Name: prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Denne forskning blev udført i forbindelse med det igangværende R & D-projekt, der blev registreret som ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP-undersøgelse af potentielle virkninger forårsaget af olie-og gasefterforskning på dybhavs Marine holobionter og udvælgelse af potentielle bioindikatorer og bioremediseringsprocesser for disse økosystemer "(UFRJ/Shell Brasil/ANP) –" PROBIO-DEEP-Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e Gás EM holobiontes Marinhos EM Mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas ", sponsoreret af Shell Brasil under ANP R & D Levy som" Compromisso de investimentos com pesquisa e Desenvolvimento. Forfatterne takker også Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for økonomisk støtte, og til Camila Messias, Phillipe Rosado og Henrique Fragoso dos Santos, for de leverede billeder.

1. vand-og koral opsamling og-opbevaring til mikrobiel isolering
Bemærk: det er vigtigt at tage koordinaterne og temperaturen på prøvetagningsstederne. Hvis det er muligt, kan metadata såsom saltholdighed, pH, dybde og lysintensitet også hjælpe med at finde finjusterede dyrkningsmetoder og fremtidig fortolkning af data. For pålidelige resultater, holde prøverne opbevares i den minimale længde af tid muligt. Vand/koral mikrobiomerne kan ændre sig betydeligt, hvis prøverne ikke holdes på den rigtige temperatur og/eller opbevares i længere perioder. Hvis isolations trinnet ikke udføres straks efter indsamlingen, er det afgørende at vedligeholde prøverne ved 4 °C indtil forarbejdningen. Jo længere prøverne opbevares, selv ved 4 °C, jo mere vil det mikrobielle samfund ændre sig.
<ol><li>Prøve og opbevar havvand.<ol>
<li>Saml 500 mL vandprøver i mindst tre eksemplarer fra hvert målprøvetagnings sted. Brug helst sterile flasker med skruehætter.</li>
		<li>Hvis du behandler vandet øjeblikkeligt efter opsamling, skal du holde flaskerne på RT for et kort interval. Hvis prøve behandlingen sker senere, skal du opbevare flaskerne ved 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prøve og gemme koraller.<ol>
<li>Brug et sterilt par tænger til at skære koralfragmenter fra det samme prøvetagningssted i vandprøverne. For at undgå kontaminering skal du kun røre ved koraller med sterile handsker.</li>
		<li>Skyl den udtagne koral fragment ved hjælp af 20 mL steril saltvandsopløsning (3% NaCl i destilleret vand) eller kunstigt havvand for at slippe af med de løst fast knyttede frie levende bakterier i havvand.</li>
		<li>Ved hjælp af pincet placeres hvert koral fragment i en steril 250-500 mL beholder med en skruelåg, der indeholder steril saltvandsopløsning.</li>
		<li>I laboratoriet, ved brug af sterile tang og tænger, vejes 5 g koralfragmenter ved hjælp af sterile 100 mm x 20 mm Petri skåle på en veje skala.</li>
		<li>Overfør 5 g koral prøven til en steril mørtel og udblødte den ved hjælp af en steril Pestle.</li>
		<li>Ved hjælp af en steril spatel overføres den udblødte prøve til en steril dyrknings kolbe, der indeholder 45 mL 3% NaCl steril opløsning og 10 − 15 glasperler på 5 mm. Brug nogle af 45 mL steril saltvandsopløsning til at vaske mørtel og inddrive den maksimale mængde af macerate.</li>
		<li>Kolberne holdes konstant omrøring (150 x g) i 16 timer ved vandtemperaturen på prøvetagningsstedet. Bemærk: for lavvandede koraller vil den optimale temperatur variere fra 24 − 28 °C. Dette trin vil frigøre mikroorganismer fra forskellige koral rum, såsom dem, der er knyttet til værtscellerne, eller dem, der lever inde i vævet og skelettet. Efter dette trin, koral macerates bør ikke opbevares, og isolations trinnet skal straks udføres.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering af EE2-nedbrydende bakterier fra havvand og/eller koraller
<ol><li>Vælg bakterier. Bemærk: efter trin 1.1.2 og 1.2.7 vil koncentrationen af mikroorganismer i havvand, der er løsrevet fra de forskellige koral macerater, være ukendt og variabel. For at sikre isolering af individuelle mikrobielle kolonier i Petri skåle, der indeholder agar-medier, er det nødvendigt med serielle fortyndinger.<ol>
<li>Udfør serielle fortyndinger op til 10-9 i steril saltvandsopløsning til koral prøver og op til 10-6 for vandprøver. Pipette fortyndinger op og ned 5x, før spidsen kasseres. Vortex prøver for 5 s hver gang, før du udfører den næste serielle fortynding.</li>
		<li>Der afpipetteres 100 μL af hver fortynding på Petri skåle indeholdende 3% NaCl lysogeny bouillon (LB) agar medium, og plade dem. Bemærk: Brug Marine agar (MA) som et alternativt medium. Der kræves tre triplicater af hver fortynding for at sikre pålidelige resultater.</li>
		<li>Pladerne inkubates i 1 − 3 dage ved måltemperaturen (f. eks. 26 °C). Tjek pladerne en gang om dagen.</li>
		<li>Vælg og Isoler kolonierne, som præsenterer markante vækst morfologier på nye plader ved hjælp af streak plade teknikken. Gentag dette trin så mange gange som nødvendigt for at have rene kolonier vokser på pladerne.</li>
		<li>Hvis proceduren ikke straks fortsættes med trin 2.3.1, opbevares isolater ved 4 °C eller i glycerol som beskrevet i punkt 2,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered glycerol bestande. Bemærk: dette trin er valgfrit og kan bruges til langsigtede bakterielle lagre opbevaring.<ol>
<li>Vælg enkelt kolonier fra den friske tallerken eller fra pladerne, der opbevares ved 4 °C, og inokulere dem uafhængigt i 2 mL sterilt LB-medium.</li>
		<li>Placer rørene under konstant agitation (150 x g) ved 24 − 28 °c natten over (on).</li>
		<li>Der tilsættes 1 mL bakteriekulturer fra trin 2.2.2 og steril glycerol til en endelig koncentration på 20% til de 2 mL kryovialer.</li>
		<li>Kryovialerne skal være ved 4 °C.</li>
		<li>Placer glycerolbakteribestanden ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Udfør testen af EE2-nedbrydningsevne.<ol>
<li>Aktiver isolaterne i LB bouillon eller alternative medier. Til dette, vælge en enkelt koloni fra de friske plader eller pladen opbevares ved 4 °C, og inokulere 2 mL steril LB medium. Hvis det er en glycerol bestand, først streak det på LB agar plader og inkubere ved 24 − 28 °C på at have enlige kolonier vokser. Det rør, der indeholder LB-medium, placeres under konstant agitation (150 x g) ved 24 − 28 °c på.</li>
		<li>Efter bakteriel vækst, pellet cellerne ved at centrifuger dem på 8.000 x g for 8 min ved stuetemperatur (RT). Kassér supernatanten og, forsigtigt pipettering op og ned, resuspendere cellerne i samme volumen (2 mL) saltvand for at vaske den resterende LB bouillon.</li>
		<li>Gentag trin 2.3.2 to gange for at sikre, at der ikke er spor af kulstofkilde, og resuspension af cellerne i en tilsvarende mængde saltvandsopløsning. For eksempel, hvis det blev startet med en 2 mL kultur, resuspension cellerne i en endelig volumen af 2 mL saltopløsning.</li>
		<li>Inokulere de vaskede og resuspenderede celler i mindste Bushnell Haas kulturmedium (BH bouillon) indeholdende EE2 som den eneste kulstofkilde59. Bemærk: EE2 opløses i ethanol i en endelig koncentration på 5 mg/L i dyrkningsmediet. Foretag ændringer i forurenende stof type og/eller koncentration, hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Vurdering af bakterievækst ved optisk densitet ved 600 nm og/eller kolonier danner enheder (CFU) på LB agar medium33, for 16 − 72 h inkubation. Bemærk: Alternativt kan mikroorganismerne direkte isoleres på minimum medier, der indeholder EE2, eller andre forbindelser, som den eneste kulstofkilde. Dette skridt ville lede udvælgelsen og undgå uønsket vækst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolering af olie nedbrydende bakterier fra havvand og/eller koraller
<ol><li>Forbered minimum medier, der indeholder en olie vandopløselig fraktion (oWSF) og olie vandopløselig fraktion (oWIF) som den eneste kulstofkilde21.<ol>
<li>Tilsæt 1 − 2% råolie til 500 mL sterilt destilleret vand. Brug en filter kolbe, der er åbnet i bunden, til at tage den opløselige fraktion ud uden at forstyrre det øvre lag af den uopløselige fraktion.</li>
		<li>Blandingen holdes under konstant omrøring ved 24 − 28 °C ved 150 x g for 48 h.</li>
		<li>Filter kolben, der indeholder råoliefraktioner, anbringes på en stabil overflade, og vent 10 − 20 min. for at tillade opløselig og uopløselig fraktion separation.</li>
		<li>OWSF overføres til en ny steril kolbe, hvorved der spares en oWIF ved åbning af den nederste filter kolbe, og den opløselige fraktion tages ud.</li>
		<li>Ved hjælp af alle de oWSF genvundet i det foregående trin (~ 400 mL), forberede 1 L af BH agar minimum medium, der indeholder oWSF som den eneste kulstofkilde.</li>
		<li>Ved hjælp af den oWIF, der er tilbage i kolben fra trin 3.1.4, forberedes 1 L BH agar minimum medium indeholdende oWIF som den eneste kulstofkilde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolerer oWSF-og oWIF-nedbrydende bakterier.<ol>
<li>Ved hjælp af vand og koral udblødte fra trin 1.1.2 og 1.2.7 fortyndes henholdsvis prøverne op til 10-6 i steril saltvandsopløsning som beskrevet i trin 2.1.1.</li>
		<li>Der afpipetteres 100 μL af hver fortynding på Petri skåle, som indeholder BH-oWSF-og BH-oWIF-agar-mediet.</li>
		<li>Gentag de beskrevne procedurer fra trin 2.1.3 til trin 2.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. udvælgelse af konsortiemedlem
<ol><li>Uddrag og sekvens DNA til taksonomisk identifikation.<ol>
<li>Isolaterne, der er fyldt med glycerol, aktiveres som beskrevet i trin 2.3.1.</li>
		<li>Udpak DNA ved hjælp af et DNA-ekstraktions udstyr (Se tabel over materialer).</li>
		<li>Brug primere 27f (5 ′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ′) og 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG Act T-3 ′) til forstærkning af 16S rRNA-genet.</li>
		<li>Udfør 50 μL PCR-reaktioner i henhold til følgende protokol: 5 μL 10x polymerasebuffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm af hver primer, 10 ng af genomisk dna og 2,5 e af Taq-DNA-Polymerase. Tilføj negative kontroller (dvs. blanke DNA-ekstraktioner og PCR-reaktioner uden skabelon-DNA) for at sikre, at der ikke er nogen kontaminering.</li>
		<li>Konfigurer følgende termiske cykel trin: en første Denaturerings cyklus ved 94 °C i 4 minutter; 35 cyklusser ved 94 °C i 1 min, efterfulgt af 50 °C i 1 min, og 72 °C for 2,5 min; en endelig forlængelse cyklus for 10 min ved 72 °C.</li>
		<li>Check amplikonen integritet i 1,2% agopstået gel ved hjælp af 80 V.</li>
		<li>Gel renser prøverne ved hjælp af et gelrensningskit (Se tabel over materialer).</li>
		<li>Kvantificere PCR-produkter ved hjælp af et fluorometer.</li>
		<li>Send produkt til sekvensering. Bemærk: for bedre takoniske klassifikationer anbefales sanger metoden60, fordi den giver lange sekvenser. Universal primere 27f og 1492r kan bruges til at forstærke næsten hele længden af 16S rRNA-genet61. Hvis contigs ikke kan samles med et par primere, skal der tages hensyn til et ekstra par i midten af sekvensen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestemme vækstkurven.<ol>
<li>Isolaterne aktiveres i glycerol bestande fra trin 2.2.5 som beskrevet i trin 2.3.1, men med 5 mL i stedet for 2 mL.</li>
		<li>Der tilsættes 1% (v/v) af den dyrkede 5 mL kultur fra trin 4.2.1 i triplicater til en 250 mL kolbe indeholdende 100 mL 3% LB-medier. Sørg for at forberede triplicater af en negativ kontrol (ingen inoculum) samt.</li>
		<li>Kolberne placeres i en inkubator under konstant agitation (150 x g) ved 24 − 28 °c.</li>
		<li>Tag 1 ml aliquoter hver 4 h for 48 h. Hvis stammerne frembyder en høj vækstrate, falde 4 h interval.</li>
		<li>Måling af den optiske densitet (OD) estimering ved 600 nm bølgelængde og kolonidannende enheder (CFU) tælles fra serielle fortyndinger belagt på Rich Media plader (100 μL skal inokuleres i hver plade og normaliseret til volumen på 1 mL).</li>
		<li>Plot OD og CFU kurver og analysere korrelationen mellem OD/CFU af hver enkelt stamme. Fra nu af beregner du antallet af celler baseret på OD-værdierne.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør antagonisme test.<ol>
<li>Isolaterne aktiveres som beskrevet i trin 2.3.1.</li>
		<li>Inokulere en stamme ad gangen langs midten af plader, der indeholder agar medier og de andre dem vinkelret på den centrale. Gentag, indtil alle udvalgte mikrobielle belastninger testes mod alle andre.</li>
		<li>Pladerne inkubates ved 24 − 28 °C og overvåges dagligt for at observere potentielle haloer, der indikerer antagonistisk aktivitet. Hvis der observeres haloer, som indikerer antagonistisk aktivitet mellem to stammer, bør en af dem udelukkes.</li>
	</ol></li>
	<li>Udføre konsortie samling.<ol>
<li>Isolaterne aktiveres som beskrevet i trin 2.3.1.</li>
		<li>Pellet cellerne på 3.500 x g og vask dem forsigtigt 2x i en tilsvarende mængde saltopløsning. Cellerne opslæmmes i samme volumen (dvs. Hvis den endelige volumen var 2 mL celler, vaskes de med 2 mL saltvandsopløsning og resuspenderes dem i et endeligt volumen på 2 mL).</li>
		<li>Inokulere 1 mL kultur i 100 mL 3% NaCl LB medium og inkubaton ved 150 x g.
</li>
		<li>Gentag trin 4.5.2, inokulere 100 mL dyrket, vasket, og resuspenderet kulturer i 10 L kulturer. Inkuber i sterile luft-Lift bioreaktorer, modtager filtreret luft fra en pumpe. Hvis der er behov for mere kultur, skal du altid inokulere 1% af den dyrkede kultur i friske medier.</li>
		<li>Centrifuge dyrkede kulturer ved 8.000 x g i 8 min ved 4 °c. Supernatanten kasseres efter centrifugering.</li>
		<li>Du vasker pellet, forsigtigt tilbage suspension cellerne i 500 mL steril saltvandsopløsning.</li>
		<li>Gentag trin 4.5.5 og 4.5.6.</li>
		<li>Resuspension hver enkelt kultur i 100 mL saltopløsning og måle OD at estimere antallet af celler.</li>
		<li>Beregn mængden af hver kultur, der er nødvendig for at nå en endelig koncentration på 107 celler ml-1.</li>
		<li>Udfør CFU-optællinger på Rich Media for en endelig bekræftelse af cellernes levedygtighed og koncentration.</li>
		<li>Bland en tilsvarende mængde af hver enkelt kultur i sterile kolber og alikvot konsortiet til 50 mL sterile rør.</li>
		<li>Opbevares ved 4 °C indtil inokulation. Bemærk: Forbered konsortie forsamlingen så frisk som muligt for at sikre cellerne vil stadig være levedygtige. Alternativt kan CFU-optællinger udføres før inokulering. For at samle et ideelt konsortium er det nødvendigt at anvende isolater, der præsenterer forskellige og komplementære metaboliske kapaciteter. Normalt anvendes 6 − 10 isolater til dannelse af konsortier, men dette antal vil variere afhængigt af medlemmernes karakteristika og formål.</li>
	</ol></li>
</ol>5. påvisning af formodede gavnlige egenskaber for koraller
<ol><li>Isolaterne skal aktiveres fra glycerolbestandene ved at føre dem på LB-agarplader og inkube dem ved 24 − 28 °C, så de enkelte kolonier vokser. Vælg en enkelt koloni fra pladerne og inokulere det i 2 mL steril LB medium. Anbring rør, der indeholder LB-medium, med konstant agitation (150 x g) ved 24 − 28 °c på.</li>
	<li>Udføre DNA-ekstraktion som beskrevet i afsnit 4,1 til påvisning af potentielt gavnlige gener ved PCR. Bemærk: PCR-reaktionsbetingelser og primere vil afhænge af det målrettede gen. Metoder til test af BMC-karakteristika for individuelle stammer og PCR-detektion for potentielt gavnlige gener er beskrevet i tabel 1.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Bioremediation tilgange er blevet massivt udforsket i løbet af de sidste 50 år. For eksempel er over 200 mikrober blandt bakterier, cyanobakterier, mikroalger og svampe i flere forskellige habitater blevet udpeget som i stand til at angive tilstedeværelsen og/eller forringe olie carbonhydrider62,63,64 . Desuden er andre klasser af forbindelser, der forårsager virkninger for miljøet og for mennesker, såsom plast, Bisphenol a A, endokrine disruptorer, og tungmetaller, mål for bioremediering teknik udvikling65,66, 67. På den anden side, marine probiotiske udvikling har været begrænset til de områder, der har en indlysende indvirkning på økonomien, såsom fisk probiotika i akvakultur68,69. Men, isolering og karakterisering af gavnlige mikroorganismer til at beskytte koralrev, marine økosystemer, der støtter fiskeri, turisme, og andre rentable aktiviteter, er begyndt at blive værdsat15. Her, en billig, nem og tilgængelig protokol til at vælge forurenende nedbrydende mikroorganismer, der også kan præsentere potentielt gavnlige egenskaber for lokale marine økosystemer, især formodede gavnlige mikroorganismer til koraller (pBMCs), er Beskrevet.
Desuden er den metode, der påvises her, meget tilpasningsdygtig til flere forbindelser og forskellige typer af mikrobielle kilder. Det er muligt at målrette mod forskellige forurenende stoffer ved at erstatte den eneste kulstofkilde, der er føjet til minimums mediet. Til dette, i stedet for olie eller EE2, andre forbindelser bør tilsættes i den ønskede koncentration. Dette ville være det selektive pres for at isolere nedbrydere for de målrettede forurenende stoffer. F. eks. er mikroorganismer, som kan forringe andre klasser af hormonforstyrrende stoffer, allerede blevet udvalgt og afprøvet med samme metode70. Desuden kan andre marine og terrestriske organismer, såsom svampe og planter71,72, samt forskellige typer af miljøprøver, såsom jord, brændsel og klipper, anvendes som de nedværdigende-mikrobielle kilder25, 73af74. For eksempel var det muligt at detektere og isolere kulbrinte nedbrydende bakterier fra forskellige jord-og sedimentprøver25,54,63,64,75. Endelig, udføre mindre ændringer i medierne, kan mikroorganismer end bakterier let vælges som de nedværdigende-mikrober. For eksempel, en mikroalger stamme med evnen til effektivt nedbryde østrogen forbindelser er blevet rapporteret76.
Ideelt, bioremediation-probiotiske konsortier skal samles for hver specifik forbindelse eller område. Mikrober, der vokser i et bestemt miljø, kan ikke vokse så godt i nye steder i forhold til deres indfødte forhold. Da forskerne ikke har fundet et produkt, der kan anvendes effektivt under alle de forskellige miljøforhold, bør der gennemføres en ny konsortie forsamling for hver specifik situation. Dette ville være beslægtet med personlig medicin til miljø-skræddersyet opsving. Derfor er oprettelsen af en centralbank af mikrobielle stammer med potentielle probiotiske egenskaber og nedbrydnings kapacitet et afgørende skridt for fremskridtene på dette område. Dette initiativ vil spare tid og arbejde og bidrage til forsamlingen af nye specifikke konsortier på verdensplan.
Mikroorganismer, der er forbundet med koraller (dvs. mikroalger, bakterier, archaea, svampe og vira) har en kompleks og indviklet rolle i opretholdelsen af værts homøostase19. Miljømæssige stressorer, såsom forurening, kan også destabilisere koral mikrobiomet, hvilket resulterer i dysbiosis, som kan forårsage sygdom og dødelighed30. De mekanismer, hvormed koral mikrobiomet kan støtte koral sundhed er begyndt at blive afsløret. Disse mekanismer er nøglen til at forstå koral resistens og modstandsdygtighed over for miljømæssige stressorer og dermed til at fremme Reef vedholdenhed og bevaring. Desuden vil resultaterne på området bidrage til at forstå generelle vært-mikrobiom interaktioner, som kan bidrage til udviklingen af bedre probiotika og sundhedsfremmende strategier på andre områder. Det er også vigtigt at bedre undersøge, hvordan disse probiotika inokulationer kan forstyrre meta organismens helbred under stress begivenheder. For eksempel, arbejde viser, at augmentation i koral præstation skyldes probiotika og ikke blot koral ved hjælp af bakterier som en fødekilde er stadig behov.
Parallelt hermed er udviklingen af nye partnerskabstilgange og forbedringen af de eksisterende konsortier af stor betydning. Alternative metoder til konsortie immobilisering samt innovative tilgange, såsom inokulerende koral føde (dvs., artemia og rotifers) og bruge dem som vektorer, er lovende. Disse leveringssystemer kan også ændres til at målrette andre marine organismer og vil være afgørende for succesen af marine probiotika felt.
Forureningsbekæmpelse og Coral Reef vedholdenhed er i øjeblikket to af de vigtigste emner, der er fremhævet i miljøkonferencer regelmæssigt. Agenda 2030, et dokument offentliggjort af de Forenede Nationer, der beskriver de globale mål, som samfundet skal nå for at muliggøre en bæredygtig fremtid, afsætter specifikke mål for hvert spørgsmål. Mens mål 6 fremhæver vigtigheden af forbedring af vandkvaliteten ved at reducere forureningen, styrker mål 14 relevansen af bevaring og bæredygtig udnyttelse af havene, havene og havets ressourcer77. I denne forbindelse afhænger koralrevets bevaring af ændringer, der bør opnås i den nærmeste fremtid, herunder forurenings afbødning. Dette er af stor betydning, fordi de fleste massive koral tab opstod, da andre faktorer blev føjet til klimabegivenheder, såsom lokale habitat ødelæggelse og forurening78,79. Dette papir viste, at det er muligt at kombinere bioremediering og PBMC inokulation at nedbryde specifikke forurenende stoffer, mens det kan øge koral modstand og modstandsdygtighed over for forurenende stoffer og andre spørgsmål. Optimering af eksisterende protokoller og/eller udvikling af innovative metoder, kombineret eller selvstændigt anvendt, vil være afgørende for at bestemme fremtiden for marine økosystemer.

Forurening er et vigtigt spørgsmål, der berører menneskers, dyrs og plan ternes sundhed Selv om forurening kan være naturlige, såsom vulkanaske1, menneskelige aktiviteter er den primære årsag til de fleste forurening. Antropogene aktiviteter forurener jord, vand og luft, som direkte eller indirekte fører til næsten 20.000.000 for tidlige menneskelige dødsfald2 og decimerer milliarder af andre former for liv årligt. Forurenende stoffer er til stede selv i de mest fjerntliggende områder af planeten. For eksempel er tungmetaller og persistente organiske forbindelser blevet påvist i dybvands hvirvelløse dyr og polære pattedyr, henholdsvis3,4.
Havmiljøer er især blevet påvirket af forurening. I lang tid, det blev antaget, at havet ville forblive upåvirket og levere en endeløs kilde af varer på grund af sin massive mængde vand5. Af denne grund, alle typer af industri og institutioner frit frigivet affald i vandområder i århundreder6,7. Flere forurenende stoffer af alle typer, såsom plast8, syntetiske hormoner9, pesticider10, olie11, næringsstoffer12, tungmetaller3, og radioaktivt affald13 er blevet rapporteret som påvirker havets økosystemer. I denne sammenhæng er koralrev blandt de vigtigste og mest følsomme økosystemer i havmiljøet14. Rev er kyst beskyttere, afgørende for udviklingen af tusindvis af marine arter ved at spille væsentlige roller i næringsstoffer cykling og klimakontrol. Rev også bidrage til økonomien ved at levere fisk, varer og turisme, blandt andre15. For eksempel, 4.500.000.000 mennesker er afhængige af havets fisk som deres vigtigste fødekilde16, som er stærkt støttet af koralrev.
Uanset deres økologiske, sociale og økonomiske betydning, er koralrev bliver decimeret17,18. Menneskeskabte aktiviteter er primært ansvarlige for at bidrage til de tre vigtigste årsager til koraller død: klimaændringer, overfiskning, og vandforurening19. Selv om det er vigtigt at arbejde på afbødning af den globale opvarmning, er det også vigtigt at arbejde på at minimere lokal forurening, herunder vandforurening, der kan kritisk bidrage til koral tilbagegang20. Derfor er der et presserende behov for udvikling af strategier til at øge koraller ' levetid, som kunne give dem ekstra tid til at tilpasse sig og overleve.
I denne forbindelse er det yderst vigtigt at finde løsninger, der minimerer forureningen og udvikler strategier til at øge korals egnethed. Strategier til afhjælpning af forurenende stoffer i havene er meget forskellige og kan inddeles i fysiske, kemiske og biologiske tilgange. Fysiske tilgange er nyttige. Men de er ikke altid effektive. For eksempel kan plastaffald minimeres ved fysisk fjernelse, mens vandopløselige forbindelser har brug for andre metoder, der skal elimineres. Eksempler på sådanne forbindelser er råolie, frigivet af olieindustrien aktiviteter og udslip, samt andre mikroforurenende stoffer, såsom syntetiske hormoner, der normalt anvendes som den østrogene komponent i orale præventionsmidler og til stede i spildevand21, 22. brugen af kemiske stoffer til at mindske forureningen kan løse et specifikt problem, men det kan også udgøre en ekstra forureningskilde. Dette er tilfældet med kemiske dispergeringsmidler til at afbøde olieforurening, som er blevet beskrevet som endnu mere giftige for marine økosystemer end selve olieforureningen23. Af disse grunde, biologiske tilgange præsentere flere fordele i forhold til de andre metoder. Bioremediation er kapaciteten af levende organismer, eller deres metaboliske produkter, at omdanne forurenende stoffer til mindre giftige eller ikke-giftige former24. De vigtigste fordele ved at bruge biologiske metoder er bæredygtighed, relative lave omkostninger, det faktum, at de er miljøvenlige, og at de kan anvendes i forskellige økosystemer, der forårsager minimal eller færre indvirkninger på miljøet21, 25,26,27.
Desuden giver manipulation af det mikrobielle samfund i et miljø mulighed for en ekstra potentiel fordel. Der er mikrobiomer, der er forbundet med værter og er afgørende for deres helbred. Det er velkendt, at disse tilknyttede symbiotiske mikrobiomer er nødvendige for at opretholde værts homøostase19. Manipulation af disse associerede mikroorganismer er blevet godt udforsket for værter som planter og pattedyr28,29, men brugen af koral probiotika er stadig roman15. Koraller også vært, interagere med, og afhænger af store og specifikke populationer af mikroorganismer til at overleve19. Disse mikrobielle samfunds rolle i den sundhedsmæssige og dysbiosis af koraller er under aktiv undersøgelse, men det er stadig langt fra fuldt forstået30. En af de mest populære hypoteser kaldes koral probiotiske hypotese. Det foreslås, at der findes et dynamisk forhold mellem symbiotiske mikroorganismer og miljøforhold, som medfører udvælgelse af de mest fordelagtige koral metasteismer31. Baseret på disse oplysninger, centrale potentielle probiotiske mekanismer, samt strategier for isolation, manipulation, og levering af gavnlige mikroorganismer til koraller (BMCs) til flere formål, blev foreslået32 og testet33. Disse potentielle gavnlige egenskaber omfatter modstandsdygtighed over for temperaturstigning, beskyttelse mod reaktive oxygenarter (ROS), Kvælstoffiksering, modstandsdygtighed over for forurenende stoffer og biologisk bekæmpelse af patogener, blandt andre32.
Denne undersøgelse fokuserer på udvælgelsen af BMCs og frie levende mikroorganismer, som præsenterer evnen til at nedbryde to forurenende stoffer, som almindeligvis findes i Marine miljøer: syntetisk østrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) og råolie. Forurenende stoffer indeholdende hormon aktive stoffer er ofte til stede i vandområder34,35,36,37,38,39,40, 41af42. Blandt dem, syntetisk østrogene endokrine-disruptor forbindelser (Edc'er) efterligner virkningen af østrogener på målceller, forårsager flere virkninger på dyr, herunder brystkræft, barnløshed, og hermaphroditisme9. EE2 udskilles af mennesker på grund af brugen af orale præventionsmidler. Det fjernes ikke fra spildevand fra traditionelle spildevandsrensningsanlæg og har negative virkninger selv ved meget lave koncentrationer (f. eks. ng/l eller μg/l)43,44,45. Lidt er kendt om virkningerne af østrogener på koral fysiologi46,47. På andre hvirvelløse vanddyr, såsom svampe, krebsdyr og bløddyr, blev østrogener dog rapporteret at forårsage flere negative virkninger, der hovedsagelig vedrørte reproduktion, såsom udvikling og/eller stimulering af kønsceller, ændring i enzymatiske og protein handlinger, problemer i embryonale processer, og andre48,49,50,51,52. De negative konsekvenser forårsaget af EE2 forurening understreger nødvendigheden af at udvikle bæredygtige tilgange til at fjerne denne forbindelse fra miljøet uden at påvirke det marine liv.
Parallelt med olie, der i øjeblikket tegner sig for næsten 40% af verdens forbrugte energikilder53, forekommer kronisk kontaminering og olieudslip ofte i nærheden af Reef Areas11. Olieforurening blev rapporteret at forårsage negative virkninger i flere arter af marine dyr, fugle, planter, og mennesker54,55,56,57. På koraller, det forårsager blegning, reducerer modstanden af larver til termisk stress58, forstyrrer de mikrobielle associerede samfund21, og forårsager vævsnekrose. Hertil kommer, kemiske dispergeringsmidler, en olie oprydning teknik almindeligt anvendt af olieselskaber til at afhjælpe spild, er endnu mere giftige for koraller end selve olien23. Gavnlige mikroorganismer isoleret fra koraller, i modsætning, er kendt for at spille afgørende roller på vært sundhed. Men, manipulation af disse potentielle probiotika skal være bedre udforsket for at undersøge mulige negative bivirkninger og de metaboliske kapaciteter, der kan screenes for at forbedre egnetheden af meta organismen. I denne sammenhæng, egenskaber såsom antimikrobiel aktivitet mod koral patogener, produktion af katalase til bekæmpelse af oxidativt stress, evnen til at nedbryde urinstof (som kan have vigtige roller i forkalkning proces), og tilstedeværelsen af gener at give potentielle gavnlige egenskaber, blandt andre, skal være i fokus i undersøgelsen. Her viser vi hvordan bioremediering og probiotika kan bruges til samtidig afbøde virkningerne af forurening og forbedre koral sundhed. Udviklingen af innovative tilgange, der kan anvendes som interventioner for at øge den marine Arts vedholdenhed, udgør et skridt i retning af en mere bæredygtig og sundere Planet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 mL PYREX Media Storage Bottle</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1743E20/1395-500</td>
			<td>Used to sample water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Aspirator Bottles</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1234B28/1220-2X</td>
			<td>Used to separate the oil fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-inch wire cutter plier</td>
			<td>thomas scientific/Restek</td>
			<td>1173Y64/23033</td>
			<td>Used to cut coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17a-Ethinylestradiol</td>
			<td>LGC Standards</td>
			<td>DRE-C13245100</td>
			<td>Used as the only carbon source to make the selective media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PCT0901-1KG</td>
			<td>Used to make solid media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell Haas Broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M350-500G</td>
			<td>Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td>
			<td>4882H35/26500-125</td>
			<td>Used to incubate coral macerate with glass beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28903470</td>
			<td>Used to purify PCR products before sending them for sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1177Q81/07DP1070</td>
			<td>Used to detach the microorganisms from coral structures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Needed to work at sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245-1KG</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M384-500G</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital-Shaker Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate liquid media and oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar and Pestle</td>
			<td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td>
			<td>1201U69/JMD150</td>
			<td>Used to macerate coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to centrifuge bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to measure optical density of bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Used for microbial strains DNA extraction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation

Forurening påvirker alle biomer. Marine miljøer har været særligt påvirket, især koralrev, et af de mest følsomme økosystemer på jorden. Globalt set er 4.500.000.000 mennesker økonomisk afhængige af havet, hvor de fleste af deres levebrød leveres af koralrev. Koraller er af stor betydning, og derfor deres udryddelse fører til katastrofale konsekvenser. Der er flere mulige løsninger til afhjælpning af havforurening og lokal forurening, herunder bioremedisering. Bioremediation er kapaciteten af organismer til at nedbryde forurenende stoffer. Tilgangen giver flere fordele, såsom bæredygtighed, relativt lave omkostninger og den kendsgerning, at den kan anvendes i forskellige økosystemer, hvilket medfører minimal påvirkning af miljøet. Som en ekstra fordel, manipulation af endogene mikrobiomer, herunder formodede gavnlige mikroorganismer for koraller (pBMCs), kan have probiotiske virkninger for marine dyr. I denne sammenhæng kan brugen af de to tilgange, bioremediering og PBMC inokulation kombineret, være lovende. Denne strategi vil fremme nedbrydningen af specifikke forurenende stoffer, der kan være skadelige for koraller og andre meta organismer og samtidig øge værts modstanden og modstandsdygtighed over for forurening og andre trusler. Denne metode fokuserer på udvælgelsen af pBMCs til at nedbryde to forurenende stoffer: syntetisk østrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) og råolie. Begge er blevet rapporteret at negativt påvirke Marine dyr, herunder koraller, og mennesker. Protokollen beskriver, hvordan man isolerer og tester bakterier, der kan forringe de specifikke forurenende stoffer, efterfulgt af en beskrivelse af, hvordan man opdager nogle formodede gavnlige egenskaber ved disse tilknyttede mikrober til deres koral vært. De metoder, der er beskrevet her, er relativt billige, nemme at udføre og meget tilpasningsdygtige. Næsten enhver form for opløselige Target sammensatte kan anvendes i stedet for EE2 og olie.

Baseret på de metoder, der er beskrevet her, var det muligt at isolere mikroorganismer fra forskellige vandkilder og koral Nubbins med formodede BMC-egenskaber og i stand til at nedbryde forskellige klasser af forurenende stoffer (figur 1). Ved hjælp af vandprøver indsamlet på et rensningsanlæg, der er fremstillet af CESA-UFRJ (eksperimentel Center for miljømæssig sanitet på Federal University of Rio de Janeiro), og baseret på den procedure, der præsenteres her, 33 bakteriestammer i stand til at nedbryde EE2 på en endelig koncentration på 5mg/L blev isoleret (figur 2A). Desuden, ved hjælp af teknikken til udvælgelse af olie-nedværdigende bakterier, 20 stammer i stand til at forringe både owsf (figur 2B) og owif (figur 2C) blev isoleret.
Formodede BMC egenskaber blev screenet i mikroorganismer isoleret fra forskellige koralarter under forskellige forhold. Blandt dem, en stamme, der præsenterer stærk antagonistisk aktivitet mod koral patogenet Vibrio coralliilyticus (figur 3a), stammer i stand til at nedbryde urinstof (figur 3B), en god katalase producent (figur 3 C), og mikroorganismer, der præsenterer potentielt gavnlige gener (figur 3D), blev fundet.
Anvendelse af de to tilgange kombineret (dvs. bioremediering og BMC inokulation), det var muligt at beskytte koraller fra olie eksponering påvirkninger. Til dette, en olie bioremediator pBMC konsortium, isoleret fra koral Mussismilia harttii, blev inokuleret på koral Nubbins udsat for 1% olie i triplicates21. De behandlinger, der udsættes for olie, viste et progressivt fald i FV/FM fra den fjerde dag og fremefter og nåede værdier tæt på nul ved den tiende dag. Variabel fluorescens/maksimal fluorescens (FV/FM) gav et mål af maksimal photosystem II (PSII) fotokemisk effektivitet af zooxanthellae, der repræsenterer en indirekte måling af koral sundhed. På den anden side viste koral Nubbins i de akvarier, der blev inokuleret med konsortiet, en bedre bevaret fotokemisk evne (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg"> Figur 1: Resumé af de vigtigste trin i en bioremediator-pBMC Consortium udvælgelse og montage. Ordning for forurenings nedbrydende mikroorganismer valg trin (i gråt) og sidste trin, der anvendes til konsortiets mikrobielle udvælgelse (DNA-sekvensering, vækstkurve, antagonisme test og konsortie samling i rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg"> Figur 2: udvælgelse af forurenende nedbrydende bakterier. A) bakterie isolater, der vokser på mindste medie plader indeholdende EE2 som den eneste kulstofkilde. B) bakteriekolonier, der vokser på mindste medie plader, som indeholder owsf som den eneste kulstofkilde. C) bakteriekolonier, der vokser på mindste medie plader indeholdende owif som den eneste kulstofkilde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg"> Figur 3: påvisning af pBMC-karakteristika. A) pletter i triplicater af stamme, der præsenterer antagonistisk aktivitet mod koral patogenet Vibrio coralliilyticus (i sort) og en kontrol stamme (i grøn). B) stammer, der vokser på medier, som indeholder urinstof, som den eneste kulstofkilde. C) stamme, der producerer katalase (+) og en dårlig katalase producent stamme (-). D) eksempel på PCR-detektion af nirk-genet (Lane 1 = 1kb stigen; Lane 2 = blank DNA-ekstraktion negativ kontrol; Lane 3 = nirk Detection; Lane 4 = PCR-reaktioner uden skabelon-DNA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg"> Figur 4: FV/FM målinger af M. harttii Nubbins Dark-tilpasset ved 5 PM, ved hjælp af en dykning-Pam klorofyl fluorometer. FV/FM målinger af behandlinger kontrol konsortium, olie, og olie med konsortiet blev udført i tre eksemplarer hver dag i 10 dage. Standard afvigelsen vises. Funktionerne i grafen blev ændret med tilladelse fra tidligere resultater21, tilgængelige på https://www.Nature.com/articles/srep18268 under en Creative Commons Attribution 4,0. Fulde vilkår på http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Moa</td>
			<td>Mikroorganisme</td>
			<td>Detekterings teknik</td>
			<td>Referencer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Klimaregulering; surfur cykling; antimikrobielle forbindelser; øge antioxidant beskyttelse af celler.</td>
			<td>Aspergillus sydowii</td>
			<td>PCR til dddP-genet</td>
			<td>81</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudovibrio Sp. p12</td>
			<td>Kulturmedium med DMSP</td>
			<td>82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>PCR for dmdA-gen</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Biologisk regulering af patogener.</td>
			<td>Mikrobiome fra Acropora palmata slim</td>
			<td>Klar zone af hæmning</td>
			<td>83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uddrag af koraller</td>
			<td>Væksthæmning analyse</td>
			<td>84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Marinobacter Sp.</td>
			<td>Sværmede assays</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Agar plade Cross-streaking</td>
			<td>86</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Agar-diffusions metode</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Gavn for forkalknings processen; nitrogen kilde for skleraktiniske koraller.</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Kolorimetrisk metode</td>
			<td>87</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiome fra stylophora-pisken-slim</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiome fra Acropora alciminata</td>
			<td>Metode ved bold land et al. 80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Kvælstof cyklus; øge Kvælstoffiksering.</td>
			<td>Mikrobielle samfund</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobielle samfund</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobielle samfund</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobielle samfund</td>
			<td>Tilpasset acetylen (C2H2) reduktionsteknik</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp. og Halomonas taeanensis</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Kvælstof cyklus; fald i ammonium koncentrationen.</td>
			<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiome fra tubastraea Ildtorn</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>94</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiome fra Xestospongia testudinaria</td>
			<td>Prædiktiv metagenome-analyse</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Holobiont beskyttelse mod reaktive oxygenarter (ROS).</td>
			<td>Pseudoalteromonas Sp., Cobetia Marina og Halomonas taeanensis</td>
			<td>Catalase test</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>96</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio Pelagius og Sync-chococcus Sp.</td>
			<td>Peberrod-peroxidase-scopoletin-metode</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio Stormhat</td>
			<td>Flere metoder</td>
			<td>98</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: påvisning af formodede BMC-karakteristika, virkningsmekanisme (MOA), rapporterede mikroorganismer, der præsenterer potentialet og teknikken til påvisning af karakteristikaene.

Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Forurening påvirker alle biomer. Marine miljøer har været særligt påvirket, især koralrev, et af de mest følsomme økosystemer på jorden. Bioremediation er kapaciteten af organismer til at nedbryde forurenende stoffer. Her beskriver vi metoder til at isolere og teste mikrober præsenterer bioremediering evne og potentielle probiotiske egenskaber for koraller.

Prospektering mikrobielle stammer for bioremediation og probiotika udvikling for meta organ forskning og konservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Vi kan isolere og samle probiotika, der både kan fremme koraller sundhed og samtidig afbøde virkningerne af forurening, og som kan bidrage til et rev's vedholdenhed i den foranderlige verden. Den beskrevne isolations- og screeningsmetode kan bruges til at udvælge mikroorganismer, der præsenterer vigtige metaboliske aktiviteter såsom nedbrydning af forurenende stoffer eller andre gavnlige egenskaber for marine organismer såsom koraller. Denne metode kan anvendes til at isolere mikroorganismer i stand til at nedbryde eventuelle forurenende stoffer.Og derudover kan andre kilder til materiale anvendes i de andre miljøprøver såsom planter, jord, vand, hvad som helst. Studium litteraturen og prøv at fokusere på stammer, der kan være gode kandidater til dit formål. Hvis det er muligt, direkte isolation metoder for disse stammer og undgå kendte patogener.Og hvis du sigter mod at bruge et konsortium af bakterier, er det også meget vigtigt først at undersøge, om medlemmerne af konsortiet har antagonistisk aktivitet mod hinanden. Fordi koraller er under stigende risiko for udryddelse, er denne metode begyndt at blive startet på verdensplan, og der er behov for at sprede og standardisere metoden. Som nogle koraller forskere har ingen erfaring med konventionel mikrobiologi, det er derfor, de har været ofte beder om råd om, hvordan man kommer videre med en sådan tilgang.Til at begynde, fra hvert målrettet prøvetagningssted, bruge sterile flasker med skruelåg til at indsamle 500 milliliter vand i tre eksemplarer. Hvis prøve forarbejdning sker senere, holde flaskerne på fire grader Celsius. Brug en steril tang og tang til at skære koralfragmenter fra det samme prøvetagningssted for vandprøverne.Skyl prøven koral fragment ved hjælp af 20 milliliter sterile 3% saltvand opløsning eller kunstig havvand for at slippe af med løst fastgjorte fritlevende bakterier i havvandet. Brug scelink, placere hver koral fragment i en steril beholder med en skrue hætte, der indeholder sterile saltvand opløsning. Brug sterile tang og tænger, vejer fem gram koral fragmenter i sterile petriskåle på en vægtskala.Overfør de fem gram koral prøve til en steril mørtel og macerate det ved hjælp af en steril støder. Ved hjælp af en steril spatel overføres den udbblommede prøve til en steril kuldekolbe indeholdende 25 milliliter 3% natriumchloridsterilest opløsning og 10 til 15 glasperler på 2,5 millimeter. Brug 20 milliliter sterilt saltvandsopløsning til at vaske mørtelen ind i røret for at genvinde den maksimale mængde af maceratet.For at frigøre mikroorganismer fra forskellige koralrum skal kolberne være under konstant omrøring ved 150 gange g i 16 timer ved prøveudtagningsstedets vandtemperatur. For at vælge bakterier, først udføre serielle fortyndinger op til 10 til de negative ni i steril saltvand opløsning til koraller prøver og op til 10 til de negative seks for vandprøver. Pipettefortyndinger op og ned fem gange, før spidsen kasseres.Så vortex hver enkelt. Vortex prøverne i fem sekunder hver gang, før du udfører den næste serielle fortynding. Pipette 100 mikroliter af hver fortynding på petriskåle, der indeholder 3% natriumchlorid lysogen bouillon agar medium og plade dem.Inkuber pladerne i en til tre dage ved måltemperaturen, for eksempel 26 grader Celsius. Tjek pladerne en gang om dagen. Vælg og isoler kolonierne, der præsenterer forskellige vækstmorfologier på nye plader ved hjælp af streak pladeteknikken.Gentag dette trin så mange gange som nødvendigt for at have rene kolonier vokser på pladerne. Opbevar isolaterne ved fire grader Celsius eller i glycerol som beskrevet i manuskriptet. For at udføre EE2 nedbrydningsevne test, vælge en enkelt koloni fra de friske plader og inokulere i to milliliter sterile LB medium i et rør.Hvis det er en glycerol bestand, tage 10 mikroliter af glycerol bakterielager og streak på LB agar plader. Inkubere ved 24 til 28 grader Celsius natten over for at have enkelte kolonier vokser. Rør, der indeholder LB-medium, skal sættes under konstant omrøring ved 150 gange g ved 24 til 28 grader Celsius natten over.Efter bakterievækst pellets cellerne ved at centrifugere dem ved 8.000 gange g i otte minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten. For at vaske den resterende LB bouillon, tilsæt to milliliter saltvand til resuspend cellerne.Gentag vask to gange for at sikre, at der ikke er spor af kulstofkilde. Inokuler de vaskede og resuspenderede celler i minimum Bushnell Haas kultur medium, der indeholder EE2 som den eneste kulstofkilde. Vurdere bakterievækst ved optisk tæthed ved 600 nanometer og vores koloni danner enheder på LB agar medium efter 16 til 72 timers inkubation.For at forberede minimummedier, der indeholder en olievandsopløselig fraktion og en uopløselig oliefraktion som den eneste kulstofkilde, tilsættes 1-2 % råolie til 500 milliliter sterilt destilleret vand i en filterkolbe, der indeholder en ventil i bunden. Kolben opbevares konstant ved 24 til 28 grader Celsius ved 150 gange g i 48 timer. Derefter anbringes kolben på en stabil overflade, og der skal ventes 10-20 minutter, så den opløselige og uopløselige fraktion kan skilles ad.Åbn derefter bundfilterkolben for at overføre olievandsopløserlig fraktion til en ny steril kolbe, der sparer olievandet uopløselig fraktion. Derefter forberede to flasker Bushnell Haas agar minimum medium. Autoklave det.Kombiner med olie-vandopløselige fraktion som den eneste kulstofkilde til at gøre 500 milliliter agar medium. Gør det samme med olievandet uopløselige fraktion og overføre ca 25 milliliter af hvert medium på individuelle petriskåle. For at isolere olienedbrydende bakterier skal tidligere fortyndede prøver og pipette 100 mikroliter af hver fortynding på petriskålene, der indeholder agarmedium, og pladede dem.Husk at holde negativ kontrol for dine plader. Opkluder opvasken i en til tre dage ved måltemperaturen, og gentag isolationsprocedurerne som tidligere. I denne protokol, mikroorganismer blev isoleret fra forskellige vandkilder og koral nubbins præsenterer formodede BMC egenskaber og i stand til at nedbryde forskellige klasser af forurenende stoffer.Ved hjælp af vandprøver indsamlet på et rensningsanlæg fra Experimental Center of Environmental Sanitation fra Federal University of Rio de Janeiro, 33 bakteriestammer i stand til at nedbryde EE2 blev isoleret. Derudover, ved hjælp af teknikken til udvælgelse af olie-nedbrydende bakterier, 20 stammer i stand til at nedbryde både olie-vandopløselige fraktion og olie-vand uopløselige fraktion blev isoleret. Formodede BMC egenskaber blev screenet i mikroorganismer, blandt dem en stamme, der præsenterer stærk antagonistisk aktivitet mod koral patogen Vibrio kolerae lyticus, stammer i stand til at nedbryde urinstof, en god katalase producent, og mikroorganismer præsenterer potentielt gavnlige gener blev fundet.Beskæftiger både bioremediation og BMC inokulering, var det muligt at forudsige koraller fra olie eksponering virkninger. En olie bioremediator PBMC konsortium isoleret fra koraller blev podet på koraller nubbins udsat for 1% olie. Det viste en bedre bevaret fotokemisk evne sammenlignet med koraller sundhed uden vaccination.Efterlad ikke prøver ved stuetemperatur for længe. Ellers kan det mikrobielle samfund ændre sig, og sygdomsrelaterede mikrober kan overskove andre. Råolie er giftigt.Sørg for at bruge passende personlige værnemidler, når du arbejder med dette eller andre forurenende stoffer, du beslutter dig for at bruge. Teknikken banede en innovativ måde inden for koral restaurering og hav bioremediation kan potentielt bruges til at minimere økonomiske, økologiske og sociale virkninger forårsaget af globale forandringer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonisk Nanopartikler for regenerativ Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering af<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrkning af Diverse mikrobielle samfund

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Bulk dråbe vitrifikation for primær Hepatocyte konservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generering af kontrollerede, dynamiske kemiske landskaber til undersøgelse af mikrobiel adfærd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Metabolisk profilering til bestemmelse af baktericid eller bakterostatiske virkninger af nye naturlige produkter ved hjælp af isotermisk mikrocalortri

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Forreste segment organkulturplatform til sporing af åbne globeskader og terapeutisk ydeevne

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...