和oWIF（图2C）被分离。
在不同条件下从不同珊瑚物种分离的微生物中筛选出假定的BMC特性。其中，对珊瑚病原体Vibrio珊瑚菌产生强烈对抗活性的菌株（图3A），能够降解尿素的菌株（图3B），良好的催化酶生产者（图3） C），发现具有潜在有益基因的微生物（图3D）。
采用这两种方法（即生物补救和BMC接种），可以保护珊瑚免受石油接触的影响。为此，一个从珊瑚Musismiliaharttii分离出来的石油生物重组者pBMC联合体，在珊瑚核素上接种了在三胞胎21中暴露于1%的油。接触石油的处理从第四天开始Fv/Fm逐渐减少，到第十天接近零值。可变荧光/最大荧光（Fv/Fm）提供了对人畜共和酶最大光系统II（PSII）光化学效率的测量，代表对珊瑚健康的间接测量。另一方面，与联合体一起接种的水族馆中的珊瑚核素显示出保存较好的光化学能力（图4）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg"> 图1：生物再子-pBMC联合体选择和组装的主要步骤摘要。污染物降解微生物选择步骤（灰色）和用于联合体微生物选择的最后步骤方案（DNA测序、生长曲线、对抗试验和红色联合体组装）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg"> 图2：污染物降解细菌的选择。（A） 细菌分离物生长在含有EE2的最小介质板上，作为唯一的碳源。（B） 细菌菌落生长在含有oWSF的最小介质板上，作为唯一的碳源。（C） 细菌菌落生长在含有oWIF作为唯一碳源的最小介质板上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg"> 图3：pBMC特性检测。（A） 菌株三联体中的斑点，对珊瑚病原体Vibrio 珊瑚菌（黑色）和控制菌株（绿色）呈对抗活性。（B） 在含有尿素的介质上生长的菌株是唯一的碳源.（C） 产生催化酶 （+） 和坏催化酶生产者应变 （-） 的应变。（D） NIRK基因PCR检测示例（通道1=1kb梯;车道2=空白DNA提取阴性对照;车道3=nirK检测;通道4=PCR反应，无模板DNA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg"> 图4：使用潜水-PAM叶绿素荧光计，在下午5点对M.harttii nubbins进行暗变的Fv/Fm测量。处理控制联合体、石油和石油联合体的Fv/Fm测量每天进行三次测量，为期10天。显示标准偏差。图形的特征在得到之前结果21的许可后进行了修改，在知识共享归因4.0下https://www.nature.com/articles/srep18268提供。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/的完整条款。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Moa</td>
			<td>微生物</td>
			<td>检测技术</td>
			<td>引用</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">气候调节;surfur循环;抗菌化合物;增加对细胞的抗氧化保护。</td>
			<td>阿斯珀吉鲁斯·西多维</td>
			<td>ddDP基因的PCR</td>
			<td>81</td>
		</tr>
<tr>
<td>伪维布里奥 sp. P12</td>
			<td>具有 DMSP 的区域性介质</td>
			<td>82</td>
		</tr>
<tr>
<td>伪阿尔特莫纳斯 sp.</td>
			<td>dmdA基因的PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">病原体的生物调节。</td>
			<td>来自雅典科沃拉棕榈粘液的微生物群落</td>
			<td>清除抑制区</td>
			<td>83</td>
		</tr>
<tr>
<td>珊瑚提取物</td>
			<td>生长抑制测定</td>
			<td>84</td>
		</tr>
<tr>
<td>马里诺杆菌</td>
			<td>加热检测</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>伪阿尔特莫纳斯 sp.</td>
			<td>阿加板交叉条纹</td>
			<td>86</td>
		</tr>
<tr>
<td>伪阿尔特莫纳斯 sp.</td>
			<td>Agar 扩散方法</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">有利于钙化过程;斯克莱金珊瑚的氮源。</td>
			<td>共生体。</td>
			<td>色度法</td>
			<td>87</td>
		</tr>
<tr>
<td>来自斯蒂洛波拉皮斯蒂利亚粘液的微生物群落</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
<tr>
<td>来自雅典卫城阿尔西米纳塔的微生物群落</td>
			<td>博兰等人的方法80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">氮循环;增加氮气固定。</td>
			<td>微生物群落</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>微生物群落</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>微生物群落</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
<tr>
<td>微生物群落</td>
			<td>自适应乙烯 （C2H2） 还原技术</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>伪阿尔托莫纳斯和哈洛蒙纳斯·塔阿南斯</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">氮循环;铵浓度降低。</td>
			<td>伪阿尔特莫纳斯 sp.</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>来自图巴斯特拉亚的微生物群落</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>94</td>
		</tr>
<tr>
<td>西斯图斯庞尼亚睾虫的微生物群落</td>
			<td>预测元基因组分析</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">对活性氧（ROS）的全息保护。</td>
			<td>乌萨尔托莫纳斯，科贝提亚码头和哈洛蒙纳斯塔亚尼西斯</td>
			<td>催化酶测试</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>共生体。</td>
			<td>安普尔克斯红色</td>
			<td>96</td>
		</tr>
<tr>
<td>维布里奥·佩拉吉乌斯和同步巧克力</td>
			<td>马萝卜过氧化物酶-波波汀法</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>维布里奥·菲舍尔</td>
			<td>多种方法</td>
			<td>98</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：检测假定的BMC特性、作用机制（MOA），报告微生物，显示用于检测该特性的潜力和技术。

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Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

污染影响所有生物群系。海洋环境受到的影响特别大，特别是珊瑚礁，这是地球上最敏感的生态系统之一。生物修复是生物降解污染物的能力。在这里，我们描述了分离和测试微生物的方法，这些微生物具有珊瑚的生物修复能力和潜在的益生菌特性。

生物修复和益生菌发育的微生物菌株的勘探，用于生物有机物的研究与保存

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

我们可以分离和组装益生菌，既可促进珊瑚健康，又可减轻污染的影响，并有助于珊瑚礁在不断变化的世界中的持久性。所述的隔离和筛选方法可用于选择具有关键代谢活动的微生物，如污染物的降解或珊瑚等海洋生物的其他有益特征。此方法可用于分离能够降解任何污染物的微生物。此外，其他材料来源可用于其他环境样品，如植物、土壤、水、任何东西。学习文献，并尝试专注于应变，可以是好候选人为你的目的。如果可能，指导这些菌株的分离方法，并避免已知的病原体。如果您打算使用细菌联合体，那么首先调查该财团的成员是否相互对抗活动也非常重要。由于珊瑚面临越来越多的灭绝风险，这种方法开始在全世界展开，需要推广和标准化这种方法。由于一些珊瑚研究人员没有传统微生物学的经验，这就是为什么他们经常就如何继续这种方法征求意见的原因。首先，从每个目标取样点，使用带螺丝帽的无菌瓶收集500毫升的三足水。如果稍后进行样品处理，请将瓶子保持在摄氏四度。使用一对无菌钳子和钳子从水样的同一采样点切割珊瑚碎片。使用20毫升无菌3%盐水溶液或人工海水冲洗珊瑚碎片，以去除海水中松散附着的自由活细菌。使用钳子，将每个珊瑚碎片放入一个无菌容器中，并装有含有无菌盐水溶液的螺丝帽。使用无菌钳子和钳子，在无菌培养皿中称重五克珊瑚碎片，体重秤。将五克珊瑚样品转移到无菌砂浆中，并使用无菌害虫将其进行。使用无菌铲将碎液样品转移到含有 25 毫升 3%氯化钠无菌溶液和 10 至 15 个 2.5 毫米的玻璃珠的无菌培养瓶中。使用 20 毫升无菌盐水溶液将砂浆洗入管中，以回收最大量的麦片。要将微生物从不同的珊瑚舱中分离出来，请将烧瓶在取样点的水温下以150倍g持续搅拌16小时。要选择细菌，首先对珊瑚样品进行长达10至9的阴性盐水溶液的连续稀释，对水样进行10至负6的连续稀释。在丢弃尖端之前，移液器上下稀释五次。然后每个漩涡。每次在进行下一次串行稀释之前，每次对样品进行五秒钟的涡流。每次稀释的培养皿中每稀释100微升，含有3%氯化钠的糖化肉汤或培养基并进行板制。在目标温度下孵育板一至三天，例如摄氏26度。每天检查一次盘子。使用条纹板技术选择并隔离新板上呈现不同生长形态的菌落。根据需要重复此步骤，使纯菌落在盘子上生长。如手稿所述，将分离物存放在摄氏四度或甘油中。要执行 EE2 降解能力测试，请从新鲜板中挑选一个菌落，并在管中接种两毫升无菌 LB 介质。万一是甘油库存，请将10微升甘油细菌库存和条纹带到LB加糖板上。在24至28摄氏度的夜间孵育，使单菌群生长。将含有 LB 介质的管子在 24 至 28 摄氏度的恒定搅拌下以 150 倍 g 为单位。细菌生长后，在室温下以8000倍g离心细胞，在8分钟内对细胞进行造粒。丢弃上一杯。要清洗剩余的LB汤，加入两毫升盐水重新下垂细胞。重复洗涤两次，以确保没有碳源的痕迹。在含有EE2的唯一碳源的最小布什内尔哈斯培养基中接种洗涤和再暂停的细胞。在16至72小时的孵育后，通过光学密度在600纳米和我们在LB agar介质上形成细胞的细菌生长进行评估。为了准备含有油水可溶性馏分和油水不溶性馏分的最小介质作为唯一的碳源，在底部含有阀门的过滤瓶中加入 1-2% 原油至 500 毫升无菌蒸馏水。将烧瓶在 24 至 28 摄氏度的温度下持续搅拌，在 150 次 g 下持续搅拌 48 小时。之后，将烧瓶放在稳定的表面上，等待 10 到 20 分钟，让可溶性和不溶性分数分离。然后打开底部滤瓶，将油水可溶性馏块转移到新的无菌烧瓶中，从而节省油水不溶性馏分。然后准备两瓶布什内尔哈斯阿加最小介质。自动保存它。与油水可溶性馏分相结合，成为制造500毫升加糖介质的唯一碳源。对油水不溶性部分进行同样的处理，将每种介质的约 25 毫升转移到单独的培养皿上。为了分离油降解细菌，将先前稀释的样品和移液器每次稀释的100微升重新用于含有汞培养的培养皿并进行板式处理。请记住，要保持对板的负控制。在目标温度下孵育盘子一至三天，并重复以前一样隔离程序。在该协议中，微生物从不同的水源和珊瑚核素中分离，具有具有BMC的可推型特性，能够降解不同类别的污染物。利用从里约热内卢联邦大学环境卫生实验中心获得的污水处理厂收集的水样，分离出33种能够降解EE2的细菌菌株。此外，利用选油降解菌的技术，分离出20种能够降解油水可溶性分馏和油水不溶性分的菌株。在微生物中筛选了BMC特征，其中发现了对珊瑚病原体霍乱弧菌有很强的对抗活性的菌株、能够降解尿素的菌株、良好的代谢酶生产者以及具有潜在有益基因的微生物。使用生物修复和BMC接种，可以预测珊瑚从石油暴露的影响。一个从珊瑚中分离出的石油生物修复者PBMC联合体在暴露在1%油中的珊瑚核素上接种。与没有接种的珊瑚健康相比，它表现出更好的保鲜光化学能力。不要把样品留在室温下太久。否则，微生物群落可能会发生变化，与疾病相关的微生物可能会过度生长。原油是有毒的。在使用此污染物或您决定使用的其他污染物时，请确保使用适当的个人防护设备。这项技术为珊瑚恢复和海洋生物修复领域开辟了一条创新的道路，有可能用于尽量减少全球变化造成的经济、生态和社会影响。

Research

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