Name: prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Esta pesquisa foi realizada em associação com o projeto de Pesquisa e Desenvolvimento em andamento registrado como ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Levantamento dos impactos potenciais causados pela exploração de petróleo e gás em holobiontes marinhos em alto mar e seleção de potenciais bioindicadores e Processos de bioremediação para esses ecossistemas" (UFRJ/ Shell Brasil/ANP) – "PROBIO-DEEP - Levantamento de impactos causados pela exploração de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de possíveis bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas, patrocinado pela Shell Brasil a anp de p&d levy como Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Os autores também agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro, e a Camila Messias, Phillipe Rosado e Henrique Fragoso dos Santos, para as imagens fornecidas.

1. Coleta e armazenamento de água e corais para isolamento microbiano
NOTA: É essencial tomar as coordenadas e a temperatura dos locais de amostragem. Se possível, metadados como salinidade, pH, profundidade e intensidade de luz também podem ajudar a encontrar abordagens de cultivo afinadas e interpretação futura dos dados. Para obter resultados confiáveis, mantenha as amostras armazenadas pelo período mínimo possível. Os microbiomas de água/coral podem mudar consideravelmente se as amostras não forem mantidas na temperatura certa e/ou forem armazenadas por longos períodos. Se a etapa de isolamento não for realizada instantaneamente após a coleta, é crucial manter amostras a 4 °C até o processamento. Quanto mais tempo as amostras forem armazenadas, mesmo a 4 °C, mais a comunidade microbiana mudará.
<ol><li>Prove e armazene a água do mar.<ol>
<li>Coletar 500 amostras de mL de água em pelo menos triplicado de cada local de amostragem alvo. De preferência, use garrafas estéreis com tampas de rosca.</li>
		<li>Se processar a água instantaneamente após a coleta, mantenha as garrafas no RT por um curto intervalo. Se o processamento de amostras estiver acontecendo mais tarde, mantenha as garrafas a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prove e guarde o coral.<ol>
<li>Use um par estéril de alicates para cortar fragmentos de corais do mesmo local de amostragem das amostras de água. Para evitar a contaminação, toque corais apenas com luvas estéreis.</li>
		<li>Lave o fragmento de coral amostrado usando a solução soro fina estéril do soro -sânse (3% NaCl na água destilada) ou na água do mar artificial para começ livrada das bactérias livre-vivas frouxamente unidas do seawater.</li>
		<li>Usando fórceps, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril de 250 a 500 mL com uma tampa de rosca contendo solução sorino estéril.</li>
		<li>No laboratório, usando fórceps e alicates estéreis, pesa 5 g de fragmentos de corais usando pratos estérils de Petri de 100 mm x 20 mm em uma escala de pesagem.</li>
		<li>Transfira o 5g de amostra de coral para uma argamassa estéril e macerar-lo usando um pilão estéril.</li>
		<li>Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 45 mL de solução estéril naCl de 3% e 10 a 15 contas de vidro de 5 mm. Use algumas das soluções sais estéreis de 45 mL para lavar a argamassa e recuperar a quantidade máxima do macerado.</li>
		<li>Mantenha os frascos agitação constante (150 x g)por 16 h na temperatura da água do local da amostragem. NOTA: Para corais de águas rasas, a temperatura ideal variará de 24 a 28 °C. Esta etapa irá separar microorganismos de diferentes compartimentos de coral, como os ligados às células hospedeiras, ou os que vivem dentro do tecido e do esqueleto. Após esta etapa, os macerados corais não devem ser armazenados, e a etapa da isolação deve imediatamente ser executada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento de bactérias degradantes de EE2 da água do mar e/ou corais
<ol><li>Selecione bactérias. NOTA: Após os passos 1.1.2 e 1.2.7, a concentração de microorganismos na água do mar que se separaram dos diferentes macerates de corais será desconhecida e variável. A fim de garantir o isolamento de colônias microbianas individuais em placas de Petri contendo mídia ágara, diluições em série são necessárias.<ol>
<li>Realize diluições em série de até10-9 em solução sisina estéril para amostras de corais e até10-6 para amostras de água. Diluições pipette para cima e para baixo 5x antes de descartar a ponta. Vortex amostras para 5 s cada vez antes de realizar a próxima diluição em série.</li>
		<li>Pipette 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo 3% de caldo de lysogeny NaCl (LB) médio ágar, e placa-los. NOTA: Use ágar marinho (MA) como um meio alternativo. Triplicados de cada diluição são necessários para resultados confiáveis.</li>
		<li>Incubar as placas por 1 a 3 dias na temperatura alvo (por exemplo, 26 °C). Verifique os pratos uma vez por dia.</li>
		<li>Selecione e isole as colônias que apresentam morfologias distintas do crescimento em placas novas usando a técnica da placa da raia. Repita este passo quantas vezes for necessário para ter colônias puras crescendo nas placas.</li>
		<li>Se o procedimento não for imediatamente continuado a pisar 2.3.1, armazenar isola a 4 °C ou em glicerol, conforme descrito na seção 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare os estoques de glicerol. NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser usada para o armazenamento de estoques bacterianos a longo prazo.<ol>
<li>Escolha colônias individuais da placa fresca ou das placas armazenadas a 4 °C e inocule-as de forma independente em 2 mL de meio LB estéril.</li>
		<li>Coloque os tubos em constante agitação (150 x g)a 24 a 28 °C durante a noite (ON).</li>
		<li>Adicione 1 mL das culturas bacterianas do passo 2.2.2 e glicerol estéreo a uma concentração final de 20% aos 2 mL crioviais.</li>
		<li>Deixe os crioviais em 4 °C.</li>
		<li>Coloque os estoques bacterianos de glicerol em -80 °C até que seja necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize o teste de habilidade de degradação do EE2.<ol>
<li>Ativar os isolados em caldo LB ou mídia alternativa. Para isso, escolha uma única colônia das placas frescas ou da placa armazenada a 4 °C e inocule 2 mL de meio LB estéril. No caso de ser um estoque de glicerol, primeira raia-lo em placas de ágar LB e incubar a 24-28 ° C ON para ter colônias individuais crescendo. Coloque o tubo contendo LB médio inclinado agitação constante (150 x g)em 24-28 °C ON.</li>
		<li>Após o crescimento bacteriano, pelotas as células por centrífuga-los em 8.000 x g para 8 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant e, delicadamente tubulação para cima e para baixo, resuspender as células em um volume igual (2 mL) de água shinhosa para lavar o caldo LB restante.</li>
		<li>Repita o passo 2.3.2 duas vezes para garantir que não há vestígios de fonte de carbono, resuspendendo as células em um volume igual de solução salina. Por exemplo, se foi iniciado com uma cultura de 2 mL, resuspender as células em um volume final de 2 mL solução saline.</li>
		<li>Inocular as células lavadas e resuspensas no mínimo Bushnell Haas meio de cultura (CALdo BH) contendo EE2 como a única fonte de carbono59. NOTA: EE2 é dissolvido em etanol em uma concentração final de 5 mg/L no meio da cultura. Faça alterações no tipo de poluente e/ou concentração, se necessário.</li>
		<li>Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica em 600 nm e/ou colônias formando unidades (CFU) no lb ágar médio33, para 16-72 h de incubação. NOTA: Alternativamente, os microorganismos podem ser diretamente isolados em meios mínimos contendo EE2, ou outros compostos, como a única fonte de carbono. Esta etapa dirigiria a seleção e evitaria o crescimento indesejável.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento de bactérias que degradam o petróleo da água do mar e/ou corais
<ol><li>Prepare a mídia mínima contendo uma fração solúvel em água de óleo (oWSF) e fração insolúvel em água de óleo (oWIF) como a única fonte de carbono21.<ol>
<li>Adicione 1 a 2% de petróleo bruto a 500 mL de água destilada estéril. Use um frasco de filtro aberto na parte inferior para tirar a fração solúvel sem perturbar a camada superior da fração insolúvel.</li>
		<li>Mantenha a mistura agitação constante em 24-28 °C a 150 x g por 48 h.</li>
		<li>Coloque o frasco de filtro contendo as frações de petróleo bruto em uma superfície estável e espere 10 a 20 min para permitir a separação de fração solúvel e insolúvel.</li>
		<li>Transfira o oWSF para um novo frasco estéril, salvando o oWIF abrindo o frasco de filtro inferior e tirando a fração solúvel.</li>
		<li>Usando todo o oWSF recuperado na etapa precedente (~400 mL), prepare 1 L do meio mínimo do agar de BH que contem oWSF como a única fonte de carbono.</li>
		<li>Usando o oWIF restante no frasco da etapa 3.1.4, prepare 1 L do meio mínimo do agar de BH que contem oWIF como a única fonte de carbono.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolar bactérias oWSF e oWIF-degradantes.<ol>
<li>Usando água e coral macerar a partir dos passos 1.1.2 e 1.2.7, respectivamente, diluir as amostras até10-6 em solução salina estéril, conforme descrito na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Pipette 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo BH-oWSF e BH-oWIF agar media e placa-los.</li>
		<li>Repita os procedimentos descritos do passo 2.1.3 para o passo 2.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Seleção de membros do consórcio
<ol><li>Extraia e sequencie o DNA para identificação taxonômica.<ol>
<li>Ative os isolados estocados em glicerol, conforme descrito na etapa 2.3.1.</li>
		<li>Extraia o DNA usando um kit de extração de DNA (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Use primers 27f (5′-AGA GTT TGA TGA TGG CTC AG-3′) e 1492r (5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) para amplificação do gene rRNA 16S.</li>
		<li>Realize 50 μL PCR reações de acordo com o seguinte protocolo: 5 μL de 10x polymerase buffer, 2 mM MgCl2,0,2 mM dNTPs, 5 mM de cada cartilha, 10 ng de DNA genômico e 2,5 U de Taq DNA polymerase. Adicionar controles negativos (ou seja, extrações de DNA em branco e reações pcr sem dna modelo) para garantir que não haja contaminação.</li>
		<li>Configure os seguintes passos de ciclismo térmico: um primeiro ciclo de desnaturação a 94 °C por 4 min; 35 ciclos a 94 °C por 1 min, seguidos por 50 °C por 1 min e 72 °C por 2,5 min; um ciclo de extensão final de 10 min a 72 °C.</li>
		<li>Verifique a integridade amplicon em 1,2% de gel agarose usando 80 V.</li>
		<li>Gel purificar as amostras usando um kit de purificação de gel (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Quantificar os produtos PCR usando um flódromo.</li>
		<li>Envie o produto para sequenciamento. NOTA: Para melhores classificações taxonômicas, o método Sanger é recomendado60,porque fornece longas seqüências. As primers universais 27f e 1492r podem ser usadas para amplificar quase todo o comprimento do gene rRNA 16S61. Se os contigs não puderem ser montados usando um par de primers, um par extra no meio da seqüência deve ser considerado.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar a curva de crescimento.<ol>
<li>Ative os isolados em estoques de glicerol a partir do passo 2.2.5 como descrito na etapa 2.3.1 mas usando 5 mL em vez de 2 mL.</li>
		<li>Adicionar 1% (v/v) da cultura cultivada 5 mL a partir do passo 4.2.1 em triplicados, para um frasco de 250 mL contendo 100 mL de 3% LB mídia. Certifique-se de preparar triplicados de um controle negativo (sem inóculo) também.</li>
		<li>Coloque os frascos em uma incubadora em constante agitação (150 x g)a 24 a 28 °C.</li>
		<li>Tome 1 mL aliquots cada 4 h para 48 h. Se as cepas apresentarem uma alta taxa de crescimento, diminua o intervalo de 4 h.</li>
		<li>Medir a estimativa de densidade óptica (OD) em 600 nm comprimento de onda e unidades formadoras de colônias (CFU) contadas a partir de diluições em série banhadas em placas de mídia ricas (100 μL devem ser inoculadas em cada placa e normalizadas para o volume de 1 mL).</li>
		<li>Trace as curvas de OD e CFU e analise a correlação de OD/CFU de cada cepa individual. A partir de agora, calcule o número de células com base nos valores do OD.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar teste de antagonismo.<ol>
<li>Ative os isolados, conforme descrito na etapa 2.3.1.</li>
		<li>Inocular uma cepa de cada vez ao longo do meio de placas contendo mídia ágar e os outros perpendiculares ao central. Repita até que cada cepa microbiana selecionada seja testada contra todas as outras.</li>
		<li>Incubar as placas a 24 a 28°C e monitorá-las diariamente para observar potenciais halos indicando atividade antagônica. Se os halos são observados indicando atividade antagônica entre duas cepas, uma delas deve ser excluída.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a montagem do consórcio.<ol>
<li>Ative os isolados, conforme descrito na etapa 2.3.1.</li>
		<li>Pelotas as células em 3.500 x g e lave-os suavemente 2x em um volume igual de solução shinhosa. Resuspenda as células em um volume igual (ou seja, se o volume final foi de 2 mL de células, lave-as usando 2 mL de solução sorino e resuspendê-las em um volume final de 2 mL).</li>
		<li>Inocular 1 mL cultura em 100 mL 3% NaCl LB médio e incubar ON em 150 x g.
</li>
		<li>Repita o passo 4.5.2, inocule os 100 mL cultivados, lavados e resuspendidos culturas em culturas 10 L. Incubar ON em biorreatores estéreis de ar-elevador, recebendo ar filtrado de uma bomba. Se for necessária mais cultura, inocular sempre 1% da cultura adulta em novas mídias.</li>
		<li>Centrífugas cultivadas culturas em 8.000 x g para 8 min em 4 °C. Descarte supernatant após centrífuga.</li>
		<li>Lave a pelota, resuspendendo delicadamente as pilhas em 500 mL da solução shinhoe estéril.</li>
		<li>Repita os passos 4,5,5 e 4,5,6.</li>
		<li>Resuspenda cada cultura individual em 100 mL de solução saline e mede o OD para estimar o número de células.</li>
		<li>Calcule o volume de cada cultura necessária para atingir uma concentração final de 107 células mL-1.</li>
		<li>Realizar CFU conta com mídia rica para uma confirmação final de viabilidade celular e concentração.</li>
		<li>Misture um volume igual de cada cultura individual em frascos estéreis e aquot o consórcio em tubos estéreis de 50 mL.</li>
		<li>Mantenha-se em 4 °C até a inoculação. NOTA: Prepare a montagem do consórcio o mais fresco possível para garantir que as células ainda serão viáveis. Alternativamente, as contagens de CFU podem ser realizadas antes da inoculação. Para montar um consórcio ideal, é necessário usar isolados apresentando diferentes e complementares capacidades metabólicas. Normalmente, 6 a 10 isolados são usados para formar consórcios, mas esse número variará dependendo das características e propósitos dos membros.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Detecção de características benéficas putativas para corais
<ol><li>Ative os isolados dos estoques de glicerol, estrias-los em placas de ágar LB e incubar-los em 24-28 °C ON para ter colônias individuais crescendo. Escolha uma única colônia das placas e inocule-a em 2 mL do meio estéril do LB. Coloque o tubo contendo lb médio inclinado agitação constante (150 x g)em 24-28 °C ON.</li>
	<li>Realize a extração de DNA descrita na seção 4.1 para detecção de genes potencialmente benéficos por PCR. NOTA: As condições de reação pcr e primers vai depender do gene alvo. Metodologias para testar características BMC de cepas individuais e detecção de PCR para genes potencialmente benéficos são descritas na Tabela 1.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As abordagens de bioremediação têm sido exploradas maciçamente nos últimos 50 anos. Por exemplo, mais de 200 micróbios entre bactérias, cianobactérias, microalgas e fungos em vários habitats diferentes, foram designados como capazes de indicar a presença e/ou degradar hidrocarbonetos de petróleo62,63,64 . Além disso, outras classes de compostos que causam impactos ao meio ambiente e aos seres humanos, como plástico, bisfenol A, desreguladores endócrinos e metais pesados, são alvos para o desenvolvimento da técnica de bioremediação65,66, 67. Por outro lado, o desenvolvimento probiótico marinho tem sido limitado aos campos que têm um impacto óbvio sobre a economia, como probióticos de peixes na aquicultura68,69. No entanto, o isolamento e caracterização de microrganismos benéficos para proteger os recifes de coral, ecossistemas marinhos que apoiam a pesca, o turismo e outras atividades lucrativas, estão começando a ser valorizados15. Aqui, um protocolo barato, fácil e acessível para selecionar microorganismos que degradam poluentes que também podem apresentar características potencialmente benéficas para os ecossistemas marinhos locais, especialmente microorganismos benéficos para corais (pBMCs), é Descrito.
Além disso, o método demonstrado aqui é altamente adaptável a vários compostos e diversos tipos de fontes microbianas. É possível visar diferentes poluentes, substituindo a única fonte de carbono adicionada aos meios de comunicação mínimos. Para isso, em vez de óleo ou EE2, outros compostos devem ser adicionados na concentração desejada. Esta seria a pressão seletiva para isolar degraders para os poluentes alvejados. Por exemplo, microorganismos capazes de degradar outras classes de desreguladores endócrinos já foram selecionados e testados usando a mesma metodologia70. Além disso, outros organismos marinhos e terrestres, como esponjas e plantas71,72,bem como tipos distintos de amostras ambientais, como solo, combustível e rochas podem ser usados como as fontes degradantes microbianas25, 73,74. Por exemplo, foi possível detectar e isolar bactérias degradantes de hidrocarbonetos de diferentes amostras de solo e sedimentos25,54,63,64,75. Finalmente, realizando pequenas modificações na mídia, microorganismos que não sejam bactérias podem ser facilmente selecionados como micróbios degradantes. Por exemplo, uma cepa de microalgas com a capacidade de degradar eficientemente compostos de estrogênio foi relatado76.
Idealmente, consórcios bioremediação-probióticos devem ser montados para cada composto ou área específica. Micróbios que crescem em um ambiente específico podem não crescer tão bem em novos locais em comparação com suas condições nativas. Como os pesquisadores não encontraram um produto que possa ser aplicado de forma eficiente em todas as diferentes condições ambientais, a nova montagem de consórcios deve ser realizada para cada situação específica. Isso seria semelhante à medicina personalizada para recuperação adaptada ao meio ambiente. Por esta razão, a criação de um banco central de cepas microbianas com potenciais características probióticas e capacidade de degradação é um passo crucial para o progresso deste campo. Esta iniciativa pouparia tempo e trabalho, contribuindo para a montagem de novos consórcios específicos em todo o mundo.
Microorganismos associados a corais (ou seja, microalgas, bactérias, arqueias, fungos e vírus) têm um papel complexo e intrincado na manutenção da homeostase hospedeira19. Estressores ambientais, como a poluição, também podem desestabilizar o microbioma coral, resultando em disbiose, que pode causar doenças e mortalidade30. Os mecanismos pelos quais o microbioma coral pode suportar a saúde dos corais estão começando a ser revelados. Esses mecanismos são a chave para a compreensão da resistência e resiliência dos corais aos estressores ambientais e, consequentemente, para promover a persistência e preservação dos recifes. Além disso, os achados na área ajudarão a entender as interações gerais de hospedeiro-microbioma, o que pode contribuir para o desenvolvimento de melhores probióticos e estratégias de promoção da saúde em outras áreas. Também é importante investigar melhor como essas inoculações de probióticos podem interferir na saúde do metaorganismo durante eventos de estresse. Por exemplo, o trabalho que mostra que o aumento no desempenho coral é devido aos probióticos e não simplesmente o coral usando bactérias como uma fonte de alimento é ainda necessário.
Paralelamente, o desenvolvimento de novas abordagens de entrega de consórcios e a melhoria dos já existentes são de grande importância. Métodos alternativos para a imobilização de consórcios, bem como abordagens inovadoras, como a inoculação de alimentos de coral (ou seja, artemia e rotifers) e usá-los como vetores, são promissores. Estes sistemas de entrega também podem ser modificados para atingir outros organismos marinhos e serão essenciais para o sucesso do campo dos probióticos marinhos.
Mitigação da poluição e persistência de recifes de coral são atualmente dois dos principais tópicos destacados em conferências ambientais regularmente. A Agenda 2030, um documento publicado pelas Nações Unidas que descreve os objetivos globais que a sociedade deve alcançar para permitir um futuro sustentável, dedica metas específicas para cada questão. Enquanto a Meta 6 destaca a importância da melhoria da qualidade da água, reduzindo a poluição, o Objetivo 14 reforça a relevância da conservação e do uso sustentável dos oceanos, mares e recursos marinhos77. Neste contexto, a conservação dos recifes de coral depende de mudanças que devem ser alcançadas em um futuro próximo, incluindo a mitigação da poluição. Isto é de grande importância, porque a maioria das perdas maciças de corais ocorreu quando outros fatores foram adicionados aos eventos climáticos, como a destruição do habitat local e contaminação78,79. Este artigo demonstrou que é possível combinar bioremediação e inoculação de pBMC para degradar poluentes específicos, enquanto pode aumentar a resistência e a resiliência dos corais para lidar com poluentes e outras questões. A otimização dos protocolos existentes e/ou o desenvolvimento de métodos inovadores, combinados ou aplicados de forma independente, será crucial para determinar o futuro dos ecossistemas marinhos.

A poluição é uma questão importante que afeta a saúde humana, animal e vegetal em todo o mundo. Embora a poluição possa ser natural, como cinzas vulcânicas1,as atividades humanas são a principal causa da maior parte da poluição. As atividades antropogênicas estão contaminando o solo, a água e o ar, que levam direta ou indiretamente a quase 20 milhões de mortes humanas prematuras2 e dizimam bilhões de outras formas de vida anualmente. Os poluentes estão presentes mesmo nas áreas mais remotas do planeta. Por exemplo, metais pesados e compostos orgânicos persistentes foram detectados em invertebrados do mar profundo e mamíferos polares, respectivamente3,4.
Os ambientes marinhos têm sido especialmente afetados pela poluição. Por um longo tempo, assumiu-se que o oceano permaneceria inalterado e forneceria uma fonte infinita de bens por causa de seu volume maciço de água5. Por esta razão, todos os tipos de indústria e instituições liberaram livremente resíduos em corpos d'água por séculos6,7. Vários contaminantes de todos os tipos, como plástico8, hormônios sintéticos9, pesticidas10, óleo11, nutrientes12,metais pesados3,e resíduos radioativos13 têm sido relatados como impactando ecossistemas oceânicos. Neste contexto, os recifes de coral estão entre os ecossistemas mais importantes e sensíveis em ambientes marinhos14. Os recifes são protetores costeiros, cruciais para o desenvolvimento de milhares de espécies marinhas, desempenhando papéis essenciais no ciclismo de nutrientes e no controle climático. Os recifes também contribuem para a economia, fornecendo peixe, bens e turismo, entre outros15. Por exemplo, 4,5 bilhões de pessoas dependem de peixes do oceano como sua principal fonte de alimento16, que são muito apoiadas por recifes de coral.
Independentemente da sua importância ecológica, social e económica, os recifes de coral estão a ser dizimados17,18. As atividades antropogênicas são as principais responsáveis por contribuir para as três principais causas da morte dos corais: mudanças climáticas, sobrepesca e poluição da água19. Mesmo que seja importante trabalhar na mitigação do aquecimento global, também é importante trabalhar na minimização da contaminação local, incluindo a poluição da água, que pode contribuir criticamente para o declínio dos corais20. Assim, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de estratégias para aumentar a vida útil dos corais, o que poderia proporcionar-lhes tempo extra para se adaptar e sobreviver.
A este respeito, é extremamente importante encontrar soluções para minimizar a contaminação e desenvolver estratégias para aumentar a aptidão dos corais. As estratégias para remediar os poluentes marinhos são altamente diversas e podem ser agrupadas em abordagens físicas, químicas e biológicas. Abordagens físicas são úteis. No entanto, nem sempre são eficientes. Por exemplo, os resíduos plásticos podem ser minimizados pela remoção física, enquanto os compostos solúveis em água precisam de outras metodologias para serem eliminados. Exemplos de tais compostos são o petróleo bruto, liberado pelas atividades e derramamentos da indústria do petróleo, bem como outros micropoluentes, como hormônios sintéticos, normalmente usados como componente estrogênioico em contraceptivos orais e presentes no esgoto21, 22. O uso de substâncias químicas para diminuir a contaminação pode resolver um problema específico, mas também pode representar uma fonte extra de poluição. Este é o caso dos dispersantes químicos para mitigar a contaminação por óleo, que têm sido descritos como ainda mais tóxicos para os ecossistemas marinhos do que a contaminação por óleo emsi 23. Por estas razões, as abordagens biológicas apresentam várias vantagens quando comparadas aos outros métodos. A bioremediação é a capacidade dos organismos vivos, ou seus produtos metabólicos, de transformar contaminantes em formas menos tóxicas ou não tóxicas24. As principais vantagens do uso de métodos biológicos são a sustentabilidade, o baixo custo relativo, o fato de serem ecologicamente amigáveis e que podem ser aplicadas em diferentes ecossistemas, causando impactos mínimos ou menores ao meio ambiente21, 25,26,27.
Além disso, a manipulação da comunidade microbiana presente em um ambiente permite uma vantagem potencial extra. Existem microbiomas associados aos hospedeiros e essenciais para a sua saúde. É sabido que esses microbiomas simbióticos associados são necessários para manter a homeostase hospedeira19. A manipulação desses microorganismos associados tem sido bem explorada para hospedeiros como plantas e mamíferos28,29,mas o uso de probióticos de corais ainda é novo15. Corais também hospedar, interagir com, e dependem de grandes e específicas populações de microorganismos para sobreviver19. O papel dessas comunidades microbianas na saúde e disbiose dos corais está estudo ativo, mas ainda está longe de ser totalmente compreendido30. Uma das hipóteses mais populares é chamada de hipótese probiótica coral. Sugere a existência de uma relação dinâmica entre microorganismos simbióticos e condições ambientais que provoca a seleção dos metaorganismos de corais mais vantajosos31. Com base nestainformação, foram propostos mecanismos probióticos potenciais fundamentais, bem como as estratégias de isolamento, manipulação e entrega de microrganismos benéficos para corais (BMCs) para vários fins, foram propostos32 e testados33. Essas características benéficas potenciais incluem resistência ao aumento da temperatura, proteção contra espécies reativas de oxigênio (ROS), fixação de nitrogênio, resistência a contaminantes e controle biológico contra patógenos, entre outros32.
Este estudo centra-se na seleção de BMCs e microorganismos de vida livre que apresentam a capacidade de degradar dois contaminantes comumente encontrados em ambientes marinhos: o estrogênio sintético 17a-ethinylestradiol (EE2) e petróleo bruto. Poluentes contendo agentes ativos hormonais estão frequentemente presentes nos corpos d'água34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Entre eles, compostos sintéticos estrogênicos eendócricos disruptores (EDCs) imitam a ação de estrogênios em células-alvo, causando vários impactos sobre os animais, incluindo câncer de mama, infertilidade e hermafrodita9. EE2 é excretado por seres humanos por causa do uso de contraceptivos orais. Não é retirado do esgoto pelas estações tradicionais de tratamento de águas residuais e tem efeitos negativos mesmo em concentrações muito baixas (por exemplo, ng/L ou μg/L)43,44,45. Pouco se sabe sobre os efeitos dos estrogênios na fisiologia dos corais46,47. No entanto, em outros invertebrados marinhos, como esponjas, crustáceos e moluscos, os estrogênios foram relatados para causar vários efeitos negativos relacionados principalmente à reprodução, como desenvolvimento e/ou estimulação de gametas, alteração em ações proteicas, problemas em processos embrionários, e outros48,49,50,51,52. As consequências negativas causadas pela contaminação pelo EE2 realçam a necessidade de desenvolver abordagens sustentáveis para remover este composto do ambiente sem afetar a vida marinha.
Paralelamente, com o petróleo atualmente representando quase 40% das fontes de energia consumidas no mundo53,contaminação crônica e derramamentos de óleo geralmente ocorrem perto das áreas de recife11. A contaminação por óleo foi relatada para causar efeitos negativos em várias espécies de animais marinhos, aves, plantas e seres humanos54,55,56,57. Nos corais, causa branqueamento, reduz a resistência das larvas ao estresse térmico58,interrompe as comunidades microbianas associadas21,e causa necrose do tecido. Além disso, dispersantes químicos, uma técnica de remediação de óleo comumente usada por empresas petrolíferas para corrigir derramamentos, são ainda mais tóxicos para os corais do que o próprio óleo23. Microorganismos benéficos isolados de corais, em contraste, são conhecidos por desempenhar papéis cruciais na saúde do hospedeiro. No entanto, a manipulação desses probióticos potenciais deve ser melhor explorada, a fim de investigar possíveis efeitos colaterais negativos e as capacidades metabólicas que podem ser rastreadas para melhorar a aptidão do metaorganismo. Neste contexto, características como a atividade antimicrobiana contra patógenos corais, a produção de catalase para combater o estresse oxidativo, a capacidade de degradar a urea (que pode ter papéis importantes no processo de calcificação) e a presença de genes que conferem potenciais características benéficas, entre outras, deve ser o foco da investigação. Aqui, mostramos como a bioremediação e os probióticos podem ser usados para mitigar concomitantemente os impactos da poluição e melhorar a saúde dos corais. O desenvolvimento de abordagens inovadoras que podem ser usadas como intervenções para aumentar a persistência de espécies marinhas representa um passo em direção a um planeta mais sustentável e saudável.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 mL PYREX Media Storage Bottle</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1743E20/1395-500</td>
			<td>Used to sample water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Aspirator Bottles</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1234B28/1220-2X</td>
			<td>Used to separate the oil fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-inch wire cutter plier</td>
			<td>thomas scientific/Restek</td>
			<td>1173Y64/23033</td>
			<td>Used to cut coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17a-Ethinylestradiol</td>
			<td>LGC Standards</td>
			<td>DRE-C13245100</td>
			<td>Used as the only carbon source to make the selective media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PCT0901-1KG</td>
			<td>Used to make solid media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell Haas Broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M350-500G</td>
			<td>Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td>
			<td>4882H35/26500-125</td>
			<td>Used to incubate coral macerate with glass beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28903470</td>
			<td>Used to purify PCR products before sending them for sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1177Q81/07DP1070</td>
			<td>Used to detach the microorganisms from coral structures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Needed to work at sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245-1KG</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M384-500G</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital-Shaker Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate liquid media and oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar and Pestle</td>
			<td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td>
			<td>1201U69/JMD150</td>
			<td>Used to macerate coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to centrifuge bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to measure optical density of bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Used for microbial strains DNA extraction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation

A poluição afeta todos os biomas. Os ambientes marinhos têm sido particularmente impactados, especialmente os recifes de corais, um dos ecossistemas mais sensíveis da Terra. Globalmente, 4,5 bilhões de pessoas dependem economicamente do mar, onde a maior parte de seus meios de subsistência é fornecida por recifes de corais. Os corais são de grande importância e, portanto, sua extinção leva a consequências catastróficas. Existem várias soluções possíveis para remediar poluentes marinhos e contaminação local, incluindo a bioremediação. A bioremediação é a capacidade dos organismos para degradar contaminantes. A abordagem apresenta várias vantagens, como sustentabilidade, custo relativamente baixo e o fato de que ela pode ser aplicada em diferentes ecossistemas, causando impactos mínimos ao meio ambiente. Como uma vantagem extra, a manipulação de microbiomas endógenos, incluindo microorganismos benéficos putativos para corais (pBMCs), pode ter efeitos probióticos para animais marinhos. Nesse contexto, o uso das duas abordagens, bioremediação e inoculação pBMC combinadas, poderia ser promissor. Esta estratégia promoveria a degradação de poluentes específicos que podem ser prejudiciais aos corais e outros metaorganismos, aumentando também a resistência e a resiliência dos hospedeiros para lidar com a poluição e outras ameaças. Este método centra-se na seleção de pBMCs para degradar dois contaminantes: o estrogênio sintético 17a-ethinylestradiol (EE2) e petróleo bruto. Ambos foram relatados para impactar negativamente animais marinhos, incluindo corais, e seres humanos. O protocolo descreve como isolar e testar bactérias capazes de degradar os contaminantes específicos, seguido por uma descrição de como detectar algumas características benéficas putativas desses micróbios associados ao seu hospedeiro de coral. As metodologias descritas aqui são relativamente baratas, fáceis de executar e altamente adaptáveis. Quase qualquer tipo de composto alvo solúvel pode ser usado em vez de EE2 e óleo.

Com base nos métodos descritos aqui, foi possível isolar microorganismos de diferentes fontes de água e nubbins de corais apresentando características putativas de BMC e capazes de degradar diferentes classes de contaminantes (Figura 1). Utilizando amostras de água coletadas em uma estação de tratamento de esgoto, obtidas da CESA-UFRJ (Centro Experimental de Saneamento Ambiental da Universidade Federal do Rio de Janeiro), e com base no procedimento apresentado aqui, 33 cepas bacterianas capazes de degradar o EE2 uma concentração final de 5mg/L foram isoladas(Figura 2A). Além disso, usando a técnica para a seleção de bactérias degradantes de óleo, 20 cepas capazes de degradar tanto oWSF (Figura 2B) e oWIF (Figura 2C)foram isoladas.
Características putativas de BMC foram selecionadas em microorganismos isolados de diferentes espécies de corais diversas condições. Entre eles, uma cepa que apresenta forte atividade antagônica contra o patógeno coral Vibrio coralliilyticus (Figura 3A),cepas capazes de degradar a ureia (Figura 3B), um bom produtor catalase (Figura 3 C),e microorganismos apresentando genes potencialmente benéficos(Figura 3D)foram encontrados.
Empregando as duas abordagens combinadas (ou seja, bioremediação e inoculação BMC), foi possível proteger os corais dos impactos da exposição ao petróleo. Para isso, um consórcio de biomídia de petróleo pBMC, isolado do coral Mussismilia harttii,foi inoculado em nubbins de coral expostos a 1% de óleo emtriplicados 21. Os tratamentos expostos ao óleo apresentaram diminuição progressiva da Fv/Fm a partir do quarto dia, atingindo valores próximos de zero até o décimo dia. Fluorescência variável/fluorescência máxima (Fv/Fm) forneceu uma medida de eficiência fotoquímica máxima do sistema fotológico II (PSII) das zooxanthellae, representando uma medida indireta da saúde dos corais. Por outro lado, os nubbins de coral presentes nos aquários inoculados com o consórcio mostraram uma capacidade fotoquímica mais bem preservada (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg"> Figura 1: Resumo dos principais passos de uma seleção e montagem do consórcio bioremediador-pBMC. Esquema de degradantes de poluentes microrganismos etapas de seleção (em cinza) e etapas finais utilizadas para a seleção microbiana do consórcio (sequenciamento de DNA, curva de crescimento, teste de antagonismo e montagem de consórcio em vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg"> Figura 2: Seleção de bactérias degradantes de poluentes. (A)Isolados bacterianos que crescem em placas mínimas de mídia contendo EE2 como a única fonte de carbono. (B) Colônias de bactérias que crescem em placas de mídia mínimas contendo oWSF como a única fonte de carbono. (C)Colônias de bactérias que crescem em placas de mídia mínimas contendo oWIF como a única fonte de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg"> Figura 3: Detecção de características do pBMC. (A) Manchas em triplicados de cepa apresentando atividade antagônica contra o patógeno coral Vibrio coralliilyticus (em preto) e uma cepa de controle (em verde). Tensõesque crescem na mídia contendo urea como a única fonte de carbono. (C)Tensão produzindo catalase (+) e uma estirpe produtor catalase ruim (-). (D)Exemplo de detecção de PCR do gene nirK (pista 1 = escada 1kb; pista 2 = controle negativo de extração de DNA em branco; pista 3 = detecção de nirK; pista 4 = reações pcr sem DNA modelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg"> Figura 4: Fv/Fm medições de M. harttii nubbins dark-adapted at 5 PM, using a diving-PAM chlorophyll fluorometer. As medições fv/fm do consórcio de controle de tratamentos, petróleo e petróleo com consórcio foram realizadas em triplicados todos os dias durante 10 dias. O desvio padrão é mostrado. As características do gráfico foram modificadas com permissão dos resultados anteriores21,disponíveis em https://www.nature.com/articles/srep18268 uma atribuição Creative Commons 4.0. Termos completos em http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Moa</td>
			<td>Microorganismo</td>
			<td>Técnica de detecção</td>
			<td>Referências</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Regulamentação climática; surfur ciclismo; compostos antimicrobianos; aumentar a proteção antioxidante das células.</td>
			<td>Aspergillus sydowii Aspergillus sydowii</td>
			<td>PCR para gene dddP</td>
			<td>81</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudovibrio sp. P12</td>
			<td>Meio de cultura com DMSP</td>
			<td>82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>PCR para o gene dmdA</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Regulação biológica de patógenos.</td>
			<td>Microbioma do muco do palmata de Acropora</td>
			<td>Zona clara de inibição</td>
			<td>83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extratos de corais</td>
			<td>Ensaio de inibição do crescimento</td>
			<td>84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Marinobacter sp.</td>
			<td>Swarming ensaios</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>Placa de ágar cruz-estrias</td>
			<td>86</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>Método de difusão de ágar</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Benefício para o processo de calcificação; fonte de nitrogênio para corais scleractinian.</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Método colorimétrico</td>
			<td>87</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbioma do muco de Stylophora pistillata</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbioma da Acropora alciminata</td>
			<td>Método por Bolland et al.80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Ciclo de nitrogênio; aumentar a fixação de nitrogênio.</td>
			<td>Comunidade microbiana</td>
			<td>qPCR QPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comunidade microbiana</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comunidade microbiana</td>
			<td>qPCR QPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comunidade microbiana</td>
			<td>Técnica de redução de acetileno adaptado (C2H2)</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas sp. e Halomonas taeanensis</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Ciclo de nitrogênio; diminuição da concentração de amônio.</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbioma de Tubastraea coccinea</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>94</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbioma de Xestospongia testudinaria</td>
			<td>Análise preditiva do metagenoma</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Proteção holobionte contra espécies reativas de oxigênio (ROS).</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp., Marina de Cobetia e Halomonas taeanensis</td>
			<td>Teste catalase</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex vermelho</td>
			<td>96</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio pelagius e Sync-chococcus sp.</td>
			<td>Método de peroxidase-escopoletin a rábano</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio Fischeri Vibrio fischeri</td>
			<td>Múltiplos métodos</td>
			<td>98</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Detecção de características putativas de BMC, mecanismo de ação (MOA), microorganismos relatados apresentando o potencial e a técnica utilizada s detectando a característica.

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Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

A poluição afeta todos os biomas. Os ambientes marinhos têm sido particularmente impactados, especialmente os recifes de corais, um dos ecossistemas mais sensíveis da Terra. A bioremediação é a capacidade dos organismos para degradar contaminantes. Aqui, descrevemos metodologias para isolar e testar micróbios que apresentam capacidade de bioremediação e potenciais características probióticas para corais.

Prospecção de cepas microbianas para desenvolvimento de bioremediação e probióticos para pesquisa e preservação de metaorganismos

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Podemos isolar e montar probióticos que podem tanto promover a saúde dos corais quanto, ao mesmo tempo, mitigar o impacto da poluição e que podem contribuir para a persistência de um recife no mundo em mudança. A abordagem de isolamento e triagem descrita pode ser usada para selecionar microrganismos que apresentem atividades metabólicas fundamentais, como a degradação de poluentes ou outras características benéficas para organismos marinhos, como corais. Este método pode ser aplicado para isolar microrganismos capazes de degradar quaisquer contaminantes.Além disso, outras fontes de material podem ser utilizadas em outras amostras ambientais, como plantas, solo, água, qualquer coisa. Estude a literatura e tente focar em cepas que podem ser boas candidatas para o seu propósito. Se possível, direcione os métodos de isolamento para essas cepas e evite patógenos conhecidos.E se você pretende usar um consórcio de bactérias, também é muito importante primeiro investigar se os membros do consórcio têm atividade antagônica uns contra os outros. Como os corais estão sob risco crescente de extinção, essa metodologia está começando a ser iniciada em todo o mundo e há a necessidade de disseminar e padronizar o método. Como alguns pesquisadores de corais não têm experiência com microbiologia convencional, é por isso que eles têm pedido frequentemente conselhos sobre como proceder com essa abordagem.Para começar, a partir de cada local de amostragem direcionado, use garrafas estéreis com tampas de parafuso para coletar 500 mililitros de água em triplicado. Se o processamento da amostra estiver acontecendo mais tarde, mantenha as garrafas a quatro graus Celsius. Use um par estéril de alicate e fórceps para cortar fragmentos de coral do mesmo local de amostragem das amostras de água.Enxágüe o fragmento de coral amostral usando 20 mililitros de solução salina estéril de 3% ou água do mar artificial para se livrar das bactérias livre-vivas da água do mar. Com fórceps, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril com uma tampa de parafuso contendo solução salina estéril. Usando fórceps e alicates estéreis, pesam cinco gramas de fragmentos de coral em placas estéreis de Petri em uma balança de pesagem.Transfira os cinco gramas de amostra de coral para uma argamassa estéril e macerá-la usando um pilão estéril. Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 25 mililitros de solução estéril de cloreto de sódio de 3% e 10 a 15 contas de vidro de 2,5 milímetros. Use 20 mililitros de solução salina estéril para lavar a argamassa no tubo para recuperar a quantidade máxima do macerado.Para separar microrganismos de diferentes compartimentos de corais, mantenha os frascos sob constante agitação em 150 vezes g durante 16 horas na temperatura da água do local de amostragem. Para selecionar bactérias, primeiro realize diluições seriais até 10 a nove negativos em solução salina estéril para amostras de corais e até 10 a seis negativos para amostras de água. A pipeta dilui para cima e para baixo cinco vezes antes de descartar a ponta.Então vórtice cada um. Vórtice as amostras por cinco segundos cada vez antes de realizar a próxima diluição serial. Pipeta 100 microliters de cada diluição em placas de Petri contendo 3% de cloreto de sódio lysogeny caldo médio e emplacê-los.Incubar as placas por um a três dias na temperatura alvo, por exemplo, 26 graus Celsius. Verifique as placas uma vez por dia. Selecione e isole as colônias apresentando morfologias de crescimento distintas em novas placas usando a técnica da placa de raia.Repita este passo quantas vezes necessário para ter colônias puras crescendo nas placas. Armazene os isolados a quatro graus Celsius ou em glicerol, conforme descrito no manuscrito. Para realizar o teste de capacidade de degradação EE2, escolha uma única colônia das placas frescas e inoculada em dois mililitros de meio LB estéril em um tubo.No caso de ser um estoque de glicerol, pegue 10 microliters de estoque bacteriano glicerol e listrado em placas de ágar LB. Incubar a 24 a 28 graus Celsius durante a noite para ter colônias únicas crescendo. Coloque o tubo contendo lb médio inclinado sob agitação constante a 150 vezes g a 24 a 28 graus Celsius durante a noite.Após o crescimento bacteriano, pelota as células centrifugando-as a 8.000 vezes g por oito minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. Para lavar o caldo LB restante, adicione dois mililitros de água salina para resuspensar as células.Repita a lavagem duas vezes para garantir que não haja vestígios de fonte de carbono. Inocular as células lavadas e resuspended em meio mínimo de cultura Bushnell Haas contendo EE2 como a única fonte de carbono. Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica em 600 nanômetros e nossa colônia formando unidades no meio ágar LB após 16 a 72 horas de incubação.Para preparar uma mídia mínima contendo uma fração solúvel em água de óleo e uma fração insolúvel de óleo-água como a única fonte de carbono, adicione 1-2% de petróleo bruto a 500 mililitros de água destilada estéril em um frasco de filtro contendo uma válvula na parte inferior. Mantenha o frasco sob agitação constante a 24 a 28 graus Celsius a 150 vezes g durante 48 horas. Depois disso, coloque o frasco em uma superfície estável e espere de 10 a 20 minutos para permitir que a fração solúvel e insolúvel separe.Em seguida, abra o frasco do filtro inferior para transferir a fração solúvel de água de óleo para um novo frasco estéril salvando a fração insolúvel óleo-água. Então prepare duas garrafas de Bushnell Haas agar mínimo médio. Autoclave-o.Combine com a fração solúvel em água de óleo como a única fonte de carbono a fazer 500 mililitros de ágar médio. Faça o mesmo com a fração insolúvel de água de óleo e transfira aproximadamente 25 mililitros de cada meio para placas individuais de Petri. Para isolar bactérias degradantes do óleo, reutilize amostras previamente diluídas e pipetas 100 microliters de cada diluição nas placas de Petri contendo meio de ágar e emplaque-as.Lembre-se de manter controles negativos para suas placas. Incubar os pratos por um a três dias na temperatura alvo e repetir os procedimentos de isolamento como anteriormente. Neste protocolo, os microrganismos foram isolados de diferentes fontes de água e nubbins de coral apresentando características putativas do BMC e capazes de degradar diferentes classes de contaminantes.Utilizando amostras de água coletadas em uma estação de tratamento de esgoto obtidas no Centro Experimental de Saneamento Ambiental da Universidade Federal do Rio de Janeiro, foram isoladas 33 cepas bacterianas capazes de degradar o EE2. Além disso, utilizando-se a técnica para a seleção de bactérias degradantes do óleo, 20 cepas capazes de degradar tanto a fração solúvel em óleo quanto a fração insolúvel em água de óleo foram isoladas. Características putativas do BMC foram rastreadas em microrganismos, entre elas uma cepa que apresentava forte atividade antagônica contra o patógeno de coral Vibrio cholerae lyticus, cepas capazes de degradar a ureia, um bom produtor de catalase, e microrganismos apresentando genes potencialmente benéficos foram encontrados.Empregando tanto a bioremediação quanto a inoculação do BMC, foi possível prever corais devido aos impactos da exposição ao óleo. Um consórcio de bioremediadores de petróleo da PBMC isolado do coral foi inoculado em nubbins de corais expostos a 1% de óleo. Mostrou uma melhor capacidade fotoquímica preservada em comparação com a saúde dos corais sem inoculação.Não deixe amostras em temperatura ambiente por muito tempo. Caso contrário, a comunidade microbiana pode mudar e micróbios relacionados a doenças podem superar outros. O petróleo bruto é tóxico.Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual apropriados ao trabalhar com este ou qualquer outro contaminante que você decida usar. A técnica pavimentou uma forma inovadora no campo da restauração de corais e a bioremediação oceânica pode potencialmente ser usada para minimizar os impactos econômicos, ecológicos e sociais causados pela mudança global.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Bioengenharia

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A lignina Down-regulação da<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason Análise lignina

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montagem e Rastreamento do Desenvolvimento de Comunidade Microbiana em uma Plataforma Microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Perfil metabólico para determinar efeitos bacteriáticos ou bacteriostáticos de novos produtos naturais usando microcalorimetria isotérmica

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Plataforma de Cultura de Órgãos do Segmento Anterior para Rastreamento de Lesões no Globo Aberto e Desempenho Terapêutico

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...