Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل وزير دي سينسيا، Innovación y Universidades-Fund European Regional Development Fund، والاتحاد الأوروبي (AGL2016-77267-R، و AGL2015-74071-JIN)؛ المعهد الوطني للاستثمارات و تيكنولوجيا أغريا y أليمنتاريا (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00)؛ Gobierno de Aragón -European Social Fund, European Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad and Agroseguro S.A.

1. الذاتي (في) تحديد التوافق
<ol><li>تذوق الزهور في الحقل. فمن الضروري لجمع الزهور في مرحلة البالون (الشكل 1A)، المقابلة للمرحلة 58 على مقياس BBCH لامشمش28، لتجنب التلقيح السابق غير المرغوب فيها.</li>
	<li>
التلقيحات الذاتية والمتقاطعة في المختبر
	<ol>
<li>إز?...

تقليديا، معظم أصناف المشمش التجارية الأوروبية متوافقة مع36. ومع ذلك، فإن استخدام أصناف أمريكا الشمالية غير المتوافقة ذاتيا كوالدين في برامج التربية في العقود الماضية أدى إلى الإفراج عن عدد متزايد من أصناف جديدة غير متوافقة ذاتيا مع متطلبات التلقيح غير معروف7،...

عدم التوافق الذاتي هو استراتيجية من النباتات المزهرة لمنع التلقيح الذاتي وتعزيز outcrossing1. في Rosaceae، يتم تحديد هذه الآلية من قبل نظام عدم التوافق الذاتي Gametophytic (GSI) Sالتي يتم التحكم فيها أساسا من قبل متعدد الأراضي2. في الاسلوب ، جين RNase ترميز S - stylar المحدد ، RNase3، في حين أن بروتين F - مربع ، الذي يحدد S -حبوب اللقاح المحدد ، هو مقنن من قبل SFB الجينات4. يحدث التفاعل الذاتي عدم التوافق من خلال تثبيط نمو أنبوب حبوب اللقاح على طول النمط منع الإخصاب من البويضة5،6.
في المشمش ، وقد حدث تجديد varietal في جميع أنحاء العالم في العقدين الماضيين7،8. هذا التقديم لعدد هام من أصناف جديدة، من مختلف برامج التربية العامة والخاصة، أدى إلى زيادة أصناف المشمش مع متطلبات التلقيح غير معروف8.
وقد استخدمت منهجيات مختلفة لتحديد متطلبات التلقيح في المشمش. في مجال، الذاتي (في) التوافق يمكن أن تنشأ عن طريق التلقيحات التي تسيطر عليها في الأشجار في قفص أو في الزهور emasculated وتسجيل نسبة الفاكهة في وقت لاحقمجموعة 9،10،11،12. وبالإضافة إلى ذلك، وقد أجريت التلقيحات التي تسيطر عليها في المختبر من قبل شبه في ثقافة الجسم الحي من الزهور وتحليل سلوك أنبوب حبوب اللقاح تحت المجهر الفلوريسنس8،13،14،15،16،17. في الآونة الأخيرة، سمحت التقنيات الجزيئية، مثل تحليل PCR وتسلسله، بتوصيف علاقات عدم التوافق على أساس دراسة جينات RNase و SFB 18،19. في المشمش، ثلاثة وثلاثين S-أليليس تم الإبلاغ عن (S1 إلى S20، S22 إلى S30، S52، S53، Sv، Sx) ، بما في ذلك أليل واحد ذات صلة بالتوافق الذاتي (Sc)12،18،,2121،22،23،24. حتى الآن، 26 مجموعات عدم التوافق قد تم stablished في هذا النوع وفقا ل S-genotype8،,9،,17،,25،,26،,27. أصناف مع نفس S-alleles هي inter-incompatible، في حين أن أصناف مع واحد على الأقل مختلفة S-أليل، وبالتالي، المخصصة في مجموعات مختلفة غير متوافقة، هي inter-compatible.
لتحديد متطلبات التلقيح من أصناف المشمش، ونحن وصف منهجية التي تجمع بين تحديد الذاتي (في) التوافق بواسطة المجهر الفلوريس مع تحديد من S-الجيلية من قبل تحليل PCR في أصناف المشمش. ويسمح هذا النهج بإنشاء مجموعات عدم التوافق وتوضيح علاقات عدم التوافق بين الأصناف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

يتم تحديد عدم التوافق الذاتي في الوردية من قبل نظام عدم التوافق الذاتي (GSI) الذي يتم التحكم فيه بشكل رئيسي من قبل loallelic S. في المشمش ، وتحديد الذات وفيما بين (في) علاقات التوافق هو على نحو متزايد أهمية ، منذ الإفراج عن عدد كبير من أصناف جديدة قد أدى إلى زيادة أصناف مع متطلبات التلقيح غير معروف. هنا، نحن وصف منهجية التي تجمع بين تحديد الذاتي (في) التوافق عن طريق التلقيح باليد والمجهر مع تحديد من S-نوع جيني من قبل تحليل PCR. لتحديد التوافق الذاتي (في) ، تم جمع الزهور في مرحلة البالون من كل أصناف في الحقل ، ملقحات يدوي في المختبر ، ثابتة ، وملطخة باللون الأزرق الأنيلين لمراقبة سلوك أنبوب حبوب اللقاح تحت المجهر الفلوري. 10- ولإقامة علاقات عدم التوافق بين الأصناف، استُخرج الحمض النووي من كل صنف من أوراق الشجر الصغيرة، وتم تحديد الـS-alleles بواسطة PCR. ويسمح هذا النهج بإنشاء مجموعات عدم التوافق وتوضيح علاقات عدم التوافق بين الأصناف، مما يوفر معلومات قيمة لاختيار الملقحات المناسبة في تصميم البساتين الجديدة واختيار الآباء المناسبين في برامج التربية.

تتطلب دراسات التلقيح في المشمش استخدام الزهور في مرحلة البالون المتأخر قبل يوم واحد من التحلل(الشكل 1أ). وتعتبر هذه المرحلة الأكثر ملاءمة لكل من جمع حبوب اللقاح وpistil، منذ هياكل الأزهار هي ناضجة تقريبا، ولكن لم يحدث بعد anther dehiscence. وهذا يمنع تدخل حبوب اللقاح غير المر...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

نحن نقدم منهجية لتحديد متطلبات التلقيح من المشمش(Prunus أرمينياكا L.) أصناف الجمع بين تحديد الذاتي (في) التوافق بواسطة المجهر fluorescence مع تحديد النمط الجيني S من قبل تحليل PCR.

تحديد الذات والعلاقات بين (في) التوافق في المشمش الجمع بين تلقيح اليد والمجهر والتحليلات الوراثية

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد متطلبات التلقيح في أنواع مختلفة وإنشاء علاقات عدم التوافق بين الأصناف. والميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه يسمح بتقييم العديد من حالات عدم التوافق في ظل ظروف المختبر. تجنب المشاكل العديدة التي يمكن أن تحدث في التجارب التي يتم تنفيذها في ظل ظروف الميدان.وهذا يسمح بتحديد جنبا إلى جنب مع تكريس عدد من أصناف لجماعات عدم التوافق المقابلة. تحديد العلاقة بين التوافق بين الأصناف. هذا النهج يمكن أن تكون مفيدة أيضا لتحديد عدم التوافق الذاتي وعدم التوافق العلاقة في غيرها من المحاصيل شجرة الفاكهة مثل الكرز أو البرقوق.تبدأ بأخذ عينات من الزهور في هذا المجال. جمع الزهور في مرحلة البالون، الذي يتوافق مع المرحلة 58 على مقياس بي بي سي للمشمش لتجنب التلقيح السابقة. في المختبر، وإزالة الذرات من الزهور ووضعها على قطعة من الورق لتجف في درجة حرارة الغرفة.بعد 24 ساعة، غربال حبوب اللقاح مع غرامة 26 ملليمتر شبكة. Emasculate مجموعة من 30 الزهور في نفس المرحلة التنموية البالون لكل الذاتي وعبر التلقيح ووضع المسدسات على رغوة بائع الزهور في الماء بعد 24 ساعة من الإماهة والتلقح المسدسات باستخدام فرشاة الطلاء مع حبوب اللقاح من الزهور من نفس الأصناف. تلقيل مجموعة أخرى من مسدسات كل أصناف مع حبوب اللقاح من الزهور من ملقح متوافق كتحكم.بعد 72 ساعة، وإزالة المسدسات من رغوة بائع الزهور الرطب وإصلاح المسدسات في حل التثبيت من 3:1 الإيثانول لحمض الخليك لمدة 24 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية. ثم تجاهل المثبت وإضافة 75٪ الإيثانول، والتأكد من أن العينات مغمورة تماما في الحل. يمكن تخزين العينات في الإيثانول عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.تشتت حبوب اللقاح من نفس الأصناف المستخدمة في التلقيحات التحكم في ترسخ حبوب اللقاح المتوسطة ومراقبة لهم تحت المجهر بعد 24 ساعة. إعداد المسدسات للمجهر عن طريق غسلها 3 مرات بالماء المقطر لمدة ساعة واحدة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، اتركها في كبريتيد الصوديوم بنسبة 5٪، عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.ثم اطقم بها في كيلوغرام واحد لكل سنتيمتر مربع لمدة 10 دقائق في كبريتيت الصوديوم لتليين الأنسجة. ضع المسدسات المُلقّرة على شريحة زجاجية واستخدم مشرطًا لإزالة الـtrichomes حول المبيض. ثم اسحق المسدس بغطاء زجاجيتطبيق قطرة من aniline الأزرق على الاستعدادات لطخة ترسبات قاسية خلال نمو أنبوب حبوب اللقاح ومراقبة أنابيب حبوب اللقاح على طول النمط مع المجهر وفقا لاتجاهات المخطوطات. استخدام مجموعة تجارية لاستخراج الحمض النووي الجينومي من أوراق الشباب التي تم جمعها في فصل الربيع. ثم قم بإعداد PCR عن طريق الجمع بين الكواشف وفقًا لاتجاهات المخطوطات.دوامة مزيج التفاعل وتوزيعه بين الآبار في لوحة PCR. أضف 1 ميكرولتر من تخفيف الحمض النووي في كل بئر وتشغيل PCR باستخدام برنامج الدراجات الحرارية الموضحة في المخطوطة. بمجرد اكتمال التفاعل، تحليل النتائج باستخدام الكهرباء الشعرية أو agarose هلام الكهرباء.لكهربائيات الشعيرات الدموية إضافة 1 ميكرولتر من المنتج PCR في بئر لوحة القارئ جنبا إلى جنب مع 1 قطرة من الزيوت المعدنية لمنع تبخر المياه. ثم قم بإعداد لوحة الفصل بإضافة عازلة الفصل. استخدام البرمجيات التجارية لمحلل الجينات لإنشاء لوحة عينة جديدة وحفظ أسماء العينات لجميع الآبار على لوحة.ثم حدد طريقة التحليل وأدخل اللوحتين في محلل الجينات. املأ صفيف الشعيرات الدموية بالماء المقطر. تحميل هلام polyacrylamide خطي وانقر فوق تشغيل.إذا تحليل نتائج PCR مع جل الكهرباء، وإعداد جل agarose 1٪عن طريق حل agarose في الكهرباء تعمل العازلة وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم إضافة 4 ميكروليتر من وصمة عار حمض نووي إلى هلام ومزيج بلطف. إعداد علبة هلام مع مشط وتباطؤ صب هلام في منتصف مع الحرص على تجنب فقاعات.اترك الجل في درجة حرارة الغرفة حتى تتوطد تمامًا ، حوالي 30-45 دقيقة. ثم وضع في غرفة الكهرباء. قم بإزالة المشط واغطيه بمخزن 1x TAE.تحميل هلام مع سلم الحمض النووي تليها منتجات PCR مختلطة مع صبغة التحميل. ثم تشغيل الجل في 90 فولت لمدة 60-90 دقيقة حتى خط صبغة زرقاء في ما يقرب من 75٪ من حارة هلام. بمجرد اكتمال المدى، تصور هلام باستخدام transilluminator.وقد لوحظ نمو أنبوب اللقاح في التلقيح الذاتي وعبر عن طريق المجهر الفلوريس لتحديد النفس (في) التوافق لكل أصناف. اعتبرت أصناف كان في ذاتيّة يتعارض عندما [لقاح] أنابيب تمّ أوقفت نموّ و [سلف-ويف] عندما على الأقلّ واحدة لقاح أنبوب يبلغ القاعدة من الأسلوب. واستخدمت 5 تركيبات زوج التمهيدي لتحديد S-alleles باستخدام PCR في تركيبة مع الشعيرات الدموية أو جل الكهربائي.أولاً، تم تحديد S-alleles من خلال تضخيم أول S-RNase intron باستخدام زوج التمهيدي SRc. ثم تم تضخيم intron الثاني من RNase مع ثلاث مجموعات التمهيدي لتمييز S6، S9، S1، و S7 alleles. وتم تضخيم مناطق متغير V2 وHVB من جين SFB مع تعيين التمهيدي AprFBC8 لتحديد أليل Sc و S8.وبمجرد تحديد الـ S-alleles، يمكن إنشاء مجموعات مختلفة من عدم التوافق مع الأنماط الجينية التي تكون غير متوافقة. من المهم أن نتذكر أن استخدام التحكم في الكهرباء الشعرية، لأنها تستخدم نظام تحليل أجزاء التلقائي التي يمكن أن تقرير كأكثر الاختلافات في حجم جزء تسبب تحديد غير دقيقة أليل. وقد أدى الجمع بين الملاحظات المجهرية والتحليل الجيني إلى اتباع نهج مفيد للغاية لتحديد عدم التوافق الذاتي في المشمش وإقامة علاقات عدم التوافق بين الأصناف.عدم التوافق الذاتي هو الآن الرابط للسكان المحليين في المشمش. ويبدو أن تحديد العوامل ينطوي على ذلك. وينبغي تركيز الجهود في المستقبل على التصحُر الجيني لهذا التنوع في المشمش.وينتَجَد هذا النهج الوثائقي في معلومات قيِّمة من أجل الاختيار المناسب للنظيفات في البساتين التجارية وأنماط نمطية في برامج تربية المشمش. ويمكن استخدام نهج مماثل في المحاصيل المعمرة الخشبية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

تحليل النسب الخلية ودراسات وظائف الجينات عن طريق التوأم بقعة MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

القياس الكمي للتجديد الذاتي في ثقافات Murine ماموسفيري

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...