Name: prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Denne forskningen ble utført i samarbeid med det pågående R & D-prosjektet registrert som ANP 21005-4, «PROBIO-DEEP-Survey av potensielle virkninger forårsaket av olje-og gass leting på hav Marin holobionts og valg av potensiell bioindicators og bioremediering prosesser for disse økosystemene "(UFRJ/Shell Brasil/ANP) –" PROBIO-DEEP-Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gás EM holobiontes marinhos EM Mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas ", sponset av Shell Brasil under ANP R & D Levy som" Compromisso de investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Forfatterne takker også Conselho Nacional de Desenvolvimento Uvv e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (KAPPER) for økonomisk støtte, og til Camila Messias, Phillipe Rosado, og Henrique Fragoso dos Santos, for bildene som er oppgitt.

1. vann og korall samling og lagring for mikrobiell isolasjon
Merk: det er viktig å ta koordinatene og temperaturen på prøvetaking nettsteder. Hvis det er mulig, kan metadata som saltinnhold, pH, dybde og lys intensitet også bidra til å finne finjusterte metoder for dyrking og fremtidig tolkning av data. For å få pålitelige resultater må du holde prøvene lagret i minst mulig tid. Vann/korall microbiomes kan endres betraktelig hvis prøvene ikke oppbevares ved riktig temperatur og/eller oppbevares i lengre perioder. Hvis isolasjons trinnet ikke utføres umiddelbart etter oppsamling, er det avgjørende å opprettholde prøvene ved 4 ° c til prosessering. Jo lengre prøvene er lagret, selv ved 4 ° c, jo mer mikrobiell samfunnet vil endre.
<ol><li>Prøve og lagre sjøvann.<ol>
<li>Samle 500 mL prøver av vann i minst tre eksemplarer fra hvert målrettede Prøvetakings sted. Bruk fortrinnsvis sterile flasker med skrulokk.</li>
		<li>Hvis behandlingen av vannet umiddelbart etter oppsamling, holde flaskene på RT for et kort intervall. Hvis prøve behandlingen skjer senere, beholder du flaskene ved 4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prøve og lagre koraller.<ol>
<li>Bruk en steril tang for å kutte koraller fragmenter fra samme prøvetaking stedet av vannprøvene. For å unngå forurensning, berører koraller bare med sterile hansker.</li>
		<li>Skyll samplet korall fragment med 20 mL steril saltoppløsning (3% NaCl i destillert vann) eller kunstig sjøvann for å bli kvitt de løst festet fritt levende bakterier i sjøvannet.</li>
		<li>Ved hjelp av tang, plasser hver korall fragment i en steril 250 − 500 mL container med en skrue cap som inneholder steril saltløsning.</li>
		<li>I laboratoriet, ved hjelp av sterile tang og tang, veie 5 g av koraller fragmenter ved hjelp av sterile 100 mm x 20 mm Petri retter på en veie skala.</li>
		<li>Overfør 5 g korall prøve til en steril mørtel og macerate den ved hjelp av en steril morter.</li>
		<li>Bruk en steril spatel, og overfør den macerated prøven til en steril kultur kolbe som inneholder 45 mL 3% NaCl steril oppløsning og 10 − 15 glassperler på 5 mm. Bruk noen av 45 mL steril saltløsning for å vaske mørtel og gjenopprette den maksimale mengden av macerate.</li>
		<li>Hold flaskene under konstant omrøring (150 x g) i 16 timer ved vanntemperaturen på Prøvetakings stedet. Merk: for grunt vann koraller vil optimal temperatur variere fra 24 − 28 ° c. Dette trinnet vil løsne mikroorganismer fra ulike koraller rom, for eksempel de som er knyttet til verten cellene, eller de som bor inne i vevet og skjelettet. Etter dette trinnet skal korall spylesystem ikke lagres, og isolasjons trinnet må utføres umiddelbart.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering av EE2-nedverdigende bakterier fra sjøvann og/eller koraller
<ol><li>Velg bakterier. Merk: etter trinn 1.1.2 og 1.2.7, konsentrasjonen av mikroorganismer i sjøvann som har løsrevet fra de ulike korall spylesystem vil være ukjent og variabel. For å garantere isolering av individuelle mikrobielle kolonier i Petri retter som inneholder agar medier, er seriell fortynninger nødvendig.<ol>
<li>Utfør seriell fortynninger på opptil 10-9 i steril saltløsning for korall prøver og opptil 10-6 for vann prøver. Pipetter fortynninger opp og ned 5x før du forkaster tuppen. Vortex prøver for 5 s hver gang før du utfører neste serie fortynning.</li>
		<li>Pipetter 100 μL av hver fortynning på Petri retter som inneholder 3% NaCl lysogeny buljong (LB) agar medium, og plate dem. Merk: Bruk Marine agar (MA) som et alternativ medium. Triplicates av hver fortynning er nødvendig for pålitelige resultater.</li>
		<li>Ruge platene i 1 − 3 dager ved mål temperaturen (f.eks. 26 ° c). Sjekk platene en gang om dagen.</li>
		<li>Velg og isolere koloniene presentere distinkte vekst morfologier på nye plater ved hjelp av strek plate teknikk. Gjenta dette steget så mange ganger som nødvendig for å få rene kolonier som vokser på platene.</li>
		<li>Hvis prosedyren ikke umiddelbart fortsetter å trå 2.3.1, skal Oppbevar isoleres ved 4 ° c eller i glyserol som beskrevet i avsnitt 2,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered glyserol aksjer. Merk: dette trinnet er valgfritt og kan brukes for langsiktige bakterie lager lagring.<ol>
<li>Plukk enkelt kolonier fra den friske platen eller fra platene lagret ved 4 ° c og uavhengig vaksinere dem i 2 mL sterilt LB medium.</li>
		<li>Plasser rørene under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c over natten (on).</li>
		<li>Tilsett 1 mL av bakteriekulturer fra trinn 2.2.2 og steril glyserol til en endelig konsentrasjon på 20% til 2 mL cryovials.</li>
		<li>La cryovials være på ved 4 ° c.</li>
		<li>Plasser glyserol bakterielle aksjer ved-80 ° c til nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utfør den EE2-fornedrelse evne testen.<ol>
<li>Aktiver isolerer i LB buljong eller alternative medier. For dette, plukke en enkelt koloni fra de friske platene eller platen som er lagret ved 4 ° c, og vaksinere 2 mL sterilt LB medium. I tilfelle det er en glyserol lager, første stripe den på LB agar plater og ruge ved 24 − 28 ° c ON å ha enkelt kolonier vokser. Plasser røret som inneholder LB medium tilbøyelig under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c på.</li>
		<li>Etter bakteriell vekst, pellet cellene ved sentrifugering dem ved 8 000 x g i 8 min ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og forsiktig pipettering opp og ned, resuspend cellene i et lik volum (2 mL) av saltvann for å vaske de resterende LB kjøttkraft.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.3.2 to ganger for å garantere at det ikke er spor av karbon kilde, blanding cellene i et likt volum av saltoppløsning. For eksempel, hvis det ble startet med en 2 mL kultur, resuspend cellene i et endelig volum på 2 mL saltoppløsning.</li>
		<li>Vaksinere de vasket og resuspendert celler i minimum Bushnell Haas kultur medium (BH buljong) som inneholder EE2 som den eneste karbon kilde59. Merk: EE2 er oppløst i etanol ved en endelig konsentrasjon på 5 mg/L i kultur mediet. Gjør endringer i forurensende type og/eller konsentrasjon ved behov.</li>
		<li>Vurder bakteriell vekst ved optisk tetthet ved 600 NM og/eller kolonier forming enheter (CFU) på LB agar medium33, for 16-72 h av inkubasjons. Merk: Alternativt kan mikroorganismer være direkte isolert på minimum medier som inneholder EE2, eller andre forbindelser, som den eneste karbon kilde. Dette trinnet vil dirigere utvalget og unngå uønsket vekst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolering av olje-nedverdigende bakterier fra sjøvann og/eller koraller
<ol><li>Forbered minimum medier som inneholder en olje vannløselig brøk (oWSF) og olje vann-uløselig brøkdel (oWIF) som den eneste karbon kilde21.<ol>
<li>Tilsett 1 − 2% råolje til 500 mL sterilt destillert vann. Bruk en filter kolbe åpnet på bunnen for å ta løselig brøk ut uten å forstyrre det øvre laget av uløselig brøk.</li>
		<li>Hold blandingen under konstant omrøring ved 24 − 28 ° c ved 150 x g for 48 h.</li>
		<li>Plasser filter flasken som inneholder råoljen fraksjoner på en stabil overflate og vent 10 − 20 min for å tillate løselig og uløselig brøk separasjon.</li>
		<li>Overfør oWSF til en ny steril kolbe, lagre oWIF ved å åpne den nederste filteret kolbe og ta ut løselig brøk.</li>
		<li>Bruke alle oWSF utvinnes i forrige trinn (~ 400 mL), forberede 1 L av BH agar minimum medium som inneholder oWSF som eneste karbon kilde.</li>
		<li>Bruke oWIF resterende i flasken fra trinn 3.1.4, forberede 1 L av BH agar minimum medium som inneholder oWIF som eneste karbon kilde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoler oWSF-og oWIF-nedverdigende bakterier.<ol>
<li>Ved hjelp av vann og korall macerate fra trinn 1.1.2 og 1.2.7, fortynne prøvene opp til 10-6 i steril saltoppløsning som beskrevet i trinn 2.1.1.</li>
		<li>Pipetter 100 μL av hver fortynning på Petri retter som inneholder BH-oWSF og BH-oWIF agar Media og plate dem.</li>
		<li>Gjenta prosedyrene som er beskrevet fra trinn 2.1.3 til trinn 2.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Consortium medlem utvalg
<ol><li>Pakk ut og sekvens DNA for taksonomisk identifisering.<ol>
<li>Aktiver isolerer lager i glyserol som beskrevet i trinn 2.3.1.</li>
		<li>Pakk ut DNA ved hjelp av en DNA-ekstraksjon Kit (se tabell over materialer).</li>
		<li>Bruk primere 27f (5 '-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ') og 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ') for forsterkning av 16S rRNA genet.</li>
		<li>Utfør 50 μL PCR-reaksjoner i henhold til følgende protokoll: 5 μL av 10x polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm av hver primer, 10 ng av genomisk DNA, og 2,5 U av Taq DNA polymerase. Legg til negative kontroller (dvs. blank DNA-utdrag og PCR-reaksjoner uten mal DNA) for å sikre at det ikke er forurensning.</li>
		<li>Sett opp følgende termiske sykling trinn: en første denaturering syklus ved 94 ° c for 4 min; 35 sykluser ved 94 ° c i 1 min, etterfulgt av 50 ° c i 1 min, og 72 ° c for 2,5 min; en siste Utvidelses syklus for 10 min ved 72 ° c.</li>
		<li>Sjekk amplicon integritet i 1,2% agarose gel med 80 V.</li>
		<li>Gel renser prøvene ved hjelp av en gel rensing Kit (se tabell over materialer).</li>
		<li>Kvantifisere PCR-produkter ved hjelp av en fluorometer.</li>
		<li>Send produktet for sekvenser. Merk: for bedre taxonomical klassifikasjoner, den sanger metoden anbefales60, fordi det gir lange sekvenser. Den universelle primere 27f og 1492r kan brukes til å forsterke nesten hele lengden av 16S rRNA genet61. Hvis contigs ikke kan monteres ved hjelp av ett par primere, bør et ekstra par i midten av sekvensen vurderes.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestem vekstkurven.<ol>
<li>Aktiver isolerer i glyserol aksjer fra trinn 2.2.5 som beskrevet i trinn 2.3.1, men ved hjelp av 5 mL i stedet for 2 mL.</li>
		<li>Tilsett 1% (v/v) av den dyrkede 5 mL kulturen fra trinn 4.2.1 i triplicates, til en 250 mL kolbe som inneholder 100 mL av 3% LB Media. Sørg for å forberede triplicates av en negativ kontroll (ingen inokulum) også.</li>
		<li>Plasser flaskene i en inkubator under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c.</li>
		<li>Ta 1 mL alikvoter hver 4 h for 48 h. Hvis stammene utgjør en høy vekstrate, redusere 4 h intervall.</li>
		<li>Mål den optiske tettheten (OD) estimering ved 600 NM bølgelengde og koloni forming enheter (CFU) telles fra seriell fortynninger belagt på rike medier plater (100 μL bør inokulert i hver plate og normalisert til volumet av 1 mL).</li>
		<li>Plot OD og CFU kurver og analysere korrelasjon av OD/CFU av hver enkelt stamme. Fra nå av beregner du antall celler basert på OD-verdiene.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør motsetningen test.<ol>
<li>Aktiver isolerer som beskrevet i trinn 2.3.1.</li>
		<li>Vaksinere en belastning om gangen langs midten av platene inneholder agar Media og de andre vinkelrett på den sentrale en. Gjenta til hver valgt mikrobiell stamme er testet mot alle andre.</li>
		<li>Ruge platene ved 24 − 28 ° c og Overvåk dem daglig for å observere potensiell Halo som indikerer fiendtlig aktivitet. Hvis det observeres en av disse som indikerer en fiendtlig aktivitet mellom to stammer, bør en av dem utelukkes.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør konsortium montering.<ol>
<li>Aktiver isolerer som beskrevet i trinn 2.3.1.</li>
		<li>Pellets cellene ved 3 500 x g og vask dem forsiktig 2x i et likt volum av saltoppløsning. Resuspend cellene i et lik volum (dvs. Hvis det endelige volumet var 2 mL celler, vask dem med 2 mL saltoppløsning og Resuspend dem i et endelig volum på 2 mL).</li>
		<li>Vaksinere 1 mL kultur i 100 mL 3% NaCl LB medium og ruge på ved 150 x g.
</li>
		<li>Gjenta trinn 4.5.2, vaksinere de 100 mL dyrket, vasket, og resuspendert kulturer i 10 L kulturer. Ruge ON i steril luft-Lift bioreaktorer, mottar filtrert luft fra en pumpe. Hvis mer kultur er nødvendig, alltid vaksinere 1% av dyrket kultur i friske medier.</li>
		<li>Sentrifuger dyrket kulturer ved 8 000 x g i 8 min ved 4 ° c. Kast supernatanten etter sentrifugering.</li>
		<li>Vask pellet, forsiktig blanding cellene i 500 mL steril saltoppløsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 4.5.5 og 4.5.6.</li>
		<li>Resuspend hver enkelt kultur i 100 mL saltoppløsning og mål OD å anslå antall celler.</li>
		<li>Beregn volumet av hver kultur er nødvendig for å nå en endelig konsentrasjon av 107 celler ml-1.</li>
		<li>Utføre CFU teller på rike medier for en endelig bekreftelse av celle levedyktighet og konsentrasjon.</li>
		<li>Bland et likt volum av hver enkelt kultur i sterile flasker og alikvot konsortiet i 50 mL sterile rør.</li>
		<li>Oppbevares ved 4 ° c til inoculation. Merk: Forbered konsortiet forsamlingen så fersk som mulig for å garantere cellene vil fortsatt være levedyktig. Alternativt kan CFU teller utføres før inoculation. For å sette sammen en ideell konsortium, er det nødvendig å bruke isolerer presentere ulike og komplementære metabolske kapasiteter. Vanligvis brukes 6 − 10 isolat for å danne konsortier, men dette antallet vil variere avhengig av medlemmenes egenskaper og formål.</li>
	</ol></li>
</ol>5. påvisning av antatte fordelaktige egenskaper for koraller
<ol><li>Aktiver isolerer fra glyserol aksjer ved striper dem på LB agar plater og incubating dem ved 24 − 28 ° c på å ha enkelt kolonier vokser. Plukk en enkelt koloni fra platene og vaksinere den i 2 mL steril LB medium. Plasser rør som inneholder LB medium tilbøyelig under konstant omrøring (150 x g) ved 24 − 28 ° c på.</li>
	<li>Utfør DNA-ekstraksjon som beskrevet i avsnitt 4,1 for påvisning av potensielt gunstige gener ved PCR. Merk: PCR reaksjonsbetingelser og primere vil avhenge av det målrettede genet. Metoder for å teste BMC-egenskapene til individuelle stammer og PCR-deteksjon for potensielt gunstige gener er beskrevet i tabell 1.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Bioremediering tilnærminger har blitt massivt utforsket de siste 50 årene. For eksempel har over 200 mikrober blant bakterier, cyanobakterier, mikroalger og sopp i flere forskjellige habitater, blitt utpekt som stand til å indikere tilstedeværelse og/eller forringe olje hydrokarboner62,63,64 . I tillegg er andre klasser av forbindelser som forårsaker virkninger på miljøet og mennesker, for eksempel plast, bisfenol A, endokrine disruptors, og tungmetaller, er mål for bioremediering teknikk utvikling65,66, i 67. På den annen side har Marin probiotiske utvikling vært begrenset til de feltene som har en åpenbar innvirkning på økonomien, slik som fiske probiotika i akvakultur68,69. Men isolasjon og karakterisering av gunstige mikroorganismer for å beskytte korallrev, marine økosystemer som støtter fiskeri, turisme og andre lønnsomme aktiviteter, begynner å bli verdsatt15. Her, en billig, enkel og tilgjengelig protokoll for å velge forurensende-nedverdigende mikroorganismer som også kan presentere potensielt fordelaktige egenskaper til lokale Marine økosystemer, spesielt antatte gunstige mikroorganismer til koraller (Pbmc), er Beskrevet.
I tillegg er metoden demonstrert her er svært tilpasningsdyktig til flere forbindelser og ulike typer mikrobielle kilder. Det er mulig å målrette ulike forurensende stoffer ved å erstatte den eneste karbon kilde lagt til minimum Media. For dette, i stedet for olje eller EE2, bør andre forbindelser legges på ønsket konsentrasjon. Dette vil være selektiv press for å isolere degraders for målrettede forurensende stoffer. For eksempel, mikroorganismer i stand til nedverdigende andre klasser av endokrine disruptors har allerede blitt valgt og testet ved hjelp av samme metodikk70. Videre andre marine-og terrestriske organismer, slik som svamper og planter71,72, samt distinkte typer miljø prøver, slik som jord, drivstoff, og bergarter kan brukes som nedverdigende-mikrobielle kilder25, 73,74. For eksempel var det mulig å oppdage og isolere hydrokarboner nedverdigende bakterier fra ulike jord og sediment prøver25,54,63,64,75. Til slutt, utføre små modifikasjoner i Media, mikroorganismer enn bakterier kan lett velges som nedverdigende-mikrober. For eksempel, en mikroalger stamme med evnen til å effektivt svekke østrogen forbindelser har blitt rapportert76.
Ideelt sett må bioremediering-probiotiske konsortier monteres for hver spesifikke sammensatte eller areal. Mikrober som vokser i et bestemt miljø kan ikke vokse så vel i nye områder i forhold til sine opprinnelige forhold. Fordi forskerne ikke har funnet et produkt som kan effektivt brukes under alle ulike miljøforhold, bør ny konsortier montering utføres for hver enkelt situasjon. Dette ville være beslektet med personlig medisin for miljø-skreddersydd utvinning. Av denne grunn er opprettelsen av en sentralbank av mikrobielle stammer med potensielle probiotiske egenskaper og fornedrelse kapasitet et avgjørende skritt for fremdriften av dette feltet. Dette initiativet vil spare tid og arbeid, bidra til montering av nye spesifikke konsortier over hele verden.
Mikroorganismer assosiert med koraller (dvs. mikroalger, bakterier, Archaea, sopp og virus) har en kompleks og intrikat rolle i å opprettholde verten homeostase19. Miljømessige stressfaktorer, slik som forurensning, kan også destabilisere korall mikrobiomet, noe som resulterer i dysbiosis, som kan forårsake sykdom og dødelighet30. Mekanismene som koraller mikrobiomet kan støtte koraller helse begynner å bli avslørt. Disse mekanismene er nøkkelen til å forstå koraller motstand og elastisitet til miljømessige stressfaktorer, og følgelig å fremme rev utholdenhet og bevaring. I tillegg vil funnene i feltet bidra til å forstå generelle mikrobiomet interaksjoner, som kan bidra til utvikling av bedre probiotika og helsefremmende strategier i andre områder. Det er også viktig å bedre undersøke hvordan disse probiotika vaksiner kan forstyrre metaorganism helse under stress hendelser. For eksempel, arbeid som viser at styrking i koraller ytelse skyldes probiotika og ikke bare koraller med bakterier som mat kilde er fortsatt nødvendig.
Parallelt, utvikling av nye konsortier levering tilnærminger og forbedring av de eksisterende er av stor betydning. Alternative metoder for konsortium immobilisering så vel som innovative tilnærminger, for eksempel vaksinere korall mat (dvs. Artemia og rotatorier) og bruke dem som vektorer, er lovende. Disse leveringssystemene kan også modifiseres for å målrette mot andre marine organismer og vil være avgjørende for suksessen til det marine probiotika.
Forurensning utslippsreduksjoner og korallrev utholdenhet er for tiden to av de viktigste temaene fremhevet i miljømessige konferanser regelmessig. Agenda 2030, et dokument publisert av FN som beskriver det globale mål samfunnet bør nå for å muliggjøre en bærekraftig fremtid, tilegne seg konkrete mål for hvert problem. Mens mål 6 fremhever viktigheten av forbedring av vannkvaliteten ved å redusere forurensningen, forsterker Goal 14 relevansen av bevaring og bærekraftig bruk av hav, hav og marine ressurser77. I denne sammenheng avhenger Coral Reef bevaring på endringer som bør oppnås i nær fremtid, inkludert forurensning utslippsreduksjoner. Dette er av stor betydning, fordi de fleste massive korall tap skjedde da andre faktorer ble lagt til klima hendelser, for eksempel lokale habitat ødeleggelse og forurensning78,79. Dette papiret viste at det er mulig å kombinere bioremediering og pBMC inoculation å svekke spesifikke forurensende stoffer, mens det kan øke koraller motstand og elastisitet å håndtere forurensning og andre problemer. Optimaliseringen av eksisterende protokoller og/eller utvikling av innovative metoder, kombinert eller uavhengig anvendt, vil være avgjørende for å bestemme fremtiden for Marine økosystemer.

Forurensning er et stort problem som berører mennesker, dyr og plante helse over hele verden. Selv om forurensning kan være naturlig, for eksempel vulkansk aske1, menneskelige aktiviteter er den primære årsaken til de fleste forurensning. Menneskeskapte aktiviteter er forurensende jord, vann og luft, som direkte eller indirekte føre til nesten 20 000 000 for tidlig menneskelig dødsfall2 og decimate milliarder av andre former for liv årlig. Forurensning er til stede selv i de mest avsidesliggende områdene av planeten. For eksempel, tungmetaller og vedvarende organiske forbindelser har blitt påvist i dypvanns virvelløse dyr og Polar pattedyr, henholdsvis3,4.
Marine miljøer har blitt spesielt påvirket av forurensning. I lang tid, ble det antatt at havet ville forbli upåvirket og levere en endeløs kilde til varer på grunn av sin massive volumet av vann5. Av denne grunn, alle typer industri og institusjoner fritt utgitt avfall i vannforekomster i århundrer6,7. Flere forurensninger av alle typer, for eksempel plast8, syntetiske hormoner9, plantevernmidler10, olje11, næringsstoffer12, tungmetaller3, og radioaktivt avfall13 har blitt rapportert som påvirker hav økosystemer. I denne sammenhengen er korallrev blant de viktigste og mest følsomme økosystemene i marine miljøer14. Skjær er kyst beskyttere, avgjørende for utviklingen av tusenvis av marine arter ved å spille viktige roller i næringsstoffer sykling og klimakontroll. Skjær også bidra til økonomien ved å tilby fisk, varer og turisme, blant andre15. For eksempel er 4 500 000 000 mennesker avhengig av havet fisk som sin viktigste mat kilde16, som er sterkt støttet av korallrev.
Uavhengig av deres økologiske, sosiale og økonomiske betydning, korallrev blir desimert17,18. Menneskeskapte aktiviteter er primært ansvarlig for å bidra til de tre viktigste årsakene til koraller ' død: klimaendringer, overfiske, og vannforurensning19. Selv om det er viktig å arbeide med reduksjonen av global oppvarming, er det også viktig å arbeide med å minimere lokal forurensning, inkludert vannforurensning, som kan kritisk bidra til korall nedgang20. Dermed er det et presserende behov for utvikling av strategier for å øke koraller levetid, noe som kan gi dem ekstra tid til å tilpasse seg og overleve.
I denne forbindelse er det svært viktig å finne løsninger for å minimere forurensning og å utvikle strategier for å øke egnethet av koraller. Strategier for å rette opp marin forurensning er svært mangfoldig og kan grupperes i fysiske, kjemiske og biologiske tilnærminger. Fysiske tilnærminger er nyttig. Men de er ikke alltid effektive. For eksempel kan plastavfall minimeres ved fysisk fjerning, mens vannløselige forbindelser trenger andre metoder for å bli eliminert. Eksempler på slike forbindelser er råolje, utgitt av oljeindustrien aktiviteter og søl, samt andre mikropollutanter, som syntetiske hormoner, vanligvis brukt som estrogenic komponent i p-piller og tilstede i kloakk21, 22. Bruk av kjemiske stoffer for å redusere forurensning kan løse et bestemt problem, men det kan også representere en ekstra kilde til forurensning. Dette er tilfellet med kjemisk dispergeringsmidler for å dempe olje forurensning, som har blitt beskrevet som enda mer giftig for Marine økosystemer enn olje forurensning selv23. Av disse grunner, biologiske tilnærminger presentere flere fordeler i forhold til andre metoder. Bioremediering er kapasiteten til levende organismer, eller deres metabolske produkter, å transformere forurensninger i mindre giftige eller ikke-giftige former24. De viktigste fordelene med å bruke biologiske metoder er bærekraft, relativ lav pris, det faktum at de er miljøvennlige, og at de kan brukes i ulike økosystemer, forårsaker minimal eller færre virkninger på miljøet21, 25,26,27.
I tillegg gjør manipulering av mikrobiell samfunnet til stede i et miljø en ekstra potensiell fordel. Det er microbiomes som er forbundet med verter og er avgjørende for deres helse. Det er velkjent at disse tilknyttede symbiotisk microbiomes er nødvendig for å opprettholde verten homeostase19. Manipulering av disse tilknyttede mikroorganismer har vært godt utforsket for verter som planter og pattedyr28,29, men bruken av Coral probiotika er fortsatt romanen15. Koraller også vert, samhandle med, og avhenger av store og spesifikke populasjoner av mikroorganismer for å overleve19. Rollen til disse mikrobielle samfunnene i helse og dysbiosis av koraller er under aktiv studie, men det er fortsatt langt fra å være fullt ut forstått30. En av de mest populære hypoteser kalles Coral probiotiske hypotese. Det tyder på eksistensen av en dynamisk sammenheng mellom symbiotisk mikroorganismer og miljømessige forhold som bringer om valg av de mest fordelaktige korall metaorganisms31. Basert på denne informasjonen, viktige potensielle probiotiske mekanismer, samt strategier for isolasjon, manipulasjon, og levering av gunstige mikroorganismer for koraller (BMCs) for flere formål, ble foreslått32 og testet33. Disse potensielle gunstige egenskaper inkluderer motstand mot temperaturøkning, beskyttelse mot reaktive oksygen arter (ROS), nitrogen fiksering, motstand mot forurensninger, og biologisk kontroll mot patogener, blant andre32.
Denne studien fokuserer på valg av BMCs og fritt levende mikroorganismer presentere evnen til å svekke to forurensninger som vanligvis finnes i marine miljøer: syntetisk østrogen 17A-etinyløstradiol (EE2) og råolje. Forurensende stoffer som inneholder hormon aktive midler er ofte til stede i vannforekomster34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Blant dem, syntetiske estrogenic endokrine-disruptor forbindelser (EDCs) etterligne handlingen av østrogen på målet celler, forårsaker flere virkninger på dyr, inkludert brystkreft, infertilitet, og Futanari9. EE2 utskilles av mennesker på grunn av bruk av p-piller. Det er ikke fjernet fra kloakk av tradisjonelle avløpsvann-renseanlegg og har negative effekter selv ved svært lave konsentrasjoner (f. eks ng/L eller μg/L)43,44,45. Lite er kjent om virkningene av østrogen på Coral fysiologi46,47. Men på andre marine virvelløse dyr, slik som svamper, krepsdyr og bløtdyr, ble østrogen rapportert å forårsake flere negative effekter hovedsakelig knyttet til reproduksjon, slik som utvikling og/eller stimulering av kjønnscellene, endring i enzymatisk og protein handlinger, problemer i embryonale prosesser, og andre48,49,50,51,52. De negative konsekvensene forårsaket av EE2 forurensning fremheve nødvendigheten av å utvikle bærekraftige tilnærminger for å fjerne denne forbindelsen fra miljøet uten at det påvirker marint liv.
Parallelt med olje for tiden sto for nesten 40% av verdens konsumert energikilder53, kronisk forurensning og oljesøl forekommer ofte i nærheten av rev områder11. Olje forurensning ble rapportert å forårsake negative effekter i flere arter av marine dyr, fugler, planter, og mennesker54,55,56,57. På koraller, det fører til bleking, reduserer motstanden av larver til termisk stress58, forstyrrer mikrobiell tilknyttede samfunn21, og forårsaker vev nekrose. I tillegg kjemisk dispergeringsmidler, en olje Utbedring teknikk som vanligvis brukes av oljeselskaper å rette opp søl, er enda mer giftig for koraller enn oljen selv23. Gunstige mikroorganismer isolert fra koraller, i kontrast, er kjent for å spille avgjørende roller på verts helse. Imidlertid må manipulering av disse potensielle probiotika være bedre utforsket for å undersøke mulige negative bivirkninger og metabolske kapasiteter som kan bli vist for å forbedre egnethet av metaorganism. I denne sammenheng, egenskaper som den antimikrobielle aktiviteten mot koraller patogener, produksjon av catalase for å bekjempe oksidativt stress, evnen til å svekke urea (som kan ha viktige roller i forkalkning prosessen), og tilstedeværelsen av gener som kan overdra potensielle fordelaktige egenskaper, blant annet, må være fokus for etterforskningen. Her viser vi hvordan bioremediering og probiotika kan brukes til samtidig å dempe virkningene av forurensning og forbedre koraller helse. Utviklingen av innovative tilnærminger som kan brukes som intervensjoner for å øke marine arter utholdenhet representerer et skritt mot en mer bærekraftig og sunnere planet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 mL PYREX Media Storage Bottle</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1743E20/1395-500</td>
			<td>Used to sample water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Aspirator Bottles</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1234B28/1220-2X</td>
			<td>Used to separate the oil fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-inch wire cutter plier</td>
			<td>thomas scientific/Restek</td>
			<td>1173Y64/23033</td>
			<td>Used to cut coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17a-Ethinylestradiol</td>
			<td>LGC Standards</td>
			<td>DRE-C13245100</td>
			<td>Used as the only carbon source to make the selective media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PCT0901-1KG</td>
			<td>Used to make solid media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell Haas Broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M350-500G</td>
			<td>Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td>
			<td>4882H35/26500-125</td>
			<td>Used to incubate coral macerate with glass beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28903470</td>
			<td>Used to purify PCR products before sending them for sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1177Q81/07DP1070</td>
			<td>Used to detach the microorganisms from coral structures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Needed to work at sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245-1KG</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M384-500G</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital-Shaker Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate liquid media and oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar and Pestle</td>
			<td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td>
			<td>1201U69/JMD150</td>
			<td>Used to macerate coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to centrifuge bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to measure optical density of bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Used for microbial strains DNA extraction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation

Forurensning påvirker alle biomer. Marine miljøer har vært spesielt påvirket, spesielt korallrev, en av de mest følsomme økosystemer på jorden. Globalt er 4 500 000 000 mennesker økonomisk avhengige av havet, hvor de fleste av deres levebrød er levert av korallrev. Koraller er av stor betydning, og derfor deres utryddelse fører til katastrofale konsekvenser. Det finnes flere mulige løsninger på rette opp marin forurensning og lokal forurensning, inkludert bioremediering. Bioremediering er kapasiteten til organismer å svekke forurensninger. Tilnærmingen presenterer flere fordeler, slik som bærekraft, relativt lav kostnad, og det faktum at det kan brukes i ulike økosystemer, forårsaker minimale virkninger på miljøet. Som en ekstra fordel, manipulering av endogene microbiomes, inkludert antatte gunstige mikroorganismer for koraller (Pbmc), kan ha probiotiske effekter for marine dyr. I denne sammenhengen kan bruken av de to tilnærmingene, bioremediering og pBMC-inoculation kombineres, være lovende. Denne strategien vil fremme nedbrytning av spesifikke forurensende stoffer som kan være skadelig for koraller og andre metaorganisms samtidig øke verten motstand og elastisitet å håndtere forurensning og andre trusler. Denne metoden fokuserer på valg av Pbmc å svekke to forurensninger: syntetisk østrogen 17A-etinyløstradiol (EE2) og råolje. Begge har blitt rapportert å negativt påvirke marine dyr, inkludert koraller, og mennesker. Protokollen beskriver hvordan å isolere og teste bakterier i stand til å svekke den spesifikke forurensninger, etterfulgt av en beskrivelse av hvordan å oppdage noen antatte gunstige egenskaper av disse tilknyttede mikrober til sine koraller vert. Metodene som er beskrevet her er relativt billig, enkel å utføre, og svært tilpasningsdyktig. Nesten alle slags løselig mål sammensatte kan brukes i stedet for EE2 og olje.

Basert på metodene som er beskrevet her, var det mulig å isolere mikroorganismer fra ulike vannkilder og koraller Nubbins presentere antatte BMC egenskaper og i stand til å svekke ulike klasser av forurensninger (figur 1). Ved hjelp av vann prøver samlet på et kloakkrenseanlegg, Hentet fra CESA-UFRJ (Experimental Center of Environmental sanitær av Federal University of Rio de Janeiro), og basert på prosedyren som presenteres her, 33 bakterielle belastninger i stand til å svekke EE2 på en endelig konsentrasjon på 5 mg/L ble isolert (figur 2A). I tillegg bruker teknikken for valg av olje-nedverdigende bakterier, 20 stammer i stand til å forringe både oWSF (figur 2B) og oWIF (figur 2C) ble isolert.
Antatte BMC egenskaper ble vist i mikroorganismer isolert fra ulike koraller arter under ulike forhold. Blant dem, en belastning presentere sterk fiendtlig aktivitet mot koraller patogen Vibrio coralliilyticus (Figur 3a), spenninger i stand til å svekke urea (Figur 3B), en god catalase produsent (Figur 3 C), og mikroorganismer presentere potensielt gunstige gener (Figur 3D) ble funnet.
Ansette de to tilnærminger kombinert (dvs. bioremediering og BMC inoculation), var det mulig å beskytte koraller fra olje eksponering virkninger. For dette var en olje bioremediator pBMC konsortium, isolert fra korall Mussismilia harttii, inokulert på korall Nubbins eksponert for 1% olje i triplicates21. Behandlingene eksponert for olje presenterte en progressiv nedgang i FV/FM fra den fjerde dagen og framover, og nådde verdier nær null av den tiende dagen. Variabel fluorescens/maksimal fluorescens (FV/FM) ga et mål på maksimal photosystem II (PSII) fotokjemisk effektiviteten av zooxanthellae, som representerer en indirekte måling av korall helse. På den andre side, korall Nubbins gave inne akvariet inokulert med det Consortium viste en bedre-bevart fotokjemisk evne (skikkelsen 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg"> Figur 1: oppsummering av de viktigste trinnene i en bioremediator-pBMC konsortium utvalg og montering. Ordningen med forurensende-nedverdigende mikroorganismer utvalg trinn (i grått) og siste trinnene som brukes for konsortiet mikrobiell utvalg (DNA-sekvensering, vekst kurve, fiendtlighet test, og konsortium montering i rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg"> Figur 2: valg av forurensende-nedverdigende bakterier. (A) bakteriell isolerer vokser på minimum Media plater som inneholder EE2 som eneste karbon kilde. (B) bakterie kolonier vokser på minimum Media plater som inneholder oWSF som eneste karbon kilde. (C) bakterie kolonier vokser på minimum Media plater som inneholder oWIF som eneste karbon kilde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg"> Figur 3: påvisning av pBMC-egenskaper. (A) flekker i triplicates av belastningen presentere fiendtlig aktivitet mot koraller patogen Vibrio coralliilyticus (i svart) og en kontroll stamme (i grønt). (B) stammer vokser på medier som inneholder urea som den eneste karbon kilde. (C) belastning produsere catalase (+) og en dårlig catalase produsent stamme (-). (D) eksempel på PCR-deteksjon av nirK-genet (Lane 1 = 1kb Ladder; Lane 2 = blank DNA-ekstraksjon negativ kontroll; Lane 3 = nirK Detection; Lane 4 = PCR reaksjoner uten mal DNA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg"> Figur 4: FV/FM målinger av M. harttii Nubbins mørk-tilpasset ved 5 PM, ved hjelp av en DIVING-Pam klorofyll fluorometer. FV/FM målinger av behandlingene kontroll konsortium, olje og olje med konsortium ble utført i triplicates hver dag i 10 dager. Standard avvik vises. Funksjoner av grafen ble endret med tillatelse fra tidligere resultater21, tilgjengelig på https://www.Nature.com/articles/srep18268 under en Creative Commons Attribution 4,0. Fullstendige termer på http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Moa</td>
			<td>Mikroorganismen</td>
			<td>Deteksjon teknikk</td>
			<td>Referanser</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Klimaregulering; surfur sykling; antimikrobielle forbindelser; øke antioksidant beskyttelse av celler.</td>
			<td>Aspergillus sydowii</td>
			<td>PCR for dddP-genet</td>
			<td>81</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudovibrio Sp. P12</td>
			<td>Kultur medium med DMSP</td>
			<td>82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>PCR for dmdA-genet</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Biologisk regulering av patogener.</td>
			<td>Mikrobiomet fra Acropora palmata mucus</td>
			<td>Tøm sone av hemming</td>
			<td>83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ekstrakter fra koraller</td>
			<td>Veksthemming analysen</td>
			<td>84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Marinobacter Sp.</td>
			<td>Kryr av analyser</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Agar plate Cross-striper</td>
			<td>86</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Agar-Diffusion metode</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fordel for forkalkning prosessen; kilde til nitrogen for scleractinian koraller.</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Fargemetrisk metode</td>
			<td>87</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiomet fra Stylophora pistillata mucus</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiomet fra Acropora alciminata</td>
			<td>Metode ved Bolland et al. 80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Nitrogen syklus; øke nitrogen fiksering.</td>
			<td>Mikrobiell samfunnet</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell samfunnet</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell samfunnet</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell samfunnet</td>
			<td>Tilpasset acetylen (C2H2) reduksjons teknikk</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas Sp. og Halomonas taeanensis</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Nitrogen syklus; reduksjon av ammonium konsentrasjon.</td>
			<td>Pseudoalteromonas Sp.</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiomet fra Tubastraea coccinea</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>94</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiomet fra Xestospongia testudinaria</td>
			<td>Prediktiv metagenome analyse</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Holobiont beskyttelse mot reaktive oksygen arter (ROS).</td>
			<td>Pseudoalteromonas Sp., Cobetia Marina og Halomonas taeanensis</td>
			<td>Catalase test</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex rød</td>
			<td>96</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio Pelagius og Sync-chococcus Sp.</td>
			<td>Pepperrot peroksidase-scopoletin metode</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio fischeri</td>
			<td>Flere metoder</td>
			<td>98</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: påvisning av antatte BMC-egenskaper, virkningsmekanisme (MOA), rapporterte mikroorganismer som presenterer potensialet og teknikken som brukes til å oppdage den karakteristiske.

Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Forurensning påvirker alle biomer. Marine miljøer har vært spesielt påvirket, spesielt korallrev, en av de mest følsomme økosystemer på jorden. Bioremediering er kapasiteten til organismer å svekke forurensninger. Her beskriver vi metoder for å isolere og teste mikrober som presenterer bioremediering evne og potensielle probiotiske egenskaper for koraller.

Prospektering mikrobiell stammer for Bioremediering og probiotika utvikling for Metaorganism forskning og bevaring

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Vi kan isolere og montere probiotika som både kan fremme korallhelse og samtidig redusere virkningen av forurensning, og som kan bidra til et revs utholdenhet i den skiftende verden. Isolasjons- og screeningtilnærmingen som beskrives, kan brukes til å velge mikroorganismer som presenterer viktige metabolske aktiviteter som nedbrytning av forurensende stoffer eller andre gunstige egenskaper til marine organismer som koraller. Denne metoden kan brukes til å isolere mikroorganismer som er i stand til å forringe eventuelle forurensninger.Og i tillegg kan andre kilder til materiale brukes i de andre miljøprøvene som planter, jord, vann, noe. Studer litteraturen og prøv å fokusere på stammer som kan være gode kandidater for ditt formål. Hvis mulig, diriger isolasjonsmetodene for disse stammene og unngå kjente patogener.Og hvis du tar sikte på å bruke et konsortium av bakterier, er det også svært viktig å først undersøke om medlemmene av konsortiet har antagonistisk aktivitet mot hverandre. Fordi koraller er under økende risiko for utryddelse, begynner denne metodikken å bli startet over hele verden, og det er behov for å spre og standardisere metoden. Som noen korallforskere har ingen erfaring med konvensjonell mikrobiologi, det er derfor de har ofte bedt om råd om hvordan du går frem med en slik tilnærming.Til å begynne, fra hvert målrettede prøvetakingssted, bruk sterile flasker med skrukorker for å samle 500 milliliter vann i triplikate. Hvis prøvebehandling skjer senere, hold flaskene på fire grader Celsius. Bruk et sterilt par tang og tang til å kutte korallfragmenter fra samme prøvetakingssted for vannprøvene.Skyll prøvekorallfragmentet ved hjelp av 20 milliliter sterile 3% saltvannsløsning eller kunstig sjøvann for å kvitte seg med de løst vedlagte frittlevende bakteriene i sjøvannet. Bruk tang, plasser hvert korallfragment i en steril beholder med en skrukork som inneholder steril saltvannsløsning. Bruk sterile tang og tang, vei fem gram korallfragmenter i sterile Petri-retter på en veieskala.Overfør de fem gram korallprøven til en steril mørtel og macerate den ved hjelp av en steril pestle. Ved hjelp av en steril slikkepott, overfør den macerated prøven til en steril kulturkolbe som inneholder 25 milliliter av 3% natriumklorid steril løsning og 10 til 15 glassperler på 2,5 millimeter. Bruk 20 milliliter steril saltvannsløsning for å vaske mørtelen inn i røret for å gjenopprette den maksimale mengden av macerate.For å løsne mikroorganismer fra forskjellige korallrom, hold kolben under konstant agitasjon på 150 ganger g i 16 timer ved vanntemperaturen på prøvetakingsstedet. For å velge bakterier, først utføre seriell fortynninger opp til 10 til de negative ni i steril saltvann løsning for korallprøver og opp til 10 til de negative seks for vannprøver. Pipettefortynninger opp og ned fem ganger før spissen kastes.Deretter virvler hver og en. Vortex prøvene i fem sekunder hver gang før du utfører neste seriell fortynning. Pipette 100 mikroliter av hver fortynning på Petri retter som inneholder 3% natriumklorid lysogeny kjøttkraft agar medium og plate dem.Inkuber platene i en til tre dager ved måltemperaturen, for eksempel 26 grader Celsius. Sjekk platene en gang om dagen. Velg og isoler koloniene som presenterer distinkte vekstmorfologiske er på nye plater ved hjelp av strekplateteknikken.Gjenta dette trinnet så mange ganger som nødvendig for å ha rene kolonier som vokser på platene. Oppbevar isolatene ved fire grader Celsius eller i glyserol som beskrevet i manuskriptet. For å utføre EE2 nedbrytning evne test, plukke en enkelt koloni fra friske plater og inokulere i to milliliter steril LB medium i et rør.I tilfelle det er en glyserol lager, ta 10 mikroliter av glyserol bakteriell lager og strek på LB agar plater. Inkuber ved 24 til 28 grader Celsius over natten for å ha enkeltkolonier vokser. Plasser røret som inneholder LB medium tilbøyelig under konstant agitasjon på 150 ganger g ved 24 til 28 grader Celsius over natten.Etter bakteriell vekst, pellet cellene ved å sentrifugere dem på 8, 000 ganger g i åtte minutter ved romtemperatur. Kast det overnaturlige. For å vaske den gjenværende LB kjøttkraft, tilsett to milliliter saltvann for å gjenbruke cellene.Gjenta vasken to ganger for å garantere at det ikke er spor av karbonkilde. Inokuler de vasket og resuspended cellene i minimum Bushnell Haas kultur medium som inneholder EE2 som den eneste karbonkilden. Vurder bakteriell vekst ved optisk tetthet ved 600 nanometer og våre kolonidanneenheter på LB agar medium etter 16 til 72 timers inkubasjon.For å forberede minimumsmedier som inneholder en olje-vannløselig brøkdel og en olje-vann uoppløselig brøkdel som den eneste karbonkilden, tilsett 1-2% råolje til 500 milliliter sterilt destillert vann i en filterkolbe som inneholder en ventil på bunnen. Hold kolben under konstant agitasjon ved 24 til 28 grader Celsius ved 150 ganger g i 48 timer. Deretter plasserer du kolben på en stabil overflate og venter 10 til 20 minutter for å la den løselige og uoppløselige fraksjonen skilles.Åpne deretter den nederste filterkolben for å overføre oljevannsløselig fraksjon til en ny steril kolbe som sparer oljevannet uoppløselig fraksjon. Deretter forberede to flasker Bushnell Haas agar minimum medium. Autoklav den.Kombiner med olje-vannløselig fraksjon som den eneste karbonkilden for å lage 500 milliliter agar medium. Gjør det samme med olje-vann uoppløselig fraksjon og overføre ca 25 milliliter av hvert medium på individuelle Petri retter. For å isolere oljeforringende bakterier, gjenbruk tidligere fortynnede prøver og pipette 100 mikroliter av hver fortynning på Petri-rettene som inneholder agarmedium og plate dem.Husk å holde negative kontroller for platene dine. Inkuber oppvasken i en til tre dager ved måltemperaturen og gjenta isolasjonsprosedyrene som tidligere. I denne protokollen ble mikroorganismer isolert fra forskjellige vannkilder og korallcorobiner som presenterte antatte BMC-egenskaper og i stand til å forringe forskjellige klasser av forurensninger.Ved hjelp av vannprøver samlet ved et kloakkrenseanlegg hentet fra Experimental Center of Environmental Sanitation ved Federal University of Rio de Janeiro, ble 33 bakterielle stammer i stand til å forringe EE2 isolert. I tillegg, ved hjelp av teknikken for å velge oljeforringende bakterier, ble 20 stammer i stand til å forringe både olje-vannløselig fraksjon og olje-vann uoppløselig fraksjon isolert. Putative BMC egenskaper ble screenet i mikroorganismer, blant dem en belastning presentere sterk antagonistisk aktivitet mot korallpatogen Vibrio kolerae lyticus, stammer i stand til å forringe urea, en god katalase produsent, og mikroorganismer presentere potensielt gunstige gener ble funnet.Ved hjelp av både bioremediering og BMC-inokulasjon var det mulig å forutsi koraller fra oljeeksponeringspåvirkninger. En olje bioremediator PBMC konsortium isolert fra koraller ble inokulert på koraller nubbins utsatt for 1% olje. Det viste en bedre bevart fotokjemisk evne sammenlignet med korallhelsen uten inokulasjon.Ikke la prøvene stå ved romtemperatur for lenge. Ellers kan det mikrobielle samfunnet endres og sykdomsrelaterte mikrober kan overvekst andre. Råolje er giftig.Pass på at du bruker egnet personlig verneutstyr når du arbeider med dette eller andre forurensninger du bestemmer deg for å bruke. Teknikken banet en innovativ måte innen korallrestaurering og havbioremediering kan potensielt brukes til å minimere økonomiske, økologiske og sosiale konsekvenser forårsaket av global endring.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En Microfluidic enhet for Studerer Flere Tydelig Stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikler for regenerativ Forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering av<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrking av Diverse mikrobielle samfunn

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering og sporing av mikrobiel samfunnsutvikling innenfor en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Bulk dråpe vitrifikasjon for primær hepatocytter bevaring

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Metabolsk profilering for å bestemme bakteriedrepende eller bakteriostatiske effekter av nye naturlige produkter ved hjelp av isotermisk mikrocalorimetry

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Fremre segment organkulturplattform for sporing av Open Globe-skader og terapeutisk ytelse

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...