Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

这项研究由欧洲大学欧洲区域发展基金、欧洲联盟（AGL2016-77267-R）和AGL2015-74071-JIN部长资助;国家教育研究所和阿格拉里亚和阿利门塔研究所（RFP2015-00015-00，RTA2017-00003-00）;戈比耶诺·德拉贡-欧洲社会基金、欧洲联盟（格鲁波·康鲁达多A12_17R）、生物潜水基金会和Agroseguro S.A.

1. 自（内）兼容性确定
<ol><li>在田里品尝花。有必要在气球阶段采集花（图1A），与杏子28的BBCH刻度第58阶段相对应，以避免不必要的先前授粉。</li>
	<li>
实验室的自检和交叉授粉
	<ol>
<li>在气球阶段取出花的麻醉剂，放在一张纸上，在实验室温度下干燥。</li>
		<li>24小时后，使用细网（0.26毫米）筛分花粉颗粒（图1...

传统上，大多数商业杏欧洲品种是自我兼容的36。然而，在过去几十年中，在繁殖项目中，使用北美自我不兼容的培养品种作为父母，导致越来越多的新的自我不兼容的培养品种的释放，这些培养动物的授粉要求为77、8、37。8,37因此，确定杏培养素中的自兼容关系和相互兼容关系变得越来越重要。这在冬寒减?...

自我不相容是开花植物的一种策略，以防止自授，促进跨越1。在罗萨塞，这种机制是由一个游戏学自不相容系统（GSI）决定的，该系统主要由多环位点S22控制。在风格中，RNase基因编码S-stylar决定因素，RNase3，而决定S-花粉决定因素的F盒蛋白由SFB基因4编纂。自我不相容相互作用通过抑制花粉管生长的方式，防止卵管55，66的受精。
在过去二十年中，全世界都进行了品种更新， 7，,8.从不同的公共和私人育种项目引进了大量新的品种，导致杏培养品种增加，对未知授粉要求8。
使用不同的方法来确定杏的授粉要求。在现场，通过在笼子里的树木或被授精的花丛中进行对照授粉，然后记录水果集99、10、11、1210,11的百分比，12可以建立自（内）相容性。此外，在实验室中，通过半体内花卉培养和荧光显微镜下花粉管行为分析88、13、14、15、16、17，进行了控制授粉。,13,14,15,16,17最近，分子技术，如PCR分析和测序，允许在研究RNase和SFB基因18，19,19的基础上，对不相容关系进行表征。在杏中，有33个S-allee被报告（S1到S20，S S22到S30，S S52，S S53，S Sv，S Sx），包括一个与自我S兼容（Scc）12，18，20，21，22，23，24相关的等位基因。12,18,20,21,22,23,24截至目前，该物种已根据S-基因型,,8、9、17、25、26、279,17组，对该物种进行了25,26次不相容组。826具有相同S-等位基因的培养体是互不兼容的，而具有至少一个不同 S-alleleS的培养器，因此，在不同的不兼容组中分配，是相互兼容的。
为了确定杏培养的授粉要求，我们描述了一种方法，将荧光显微镜的自（in）相容性测定与杏仁培养体中PCR分析的S-基因型的识别相结合的方法。这种方法允许建立不兼容组，并阐明品种之间的不相容关系。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

罗萨塞的自不相容性是由一种主要由多环位点S控制的Game-phy-s不兼容系统（GSI）决定的。在杏中，确定自和（在）兼容性关系变得越来越重要，因为大量新的培养素的释放导致具有未知授粉要求的培养品种的增加。在这里，我们描述了一种方法，将通过手工授粉和显微镜确定自（in）相容性与通过PCR分析识别S-基因型的方法相结合。为了进行自我（in）相容性测定，从每个品种的气球阶段收集花在野外，在实验室手工授粉，固定，并沾上含艾琳蓝，以观察荧光显微镜下的花粉管行为。为了建立品种之间的不相容关系，从幼叶中提取了每个品种的DNA，通过PCR鉴定了S-等位物。这种方法允许建立不相容组，阐明品种之间的不相容关系，这为在设计新果园时选择合适的授粉器和在育种计划中选择合适的父母提供了有价值的信息。

杏的授粉研究要求在麻醉前一天在晚期气球阶段使用花（图1A）。这个阶段被认为是最有利的花粉和皮酸收集，因为花卉结构几乎成熟，但蚂蚁脱发尚未发生。这可以防止不想要的花粉的干扰，不仅来自同一朵花的花粉，而且来自其他花，因为封闭的花瓣会阻碍携带外部花粉的昆虫的到来。花粉颗粒很容易通过细网（图1B）从?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

本文提出了一种方法，将荧光显微镜的自（in）相容性与通过PCR分析识别S-基因型相结合的方法，确定杏（Prunus亚美尼亚卡L.）的授粉要求。

杏中自体和（内）相容关系的确定结合手授、显微镜和遗传分析

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

这种方法有助于确定不同物种的授粉要求，并建立品种之间的不相容关系。这种方法的主要优点是，它允许在实验室条件下评估几种不相容性。避免在野外条件下进行的实验中可能发生的许多问题。这允许识别以及将一些邪教奉献给相应的不相容组。确定品种之间的兼容性关系。这种方法也可用于确定其他果树作物（如樱桃或李子）中的自不相容性和不相容性。首先在田野里品尝花朵。在气球阶段收集花，这相当于在BBCH尺度上为杏子的第58阶段，以避免以前的授粉。在实验室中，取出花的香，放在一张纸上，在室温下晾干。24小时后，用细小的26毫米网对花粉颗粒进行筛分。在同一气球发育阶段，将30朵花用于每个自授和交叉授粉，并在消瘦后24小时将手枪放在水中的花束泡沫上，用油漆刷将手枪与来自同一品种的花粉进行授粉。用兼容授粉剂的花粉粉粉给每个品种的另一套手枪， 作为控制。72小时后，从湿花店泡沫中取下手枪，将手枪固定在3：1乙醇的固定溶液中，在4摄氏度下至少24小时使用醋酸。然后丢弃固定材料并加入75%乙醇，确保样品完全浸入溶液中。样品可以储存在乙醇在4摄氏度，直到使用。在凝固花粉发芽介质中散开用于控制授粉的相同品种的花粉颗粒，并在24小时后在显微镜下观察。用蒸馏水洗3次，每次洗涤1小时，准备显微镜手枪。最后一次洗涤后，在4摄氏度下将它们留在5%的亚硫酸钠中24小时。然后用硫酸钠在每厘米一公斤的平方下进行10分钟的解菌，以软化组织。将自动洗除手枪放在玻璃滑梯上，用手术刀取出卵巢周围的三叶肌。然后用盖板把手枪压扁。在准备剂上涂抹一滴黑色素，在花粉管生长过程中染色无情的沉积，并根据手稿指示用显微镜观察花粉管沿样式。使用商业工具包从春天收集的幼叶中提取基因组DNA。然后根据手稿方向组合试剂，建立PCR。涡流混合并分配在PCR板的孔中。将 1 微升的 DNA 稀释到每个井中，并使用手稿中概述的热循环程序运行 PCR。一旦反应完成，使用毛细管电泳或阿加罗斯凝胶电泳分析结果。毛细管电泳将 PCR 产品 1 微升添加到读卡器板的井中，以及 1 滴矿物油，以防止水蒸发。然后通过添加分离缓冲器来准备分离板。使用基因分析仪的商业软件创建新的样品板，并保存板上所有孔的样本名称。然后选择分析方法，将两个板插入基因分析仪。用蒸馏水填充毛细管阵列。加载线性聚丙烯酰胺凝胶并单击运行。如果使用凝胶电泳分析PCR结果，则根据手稿指示在电泳运行缓冲液中溶解阿加罗斯，以准备1%的加糖凝胶。然后将4微升的核酸污渍加入凝胶中，轻轻混合。用梳子设置凝胶托盘，减速将凝胶倒在中间，注意避免气泡。将凝胶留在室温下，直到完全凝固，约30-45分钟。然后放入电泳室。拆下梳子，用 1x TAE 缓冲器盖住它。用脱氧核糖核酸梯装载凝胶，然后将 PCR 产品与装载染料混合。然后以 90 伏运行凝胶 60-90 分钟，直到蓝色染料线处于凝胶通道的大约 75% 。运行完成后，使用透发光器可视化凝胶。通过荧光显微镜观察自授和交叉授粉的花粉管生长，以确定每个品种的自我（在）兼容性。当花粉管生长被逮捕时，当至少一个花粉管到达该样式的基础时，培养被认为是自不兼容的。5 个质剂对组合用于使用 PCR 与毛细管或凝胶电泳结合识别 S-等位基因。首先，使用SRC底原线对扩增第一个S-RNase intron，确定了S-等位基因。然后，RNase 的第二个内子被放大，用三个底原集来区分 S6、S9、S1 和 S7 等位基因。SFB基因的V2和HVB可变区域被放大，使用APRFBC8底法来识别Sc和S8等位基因。一旦S-等位基因被识别出来，就可以建立与相互不兼容的基因型不同的不相容组。重要的是要记住在毛细管电泳中使用控制，因为它们使用自动碎片分析系统，可以报告碎片大小的更多差异，导致等位基因识别不准确。显微镜观察和基因分析的结合产生了一种非常有用的方法，可以确定杏子的自不相容性，并建立品种之间的不相容关系。自我不相容现在与杏中当地人的联系。似乎涉及因素的确定。今后的努力必须集中在杏中这种品种的遗传教育上。这种文献方法的结合为商业果园中适当选择品种和杏育种计划中的模式基因型提供了宝贵的信息。类似的方法可用于其他木本多年生作物。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

心肌细胞DNA的合成和倍性的同时评价：一个方法来帮助心肌细胞再生和营业额的量化

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

科研

发育生物学

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

结合活体荧光显微镜 (IVFM) 和遗传模型研究造血细胞对骨髓生态位的植入动力学

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

细胞周期变化的可视化和核测定心肌出生后

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

人心脏组织对细胞外基质自组装水凝胶的处理体外和体内应用

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

用于在大容量中查找特定细胞目标的串行剖面的多模式分层成像

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

用扫描电镜和全贴免疫荧光技术可视化小鼠胚胎中的节点和外型板

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

亚细胞分辨率的各向同性光片显微镜及细胞自动动力学分析

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

鼠乳层文化中自我更新的量化

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...