Name: prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Denna forskning genomfördes i samarbete med det pågående R & D-projektet som registrerades som ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP-undersökning av potentiella effekter orsakade av olje-och gasprospektering på djup havs marin holobionts och urval av potentiella bioindikatorer och bioremedieringsprocesser för dessa ekosystem "(UFRJ/Shell Brasil/ANP)-" PROBIO-DEEP-Levantamento de potenciais impactos causados Pela exploração de Óleo e Gás EM holobiontes Marinhos EM Mar Profundo e Seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para Esses ecossistemas ", sponsrad av Shell Brasil under ANP R & D Levy som" Compromisso de Investimentos com pesquisa e Desenvolvimento. Författarna tackar också Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) för ekonomiskt stöd, och Camila Messias, Phillipe Rosado, och Henrique Fragoso dos Santos, för de bilder som tillhandahålls.

1. uppsamling och lagring av vatten och korall för mikrobiell isolering
Anmärkning: det är viktigt att ta koordinaterna och temperaturen på provtagningsplatserna. Om möjligt kan metadata som salthalt, pH, djup och ljusintensitet också bidra till att hitta finjusterade odlingsmetoder och framtida tolkning av data. För tillförlitliga resultat, hålla proverna lagras för minsta möjliga tid. Vatten/korallmikrobiomerna kan förändras avsevärt om proverna inte hålls vid rätt temperatur och/eller lagras under långa perioder. Om isolerings steget inte utförs omedelbart efter insamlingen, är det viktigt att hålla proverna vid 4 ° c tills bearbetningen. Ju längre proverna lagras, även vid 4 ° c, desto mer kommer den mikrobiella gemenskapen att förändras.
<ol><li>Provtagning och lagring av havsvatten.<ol>
<li>Samla in 500 mL vattenprov i minst tre exemplar från varje riktad provtagningsplats. Använd gärna sterila flaskor med skruvlock.</li>
		<li>Om du bearbetar vattnet direkt efter insamling, förvara flaskorna på RT för ett kort intervall. Om prov bearbetningen sker senare, förvara flaskorna vid 4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prova och förvara koraller.<ol>
<li>Använd ett sterilt par tång för att skära korall fragment från samma provtagningsplats av vattenproverna. För att undvika kontaminering, rör koraller endast med sterila handskar.</li>
		<li>Skölj provet korall fragment med 20 mL steril saltlösning (3% NaCl i destillerat vatten) eller artificiell havsvatten för att bli av med löst bifogade fritt levande bakterier i havsvattnet.</li>
		<li>Med hjälp av pinps, placera varje korall fragment i en steril 250 − 500 mL behållare med ett skruvlock som innehåller steril saltlösning.</li>
		<li>I laboratoriet, med hjälp av sterila pinpett och tång, väg 5 g korall fragment med hjälp av sterila 100 mm x 20 mm petriskålar på en våg.</li>
		<li>Överför 5 g korall prov till en steril murbruk och lös upp det med hjälp av en steril mortelstöt.</li>
		<li>Överför det urlakade provet med en steril spatel till en steril odlings kolv som innehåller 45 mL 3% NaCl-steril lösning och 10 − 15 glaspärlor på 5 mm. Använd några av de 45 mL steril saltlösning för att tvätta murbruket och återvinna den maximala mängden av den macerate.</li>
		<li>Förvara flaskerna under konstant omrörning (150 x g) i 16 timmar vid provtagnings platsens vattentemperatur. Anmärkning: för grunt vatten koraller den optimala temperaturen kommer att variera från 24 − 28 ° c. Detta steg kommer att lossa mikroorganismer från olika korall fack, såsom de som är knutna till värdceller, eller de som lever inne i vävnaden och skelettet. Efter detta steg, koraller macerates bör inte lagras, och isolerings steget måste omedelbart utföras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolering av EE2-nedbrytande bakterier från havsvatten och/eller koraller
<ol><li>Välj bakterier. Anmärkning: efter steg 1.1.2 och 1.2.7 kommer koncentrationen av mikroorganismer i havsvatten som har lossnat från de olika korallmakeraterna att vara okänd och varierande. För att garantera isolering av enskilda mikrobiella kolonier i petriskålar som innehåller agarmedia behövs seriella utspädningar.<ol>
<li>Utför seriella utspädningar upp till 10-9 i steril saltlösning för korall-prover och upp till 10-6 för vattenprover. Pipettera spädningar upp och ner 5x innan du kastar spetsen. Vortex prover för 5 s varje gång innan du utför nästa serie utspädning.</li>
		<li>Pipettera över 100 μL av varje spädning på petriskålar som innehåller 3% NaCl lysogeny buljong (LB) agar medium, och platta dem. Obs: Använd Marine agar (MA) som ett alternativt medium. Tre exemplar av varje utspädning krävs för tillförlitliga resultat.</li>
		<li>Inkubera plattorna i 1 − 3 dagar vid måltemperaturen (t. ex. 26 ° c). Kontrollera plattorna en gång om dagen.</li>
		<li>Välj och isolera kolonierna som uppvisar distinkta tillväxt morfologier på nya plattor med hjälp av Streak plattan teknik. Upprepa detta steg så många gånger som behövs för att få rena kolonier som växer på plattorna.</li>
		<li>Om ingreppet inte omedelbart fortsätter till steg 2.3.1, förvara isolat vid 4 ° c eller i glycerol enligt beskrivningen i avsnitt 2,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered glycerol lager. Obs: detta steg är frivilligt och kan användas för långsiktig bakterie bestånd lagring.<ol>
<li>Välj enstaka kolonier från den färska plattan eller från plattorna som förvaras vid 4 ° c och Inokulera dem självständigt i 2 mL sterilt LB-medium.</li>
		<li>Placera rören under konstant omrörning (150 x g) vid 24 − 28 ° c över natten (på).</li>
		<li>Tillsätt 1 mL av bakterie kulturerna från steg 2.2.2 och steril glycerol till en slutlig koncentration på 20% till 2 mL cryovials.</li>
		<li>Lämna kryovialerna på vid 4 ° c.</li>
		<li>Placera glycerolbakterielagren vid-80 ° c tills det behövs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utför testet EE2-nedbrytbarhet.<ol>
<li>Aktivera isolat i LB buljong eller alternativ media. För detta, plocka en enda koloni från de färska plattorna eller plattan lagras vid 4 ° c, och Inokulera 2 mL sterilt LB medium. Om det är en glycerol lager, först strimma den på LB agar plattor och inkubera vid 24 − 28 ° c på att ha enstaka kolonier växer. Placera röret som innehåller LB medium lutande under konstant agitation (150 x g) vid 24 − 28 ° c på.</li>
		<li>Efter bakterietillväxt, pellet cellerna genom centrifugering dem vid 8 000 x g för 8 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och Pipettera försiktigt upp och ner, Omsuspendera cellerna i en lika stor volym (2 mL) saltvatten för att tvätta resterande LB-buljong.</li>
		<li>Upprepa steg 2.3.2 två gånger för att garantera att det inte finns några spår av kol källa, omåterupprepa cellerna i en lika mängd saltlösning. Till exempel, om det startades med en 2 mL kultur, Omsuspendera cellerna i en slutlig volym av 2 mL saltlösning.</li>
		<li>Inokulera de tvättade och återsuspenderade cellerna i minsta Bushnell Haas odlingsmedium (BH-buljong) som innehåller EE2 som den enda kol källan59. Anmärkning: EE2 löses i etanol vid en slutkoncentration på 5 mg/L i odlingsmediet. Gör ändringar av föroreningens typ och/eller koncentration vid behov.</li>
		<li>Bedöm bakterietillväxt med optisk densitet vid 600 Nm och/eller kolonier bildar enheter (CFU) på LB agar medium33, för 16 − 72 h av inkubering. Notera: Alternativt kan mikroorganismerna isoleras direkt på minimimedia som innehåller EE2, eller andra föreningar, som den enda kol källan. Detta steg skulle leda urvalet och undvika oönskad tillväxt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolering av oljenedbrytande bakterier från havsvatten och/eller koraller
<ol><li>Förbered minimimedia som innehåller en oljevattenlöslig fraktion (oWSF) och olja vatten-olöslig fraktion (oWIF) som enda kol källa21.<ol>
<li>Tillsätt 1 − 2% råolja till 500 mL sterilt destillerat vatten. Använd en filterkolv öppnad på botten för att ta den lösliga fraktionen ut utan att störa det övre skiktet av den olösliga fraktionen.</li>
		<li>Håll blandningen under ständig agitation vid 24 − 28 ° c vid 150 x g för 48 h.</li>
		<li>Placera filterkolven som innehåller råolje fraktionerna på en stabil yta och vänta i 10 − 20 minuter så att löslighet och olöslig fraktion skiljs åt.</li>
		<li>Överför oWSF till en ny steril kolv, spara oWIF genom att öppna botten filterkolven och ta ut den lösliga fraktionen.</li>
		<li>Använda alla oWSF återvinns i föregående steg (~ 400 mL), förbereda 1 L BH agar minimum medium som innehåller oWSF som enda kol källa.</li>
		<li>Använd oWIF kvar i kolven från steg 3.1.4, Förbered 1 L BH agar minimum medium innehållande oWIF som enda kol källa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolera oWSF-och oWIF-nedbrytande bakterier.<ol>
<li>Med hjälp av vatten och korall-Lös upp från steg 1.1.2 respektive 1.2.7 späds proverna upp till 10-6 i steril saltlösning enligt beskrivningen i steg 2.1.1.</li>
		<li>Pipettera 100 μL av varje spädning på petriskålar som innehåller BH-oWSF och BH-oWIF agar media och platta dem.</li>
		<li>Upprepa procedurerna som beskrivs i steg 2.1.3 till steg 2.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. urval av konsortiemedlemmar
<ol><li>Extrahera och sekvensera DNA för taxonomisk identifiering.<ol>
<li>Aktivera isolat som lagras i glycerol enligt beskrivningen i steg 2.3.1.</li>
		<li>Extrahera DNA med hjälp av en DNA-extraktion Kit (se tabell över material).</li>
		<li>Använd primers 27f (5 ′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ′) och 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ′) för amplifiering av 16S rRNA genen.</li>
		<li>Utför 50 μL PCR-reaktioner enligt följande protokoll: 5 μL 10X polymeras-buffert, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm av varje primer, 10 ng av genomiskt dna och 2,5 U av Taq DNA-polymeras. Lägg till negativa kontroller (dvs. tomma DNA-extraktioner och PCR-reaktioner utan mallDNA) för att säkerställa att det inte finns någon förorening.</li>
		<li>Ställ in följande termiska cykel steg: en första denatureringscykel vid 94 ° c i 4 min; 35 cykler vid 94 ° c i 1 min, följt av 50 ° c i 1 min, och 72 ° c för 2,5 min; en slutlig förlängnings cykel i 10 min vid 72 ° c.</li>
		<li>Kontrollera amplikon integritet i 1,2% aguppstod gel med 80 V.</li>
		<li>Gel renar proverna med hjälp av en gel renings sats (se tabell över material).</li>
		<li>Kvantifiera PCR-produkter med hjälp av en fluorometer.</li>
		<li>Skicka produkt för sekvensering. Anmärkning: för bättre taxonomiska klassificeringar rekommenderas Sanger-metoden60, eftersom det ger långa sekvenser. Universal primers 27f och 1492r kan användas för att förstärka nästan hela längden av 16S rRNA Gene61. Om contigs inte kan monteras med ett par primers, bör ett extra par i mitten av sekvensen övervägas.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestämma tillväxtkurvan.<ol>
<li>Aktivera isolat i glycerol lager från steg 2.2.5 som beskrivs i steg 2.3.1 men med 5 mL i stället för 2 mL.</li>
		<li>Tillsätt 1% (v/v) av den odlade 5 mL-kulturen från steg 4.2.1 i tre exemplar till en 250 mL kolv med 100 mL 3% LB-media. Se till att förbereda tripletter av en negativ kontroll (ingen inoculum) också.</li>
		<li>Placera kolvar i en inkubator under konstant omrörning (150 x g) vid 24 − 28 ° c.</li>
		<li>Ta 1 mL alikvoter var 4 h för 48 h. Om stammarna uppvisar en hög tillväxttakt, minska 4 h intervall.</li>
		<li>Mät den optiska densitetens (OD) uppskattning vid 600 Nm våglängd och kolonibildande enheter (CFU) räknat från seriella utspädningar pläterade på Rich Media Plates (100 μL bör vaccineras i varje tallrik och normaliseras till volymen av 1 mL).</li>
		<li>Rita OD och CFU kurvor och analysera sambandet mellan OD/CFU av varje enskild stam. Från och med nu beräknar du antalet celler baserat på OD-värdena.</li>
	</ol></li>
	<li>Utföra antagonism test.<ol>
<li>Aktivera isolat enligt beskrivningen i steg 2.3.1.</li>
		<li>Inokulera en stam i taget längs mitten av plattorna som innehåller agarmedia och de andra som är vinkelräta mot den centrala. Upprepa tills varje utvald mikrobiell stam testas mot alla andra.</li>
		<li>Inkubera plattorna vid 24 − 28 ° c och övervaka dem dagligen för att observera potentiella glorior som indikerar antagonistisk aktivitet. Om glorior observeras indikerar antagonistisk aktivitet mellan två stammar, bör en av dem uteslutas.</li>
	</ol></li>
	<li>Utför konsortiesammansättningen.<ol>
<li>Aktivera isolat enligt beskrivningen i steg 2.3.1.</li>
		<li>Pellets cellerna vid 3 500 x g och försiktigt tvätta dem 2x i en lika volym av saltlösning. Omsuspendera cellerna i en lika volym (dvs. om den slutliga volymen var 2 mL celler, tvätta dem med 2 mL saltlösning och Omsuspendera dem i en slutlig volym av 2 mL).</li>
		<li>Inokulera 1 mL kultur i 100 mL 3% NaCl LB medium och inkubera på vid 150 x g.
</li>
		<li>Upprepa steg 4.5.2, Inokulera de 100 mL odlade, tvättade och återsuspenderade kulturerna i 10 L kulturer. Inkubera i sterila luft-Lift bioreaktorer, ta emot filtrerad luft från en pump. Om mer kultur behövs, Inokulera alltid 1% av den odlade kulturen i färska medier.</li>
		<li>Centrifugera odlade kulturer vid 8 000 x g för 8 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten efter centrifugering.</li>
		<li>Tvätta pelleten, försiktigt omåterupplägga cellerna i 500 mL steril saltlösning.</li>
		<li>Upprepa steg 4.5.5 och 4.5.6.</li>
		<li>Omsuspendera varje enskild kultur i 100 mL saltlösning och mät OD för att uppskatta antalet celler.</li>
		<li>Beräkna volymen av varje kultur som behövs för att nå en slutlig koncentration av 107 celler ml-1.</li>
		<li>Utföra CFU räknas på Rich media för en slutlig bekräftelse av cellernas lönsamhet och koncentration.</li>
		<li>Blanda en lika volym av varje enskild kultur i sterila flaskor och alikvot konsortiet i 50 mL sterila rör.</li>
		<li>Håll vid 4 ° c till inympning. Anmärkning: Förbered konsortieförsamlingen så färskt som möjligt för att garantera att cellerna fortfarande är livskraftiga. Alternativt kan CFU-antal utföras före inympning. För att sätta ihop ett ideal konsortium är det nödvändigt att använda isolat som presenterar olika och kompletterande metaboliska kapaciteter. Vanligtvis används 6 − 10 isolat för att bilda konglomerat, men detta antal kommer att variera beroende på medlemmarnas egenskaper och syften.</li>
	</ol></li>
</ol>5. detektion av förruttande fördelaktiga egenskaper för koraller
<ol><li>Aktivera isolat från glycerollagren genom att strimmor dem på lb-agar plattor och inkuberar dem vid 24 − 28 ° c på att ha enstaka kolonier växer. Välj en enda koloni från plattorna och Inokulera den i 2 mL sterilt LB-medium. Placera röret som innehåller LB medium lutande under konstant agitation (150 x g) vid 24 − 28 ° c på.</li>
	<li>Utför DNA-extraktion enligt beskrivningen i avsnitt 4,1 för detektion av potentiellt nyttiga gener med PCR. Anmärkning: PCR-reaktionsförhållanden och primers kommer att bero på den riktade genen. Metoder för att testa BMC-egenskaperna hos enskilda stammar och PCR-detektion för potentiellt nyttiga gener beskrivs i tabell 1.</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Bioremediering metoder har kraftigt utforskats under de senaste 50 åren. Till exempel, över 200 mikrober bland bakterier, cyanobakterier, mikroalger, och svampar i flera olika livsmiljöer, har utsetts som kan indikera förekomst och/eller försämra olja kolväten62,63,64 . Dessutom är andra klasser av föreningar som orsakar påverkan på miljön och för människor, såsom plast, bisfenol A, hormonstörande ämnen, och tungmetaller, mål för bioremediering teknikutveckling65,66, 67. Å andra sidan, Marine probiotiska utveckling har begränsats till de områden som har en uppenbar inverkan på ekonomin, såsom fisk probiotika i vattenbruk68,69. Men isolering och karakterisering av nyttiga mikroorganismer för att skydda korallrev, marina ekosystem som stöder fiske, turism och andra lönsamma aktiviteter, börjar värderas15. Här, ett billigt, enkelt och lättillgängligt protokoll för att välja förorening-nedbrytande mikroorganismer som också kan presentera potentiellt gynnsamma egenskaper för lokala marina ekosystem, särskilt förmodade nyttiga mikroorganismer till koraller (pbmcs), är Beskrivs.
Dessutom, den metod som visas här är mycket anpassningsbar till flera föreningar och olika typer av mikrobiella källor. Det är möjligt att inrikta sig på olika föroreningar genom att ersätta den enda kol källan som tillförs minimimediet. För detta, i stället för olja eller EE2, andra föreningar bör läggas till den önskade koncentrationen. Detta skulle vara det selektiva trycket att isolera nedbrytare för de riktade föroreningarna. Till exempel har mikroorganismer som kan försämra andra klasser av hormonstörande ämnen redan valts ut och testats med samma metod70. Dessutom kan andra Marina och landlevande organismer, såsom svampar och växter71,72, samt olika typer av miljöprover, såsom jord, bränsle och bergarter användas som de förnedrande-mikrobiella källorna25, 73,74. Till exempel var det möjligt att upptäcka och isolera kolvätenedbrytande bakterier från olika jord-och sedimentprover25,54,63,64,75. Slutligen, utföra smärre ändringar i media, andra mikroorganismer än bakterier kan lätt väljas som förnedrande mikrober. Till exempel, en mikroalger stam med förmågan att effektivt försämra östrogen föreningar har rapporterats76.
Helst måste bioremediering-probiotiska konvaler monteras för varje specifik förening eller område. Mikrober som växer i en viss miljö kan inte växa lika bra på nya platser jämfört med deras inhemska förhållanden. Eftersom forskarna inte har funnit en produkt som effektivt kan appliceras under alla olika miljöförhållanden, bör nya konkatör utföras för varje specifik situation. Detta skulle vara besläktad med personlig medicin för miljöanpassad återhämtning. Av denna anledning är skapandet av en centralbank av mikrobiella stammar med potentiella probiotiska egenskaper och nedbrytning kapacitet ett viktigt steg för utvecklingen av detta område. Detta initiativ skulle spara tid och arbete och bidra till att församlingen för nya specifika konvaler över hela världen.
Mikroorganismer i samband med koraller (dvs., mikroalger, bakterier, Archaea, svampar, och virus) har en komplex och intrikata roll i att upprätthålla värd homeostas19. Miljömässiga stressfaktorer, såsom föroreningar, kan också destabilisera korallmikrobiomen, vilket resulterar i dysbios, som kan orsaka sjukdom och dödlighet30. De mekanismer genom vilka koraller mikrobiomet kan stödja korall hälsa börjar avslöjas. Dessa mekanismer är nyckeln till att förstå korall motstånd och motståndskraft mot miljömässiga stressfaktorer och, följaktligen, för att främja revet uthållighet och bevarande. Dessutom, resultat på området kommer att bidra till att förstå allmän värd-microbiome interaktioner, som kan bidra till utvecklingen av bättre probiotika och hälsofrämjande strategier inom andra områden. Det är också viktigt att bättre undersöka hur dessa probiotika vaccinationer kan störa metaorganismernas hälsa under stresshändelser. Till exempel, arbete som visar att förstoring i korall prestanda beror på probiotika och inte bara koraller med hjälp av bakterier som en näringskälla behövs fortfarande.
Parallellt med detta är utvecklingen av nya konvalörer och förbättringen av de befintliga konsortietörerna av stor betydelse. Alternativa metoder för konsortieimmobilisering samt innovativa metoder, som att vaccinera korallföda (dvs. Artemia och rotifers) och använda dem som vektorer, är lovande. Dessa leveranssystem kan också ändras för att rikta andra marina organismer och kommer att vara avgörande för framgången för den marina probiotika fältet.
Förorening minskning och korallrev uthållighet är för närvarande två av de viktigaste ämnena lyfts fram i miljökonferenser regelbundet. Agenda 2030, ett dokument som publicerats av FN och som beskriver de globala målen samhället bör nå för att möjliggöra en hållbar framtid, ägnar specifika mål för varje fråga. Medan mål 6 belyser vikten av förbättrad vattenkvalitet genom att minska föroreningarna, förstärker mål 14 betydelsen av bevarande och hållbar användning av haven, haven och marina resurser77. I detta sammanhang, korallrev bevarande beror på förändringar som bör uppnås inom en snar framtid, inklusive förorening minskning. Detta är av stor betydelse, eftersom de flesta massiva korall förluster inträffade när andra faktorer lades till klimathändelser, såsom lokala Habitat förstörelse och förorening78,79. Detta papper visade att det är möjligt att kombinera bioremediering och pBMC-inympning för att försämra specifika föroreningar, samtidigt som det kan öka korallens motståndskraft och motståndskraft mot föroreningar och andra frågor. Optimering av existerande protokoll och/eller utveckling av innovativa metoder, kombinerade eller oberoende tillämpade, kommer att vara avgörande för att fastställa framtiden för de marina ekosystemen.

Förorening är en viktig fråga som berör människors, djurs och växters hälsa i världen. Även om föroreningar kan vara naturliga, såsom vulkaniska aska1, är mänsklig verksamhet den främsta orsaken till de flesta föroreningar. Antropogena verksamhet förorenar jord, vatten och luft, som direkt eller indirekt leder till nästan 20 000 000 förtida dödsfall i människor2 och decimera miljarder andra former av liv årligen. Föroreningar är närvarande även i de mest avlägsna områden av planeten. Till exempel har tungmetaller och långlivade organiska föreningar upptäckts i djup havslevande ryggradslösa djur och Polar däggdjur, respektive3,4.
Marina miljöer har särskilt påverkats av föroreningar. Under en lång tid, det antogs att havet skulle förbli opåverkade och leverera en oändlig källa av varor på grund av dess massiva volym av vatten5. Av denna anledning, alla typer av industri och institutioner fritt släppt avfall i vattenförekomster i århundraden6,7. Flera föroreningar av alla slag, såsom plast8, syntetiska hormoner9, bekämpningsmedel10, olja11, näringsämnen12, tungmetaller3, och radioaktivt avfall13 har rapporterats som påverkar havsekosystem. I detta sammanhang är korallrev bland de viktigaste och mest känsliga ekosystemen i marina miljöer14. Rev är kust beskyddare, avgörande för utvecklingen av tusentals marina arter genom att spela viktiga roller i näringsämnen cykling och klimatkontroll. Reven bidrar också till ekonomin genom att erbjuda fisk, varor och turism, bland annat15. Till exempel, 4 500 000 000 människor är beroende av havsfisk som sin huvudsakliga födokälla16, som i hög grad stöds av korallrev.
Oavsett deras ekologiska, sociala och ekonomiska betydelse, är korallrev som decimerats17,18. Antropogena verksamhet är främst ansvarig för att bidra till de tre främsta orsakerna till koraller död: klimatförändringar, överfiske och vattenförorening19. Även om det är viktigt att arbeta med att mildra den globala uppvärmningen, är det också viktigt att arbeta på att minimera lokala föroreningar, inklusive vattenföroreningar, som kan kritiskt bidra till korall nedgång20. Därför finns det ett brådskande behov av att utveckla strategier för att öka korallernas livstid, vilket skulle kunna ge dem extra tid att anpassa sig och överleva.
I detta avseende är det oerhört viktigt att hitta lösningar för att minimera kontaminering och utveckla strategier för att öka konditionen av koraller. Strategier för att avhjälpa Marina föroreningar är mycket varierande och kan grupperas i fysikaliska, kemiska och biologiska metoder. Fysiska metoder är till hjälp. De är dock inte alltid effektiva. Till exempel kan plastavfall minimeras genom fysisk borttagning, medan vattenlösliga föreningar behöver andra metoder för att elimineras. Exempel på sådana föreningar är råolja, frigörs genom oljeindustrin verksamhet och spill, liksom andra mikroföroreningar, såsom syntetiska hormoner, som normalt används som östrogena komponenten i orala preventivmedel och finns i avloppsvatten21, 22. användningen av kemiska ämnen för att minska kontaminering kan lösa ett specifikt problem, men det kan också utgöra en extra föroreningskälla. Detta är fallet med kemiska dispergeringsmedel för att mildra oljeförorening, som har beskrivits som ännu mer giftigt för marina ekosystem än oljeföroreningen själv23. Av dessa skäl, biologiska metoder uppvisar flera fördelar jämfört med de andra metoderna. Biologisk sanering är förmågan hos levande organismer, eller deras metaboliska produkter, att omvandla föroreningar till mindre giftiga eller giftfria former24. De främsta fördelarna med att använda biologiska metoder är hållbarhet, relativ låg kostnad, det faktum att de är ekologiskt vänliga, och att de kan tillämpas i olika ekosystem, vilket orsakar minimal eller mindre påverkan på miljön21, 25,26,27.
Dessutom tillåter manipulering av den mikrobiella gemenskapen som finns i en miljö en extra potentiell fördel. Det finns mikrobiomer som är associerade med värdar och är viktiga för deras hälsa. Det är välkänt att dessa tillhörande symbiotiska mikrobiomer är nödvändiga för att bibehålla värd homeostas19. Manipuleringen av dessa associerade mikroorganismer har väl utforskats för värdar som växter och däggdjur28,29, men användningen av korall probiotika är fortfarande ny15. Koraller också värd, interagera med, och beror på stora och specifika populationer av mikroorganismer att överleva19. Den roll som dessa mikrobiella samhällen i hälsa och dysbios av koraller är under aktiv studie, men det är fortfarande långt ifrån helt förstått30. En av de mest populära hypoteser kallas Coral probiotiska hypotesen. Det antyder att det finns en dynamisk relation mellan symbiotiska mikroorganismer och miljöförhållanden som leder till valet av de mest fördelaktiga korallmetaorganismerna31. Baserat på denna information, viktiga potentiella probiotiska mekanismer, samt strategier för isolering, manipulation, och leverans av nyttiga mikroorganismer för koraller (BMC) för flera ändamål, föreslogs32 och testade33. Dessa potentiella nyttiga egenskaper inkluderar resistens mot temperaturökning, skydd mot reaktiva syreradikaler (ROS), kvävefixering, resistens mot föroreningar, och biologisk kontroll av patogener, bland annat32.
Denna studie fokuserar på valet av BMC och fritt levande mikroorganismer som presenterar möjligheten att försämra två föroreningar som vanligtvis finns i marina miljöer: den syntetiska östrogen 17a-etinylestradiol (EE2) och råolja. Förorenande ämnen som innehåller hormon aktiva substanser finns ofta i vattenförekomster34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Bland dem, syntetiska östrogena endokrina-disruptor föreningar (EDCs) efterlikna effekten av östrogener på målceller, orsakar flera effekter på djur, inklusive bröstcancer, infertilitet, och hermafroditism9. EE2 utsöndras av människor på grund av användningen av p-piller. Det tas inte bort från avloppsvatten av traditionella reningsverk och har negativa effekter även vid mycket låga koncentrationer (t. ex. ng/l eller μg/l)43,44,45. Lite är känt om effekterna av östrogener på korallfysiologi46,47. Emellertid, på andra Marina ryggradslösa djur, såsom svampar, kräftdjur och blötdjur, östrogener rapporterades orsaka flera negativa effekter främst relaterade till reproduktion, såsom utveckling och/eller stimulering av könsceller, förändring i enzymatisk och protein åtgärder, problem i embryonala processer, och andra48,49,50,51,52. De negativa konsekvenser som orsakas av EE2 förorening belysa nödvändigheten att utveckla hållbara metoder för att avlägsna denna förening från miljön utan att påverka det marina livet.
Parallellt med olja som för närvarande står för nästan 40% av världens förbrukade energikällor53, kronisk förorening och oljeutsläpp förekommer ofta nära revområden11. Oljeförorening rapporterades orsaka negativa effekter i flera arter av marina djur, fåglar, växter, och människor54,55,56,57. På koraller, det orsakar blekning, minskar motståndet av larver till termisk stress58, stör de mikrobiella associerade samhällen21, och orsakar vävnadsnekros. Dessutom kemiska dispergeringsmedel, en olja sanering teknik som vanligen används av oljebolag för att avhjälpa spill, är ännu mer giftiga för koraller än oljan själv23. Nyttiga mikroorganismer isolerade från koraller, däremot, är kända för att spela avgörande roller på värdens hälsa. Emellertid, manipulation av dessa potentiella probiotika måste utforskas bättre för att undersöka eventuella negativa biverkningar och den metaboliska kapacitet som kan undersökas för att förbättra konditionen av metaorganismen. I detta sammanhang, egenskaper såsom antimikrobiell aktivitet mot korallpatogener, produktion av katalas att bekämpa oxidativ stress, förmågan att försämra urea (som kan ha viktiga roller i förkalkning), och närvaron av gener som ger potentiella fördelaktiga egenskaper, bland annat, måste vara i fokus för utredning. Här visar vi hur bioremediering och probiotika kan användas för att samtidigt mildra effekterna av föroreningar och förbättra korallhälsan. Utvecklingen av innovativa metoder som kan användas som interventioner för att öka den marina arternas beständighet utgör ett steg mot en mer hållbar och hälsosammare planet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 mL PYREX Media Storage Bottle</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1743E20/1395-500</td>
			<td>Used to sample water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Aspirator Bottles</td>
			<td>thomas scientific/Corning</td>
			<td>1234B28/1220-2X</td>
			<td>Used to separate the oil fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-inch wire cutter plier</td>
			<td>thomas scientific/Restek</td>
			<td>1173Y64/23033</td>
			<td>Used to cut coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17a-Ethinylestradiol</td>
			<td>LGC Standards</td>
			<td>DRE-C13245100</td>
			<td>Used as the only carbon source to make the selective media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>PCT0901-1KG</td>
			<td>Used to make solid media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell Haas Broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M350-500G</td>
			<td>Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td>
			<td>4882H35/26500-125</td>
			<td>Used to incubate coral macerate with glass beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28903470</td>
			<td>Used to purify PCR products before sending them for sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1177Q81/07DP1070</td>
			<td>Used to detach the microorganisms from coral structures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Needed to work at sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M1245-1KG</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M384-500G</td>
			<td>Used as rich media to grow bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital-Shaker Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate liquid media and oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar and Pestle</td>
			<td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td>
			<td>1201U69/JMD150</td>
			<td>Used to macerate coral fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to centrifuge bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to measure optical density of bacterial cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Genomic DNA Purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Used for microbial strains DNA extraction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prospecting microbial strains for bioremediation and probiotics development for metaorganism research and preservation

Föroreningar påverkar alla biomer. Marina miljöer har särskilt påverkats, särskilt korallrev, ett av de känsligaste ekosystemen på jorden. Globalt, 4 500 000 000 människor är ekonomiskt beroende av havet, där de flesta av deras försörjning tillhandahålls av korallrev. Koraller är av stor betydelse och därför deras utrotning leder till katastrofala följder. Det finns flera möjliga lösningar för att avhjälpa Marina föroreningar och lokal förorening, inklusive biologisk sanering. Bioremediering är organismernas förmåga att försämra föroreningar. Metoden innebär flera fördelar, såsom hållbarhet, relativt låg kostnad, och det faktum att den kan tillämpas i olika ekosystem, vilket ger minimal påverkan på miljön. Som en extra fördel, manipulation av endogena mikrobiomer, inklusive förmodade nyttiga mikroorganismer för koraller (pbmcs), kan ha probiotiska effekter för marina djur. I detta sammanhang kan användningen av de två metoderna, bioremediering och pBMC-ympning kombineras, vara lovande. Denna strategi skulle främja nedbrytning av specifika föroreningar som kan vara skadliga för koraller och andra metaorganismer och samtidigt öka värd motståndet och motståndskraften för att hantera föroreningar och andra hot. Denna metod fokuserar på valet av pBMCs att försämra två föroreningar: den syntetiska östrogen 17a-etinylestradiol (EE2) och råolja. Båda har rapporterats negativt påverka marina djur, inklusive koraller, och människor. Protokollet beskriver hur man isolerar och testar bakterier som kan försämra de specifika föroreningarna, följt av en beskrivning av hur man upptäcker några förmodade fördelaktiga egenskaper hos dessa associerade mikrober till deras korall värd. De metoder som beskrivs här är relativt billiga, lätt att utföra, och mycket anpassningsbar. Nästan alla typer av lösliga mål förening kan användas i stället för EE2 och olja.

Baserat på de metoder som beskrivs här, var det möjligt att isolera mikroorganismer från olika vattenkällor och korall nubbiner presentera förmodade BMC egenskaper och kan försämra olika klasser av föroreningar (figur 1). Använda vattenprover som samlats in vid ett reningsverk, som erhållits från CESA-UFRJ (experimental Center of Environmental sanitet vid Federal University of Rio de Janeiro), och baserat på det förfarande som presenteras här, 33 bakteriestammar kan försämra EE2 vid en slutlig koncentration på 5mg/L isolerades (figur 2A). Dessutom, med hjälp av tekniken för att välja olje nedbrytande bakterier, 20 stammar kunna försämra både owsf (figur 2B) och owif (figur 2C) isolerades.
För mikroorganismer som isolerats från olika korallarter under olika förhållanden. Bland dem, en stam som presenterar stark antagonistisk aktivitet mot korallpatogen Vibrio coralliilyticus (figur 3a), stammar som kan försämra urea (figur 3B), en bra katalas producent (figur 3 C), och mikroorganismer som uppvisar potentiellt nyttiga gener (figur 3D) hittades.
Genom att använda de båda metoderna kombinerade (dvs. bioremediering och BMC-inympning) var det möjligt att skydda koraller från olje exponeringseffekter. För detta, en olja bioremediator pBMC Consortium, isolerade från Korallmussismilia harttii, inokulerades på korall nubbiner utsätts för 1% olja i tre exemplar21. De behandlingar som utsätts för olja presenterade en progressiv minskning av FV/FM från och med fjärde dagen och nådde värden nära noll med den tionde dagen. Variabel fluorescens/maximal fluorescens (FV/FM) som ett mått på maximal system II (psii) fotokemisk effektivitet zooxanthellae, vilket motsvarar en indirekt mätning av korall hälsa. Å andra sidan visade korall nubbiner i akvarierna inokulerade med konsortiet en bättre bevarad fotokemisk förmåga (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg"> Figur 1: Sammanfattning av de viktigaste stegen i en bioremediator-pBMC Consortium urval och montering. System för förorening-nedbrytande mikroorganismer urvals steg (i grått) och avslutande steg som används för det mikrobiella urvalet av konsortiet (DNA-sekvensering, tillväxtkurva, antagonism test och konsortiesammansättning i rött). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg"> Figur 2: urval av bakterier som försämrar föroreningen. Abakterie isolat som växer på minsta tillåtna material plattor som innehåller EE2 som enda kol källa. Bbakteriekolonier som växer på minimiskivor av media som innehåller owsf som enda kol källa. Cbakteriekolonier som växer på minimiskivor av media som innehåller oWIF som enda kol källa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg"> Figur 3: Påvisande av pBMC-egenskaper. (A) fläckar i tripletter av stam som presenterar antagonistisk aktivitet mot korallpatogen Vibrio coralliilyticus (i svart) och en kontroll stam (i grönt). B) stammar som växer på medier som innehåller karbamid som enda kolkälla. C) stam som producerar katalas (+) och en dålig katalas-producentstam (-). (D) exempel på PCR-detektion av Nirk-genen (Lane 1 = 1kb Ladder; Lane 2 = tom DNA-extraktion negativ kontroll; Lane 3 = Nirk Detection; Lane 4 = PCR-reaktioner utan mallDNA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg"> Figur 4: FV/FM mätningar av M. harttii nubbins Dark-anpassad på 5 PM, med hjälp av en dykning-pam klorofyll fluorometer. FV/FM mätningar av behandlingarna kontroll Consortium, olja och olja med konsortium utfördes i tre exemplar varje dag i 10 dagar. Standard avvikelsen visas. Dragen av grafen ändrades med tillstånd från tidigare resultat21, finns på https://www.Nature.com/articles/srep18268 under en Creative Commons Attribution 4,0. Fullständiga villkor på http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Moa</td>
			<td>Mikroorganism</td>
			<td>Detektionsteknik</td>
			<td>Referenser</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Klimatreglering. surfur Cykling; antimikrobiella föreningar; öka antioxidant skydd av celler.</td>
			<td>Aspergillus sydowii</td>
			<td>PCR för dddP-gen</td>
			<td>81</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudovibrio SP. p12</td>
			<td>Odlingssubstrat med DMSP</td>
			<td>82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas SP.</td>
			<td>PCR för dmdA-genen</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Biologisk reglering av patogener.</td>
			<td>Microbiome från Acropora Auktor slem</td>
			<td>Klar zon för hämning</td>
			<td>83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extrakt från koraller</td>
			<td>Tillväxthämmande analys</td>
			<td>84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Marinobacter SP.</td>
			<td>Swarming analyser</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas SP.</td>
			<td>Agarplate Cross-Streaking</td>
			<td>86</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas SP.</td>
			<td>Agar-diffusions metod</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fördel för förkalknings processen; källa till kväve för scleractinian koraller.</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Kolorimetrisk metod</td>
			<td>87</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbiome från Stylophora pistillata slem</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbiome från Acropora alciminata</td>
			<td>Metod av Bolland et al. 80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Kväve cykeln; öka kvävefixering.</td>
			<td>Mikrobiell gemenskap</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell gemenskap</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell gemenskap</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrobiell gemenskap</td>
			<td>Anpassad acetylen (C2H2) reduktions teknik</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pseudoalteromonas SP. och Halomonas taeanensis</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Kväve cykeln; minskning av ammoniumkoncentrationen.</td>
			<td>Pseudoalteromonas SP.</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbiome från Tubastraea coccinea</td>
			<td>Pcr</td>
			<td>94</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microbiome från Xestospongia Testudinaria</td>
			<td>Prediktiv Metagenomanalys-analys</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Holobiont skydd mot reaktiva syreradikaler (ROS).</td>
			<td>Pseudoalteromonas SP., Cobetia Marina och Halomonas taeanensis</td>
			<td>Katalas test</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex röd</td>
			<td>96</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio Pelagius och Sync-chococcus SP.</td>
			<td>Pepparrots peroxidas-scopoletin metod</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vibrio fischeri</td>
			<td>Flera metoder</td>
			<td>98</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: detektion av förruttande BMC-egenskaper, verkningsmekanism (MOA), rapporterade mikroorganismer som presenterar potentialen och tekniken som används för att detektera den karakteristiska.

Watch this Scientific Journal Video about Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation at JoVE.com

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Föroreningar påverkar alla biomer. Marina miljöer har särskilt påverkats, särskilt korallrev, ett av de känsligaste ekosystemen på jorden. Bioremediering är organismernas förmåga att försämra föroreningar. Här beskriver vi metoder för att isolera och testa mikrober presentera bioremediering förmåga och potentiella probiotiska egenskaper för koraller.

Prospektering mikrobiella stammar för bioremediering och probiotika utveckling för Metaorganismforskning och bevarande

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Vi kan isolera och montera probiotika som både kan främja korallhälsa och samtidigt mildra påverkan från föroreningar och som kan bidra till ett rev uthållighet i den föränderliga världen. Den isolerings- och screeningmetod som beskrivs kan användas för att välja mikroorganismer som presenterar viktiga metaboliska aktiviteter såsom nedbrytning av föroreningar eller andra nyttiga egenskaper för marina organismer som koraller. Denna metod kan tillämpas för att isolera mikroorganismer som kan bryta ned eventuella föroreningar.Och dessutom kan andra materialkällor användas i de andra miljöproverna som växter, mark, vatten, vad som helst. Studera litteraturen och försök att fokusera på stammar som kan vara bra kandidater för ditt syfte. Om möjligt, rikta isoleringsmetoderna för dessa stammar och undvik kända patogener.Och om du siktar på att använda ett konsortium av bakterier är det också mycket viktigt att först undersöka om medlemmarna i konsortiet har antagonistisk aktivitet mot varandra. Eftersom koraller är under ökande risk för utrotning, denna metod börjar startas över hela världen och det finns ett behov av att sprida och standardisera metoden. Eftersom vissa korall forskare har ingen erfarenhet av konventionell mikrobiologi, det är därför de har ofta ber om råd om hur man ska gå vidare med ett sådant tillvägagångssätt.Till att börja, från varje riktad provtagningsplats, använd sterila flaskor med skruvlock för att samla 500 milliliter vatten i tre exemplar. Om provbearbetning sker senare, håll flaskorna vid fyra grader Celsius. Använd en steril tång och tång för att skära korallfragment från samma provtagningsplats för vattenproverna.Skölj provet korallfragmentet med hjälp av 20 milliliter steril 3%saltlösning eller artificiellt havsvatten för att bli av med de löst fästa fri-levande bakterierna i havsvattnet. Med hjälp av tärna, placera varje korallfragment i en steril behållare med en skruvkork som innehåller steril saltlösning. Med hjälp av sterila tång och tång, väga fem gram korallfragment i sterila petriskålar på en våg.Överför de fem gram korallprovet till en steril mortel och macerate det med hjälp av en steril mortelstöt. Med hjälp av en steril spatel överför du det maceraterade provet till en steril odlingskolv innehållande 25 milliliter 3%natriumkloridsterillösning och 10 till 15 glaspärlor på 2,5 millimeter. Använd 20 milliliter steril saltlösning för att tvätta murbruket i röret för att återvinna den maximala mängden av macerate.För att lossa mikroorganismer från olika korallfack, håll kolvarna under konstant agitation på 150 gånger g i 16 timmar vid provtagningsplatsens vattentemperatur. För att välja bakterier, först utföra seriella utspädningar upp till 10 till de negativa nio i steril saltlösning för korallprover och upp till 10 till de negativa sex för vattenprover. Pipett späds upp och ner fem gånger innan spetsen kastas.Sedan virvel var och en. Vortexa proverna i fem sekunder varje gång innan du utför nästa serieutspädning. Pipett 100 mikroliter av varje spädning på Petri-rätter som innehåller 3%natriumkloridlysogeny buljong agar medium och platta dem.Inkubera plattorna i en till tre dagar vid måltemperaturen, till exempel 26 grader Celsius. Kolla plattorna en gång om dagen. Välj ut och isolera kolonierna som presenterar distinkta tillväxtmorfologier på nya plattor med hjälp av streckplattans teknik.Upprepa detta steg så många gånger som behövs för att ha rena kolonier växer på plattorna. Förvara isolaten i fyra grader Celsius eller i glycerol enligt beskrivningen i manuskriptet. För att utföra EE2 nedbrytningsförmåga test, plocka en enda koloni från de färska plattorna och inokulera i två milliliter sterila LB medium i ett rör.I fall det är en glycerol lager, ta 10 mikroliter av glycerol bakteriell lager och strimma på LB agar plattor. Inkubera vid 24 till 28 grader Celsius över natten för att få enstaka kolonier att växa. Placera röret som innehåller LB medium lutande under konstant agitation vid 150 gånger g vid 24 till 28 grader Celsius över natten.Efter bakterietillväxt, pellet cellerna genom centrifugering dem vid 8, 000 gånger g i åtta minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten. För att tvätta den återstående LB-buljongen, tillsätt två milliliter saltvatten för att återanvända cellerna.Upprepa tvätten två gånger för att garantera att det inte finns några spår av kolkälla. Inokulera de tvättade och återanvända cellerna i minsta Bushnell Haas odlingsmedium som innehåller EE2 som enda kolkälla. Bedöma bakterietillväxt genom optisk densitet vid 600 nanometer och vår koloni bildar enheter på LB agar medium efter 16 till 72 timmars inkubation.För att förbereda minimimedia som innehåller en olje-vattenlöslig fraktion och en olje-vatten olöslig fraktion som enda kolkälla, tillsätt 1-2%råolja till 500 milliliter sterilt destillerat vatten i en filterkolv som innehåller en ventil på botten. Håll kolven under ständig agitation vid 24 till 28 grader Celsius vid 150 gånger g i 48 timmar. Därefter placerar du kolven på en stabil yta och väntar 10 till 20 minuter så att den lösliga och olösliga fraktionen kan separeras.Öppna sedan bottenfilterkolven för att överföra olje-vattenlöslig fraktion till en ny steril kolv som sparar olje-vatten olösliga fraktionen. Förbered sedan två flaskor Bushnell Haas agar minimum medium. Autoklavera den.Kombinera med olje-vattenlösliga fraktionen som den enda kolkälla att göra 500 milliliter av agar medium. Gör samma sak med den olösliga fraktionen med olja och vatten och överför cirka 25 milliliter av varje medium på enskilda petriskålar. För att isolera oljenedbrytande bakterier återanvänder du tidigare utspädda prover och pipetter 100 mikroliter av varje spädning på Petri-diskarna som innehåller agarmedium och plåtar dem.Kom ihåg att hålla negativa kontroller för dina tallrikar. Inkubera disken i en till tre dagar vid måltemperaturen och upprepa isoleringsprocedurerna som tidigare. I detta protokoll var mikroorganismer isolerade från olika vattenkällor och korall nubbins presentera förmodade BMC egenskaper och kan försämra olika klasser av föroreningar.Med hjälp av vattenprover som samlats in vid ett reningsverk som erhållits från Experimental Center of Environmental Sanitation vid Federal University of Rio de Janeiro, isolerades 33 bakteriestammar som kunde bryta ned EE2. Dessutom, med hjälp av tekniken för att välja oljenedbrytande bakterier, 20 stammar kunna bryta ner både olja-vattenlöslig fraktion och olja-vatten olösliga fraktion isolerades. Putative BMC egenskaper var screenas i mikroorganismer, bland dem en stam presenterar starka antagonistiska verksamhet mot korall patogenen Vibrio cholerae lyticus, stammar kunna försämra urea, en bra katalas producent och mikroorganismer presenterar potentiellt fördelaktiga gener hittades.Med hjälp av både bioremediering och BMC-inokulering var det möjligt att förutsäga koraller från oljeexponeringseffekter. En olja bioremediator PBMC konsortium isolerade från korallen var inokuleras på korall nubbins utsätts för 1%olja. Det visade en bättre bevarad fotokemiska förmåga jämfört med korall hälsa utan inokulering.Lämna inte prover i rumstemperatur för länge. Annars kan det mikrobiella samhället förändras och sjukdomsrelaterade mikrober kan växa över andra. Råolja är giftigt.Var god se till att du använder lämplig personlig skyddsutrustning när du arbetar med denna eller någon annan förorening du bestämmer dig för att använda. Tekniken banade ett innovativt sätt inom korall restaurering och havet bioremediering kan potentiellt användas för att minimera ekonomiska, ekologiska och sociala effekter som orsakas av globala förändringar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartiklar för regenerativ forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedreglering av<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi och Klason lignin Analys

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreaktor för High Density Odling av olika mikrobiella samhällen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering och spårning av mikrobiell gemenskapsutveckling inom en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Förglasning i bulk för primär Hepatocytekonservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Metabolisk Profilering att bestämma bakteriedödande eller bakteriostatiska effekter av nya naturliga produkter med isotermisk mikrokalori

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Främre segment organkulturplattform för spårning av Open Globe-skador och terapeutisk prestanda

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...