Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R en AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Europees Sociaal Fonds, Europese Unie (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad en Agroseguro S.A.

1. Zelf-(in)compatibiliteitsbepaling
<ol><li>Proef de bloemen in het veld. Het is noodzakelijk om de bloemen te verzamelen op ballonstadium(figuur 1A), overeenkomend met fase 58 op de BBCH-schaal voor abrikoos28, om ongewenste eerdere bestuiving te voorkomen.</li>
	<li>
Zelf- en kruisbestuivingen in het laboratorium
	<ol>
<li>Verwijder de anthers van de bloemen op ballon stadium en leg ze op een stuk papier te drogen op laboratorium...

Traditioneel, de meeste commerciële abrikozen Europese cultivars waren zelf-compatibel36. Niettemin heeft het gebruik van Noord-Amerikaanse zelfonverenige cultivars als ouders in fokprogramma's in de afgelopen decennia geresulteerd in de release van een toenemend aantal nieuwe zelfonverenige cultivars met onbekende bestuivingsvereisten7,8,37. Zo wordt de bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsre...

Zelf-incompatibiliteit is een strategie van bloeiende planten om zelfbestuiving te voorkomen en outcrossing te bevorderen1. In Rosaceae wordt dit mechanisme bepaald door een Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) dat voornamelijk wordt gecontroleerd door de multiallelic locus S2. In de stijl codeert het RNase-gen de S-stylar determinant, een RNase3, terwijl een F-box eiwit, dat de S-pollendeterminant bepaalt, wordt gecodificeerd door het SFB-gen 4. De zelf-onverenigbaarheid interactie vindt plaats door de remming van pollen buis groei langs de stijl het voorkomen van de bevruchting van de ovule5,6.
In abrikoos, een ras vernieuwing heeft plaatsgevonden wereldwijd in de afgelopen twee decennia7,8. Deze introductie van een belangrijk aantal nieuwe cultivars, uit verschillende publieke en private veredelingsprogramma's, heeft geresulteerd in de toename van abrikozencultivanten met onbekende bestuivingsvereisten8.
Verschillende methoden zijn gebruikt om de bestuivingsvereisten in abrikoos te bepalen. In het veld kan zelf-(in)compatibiliteit worden vastgesteld door gecontroleerde bestuivingen in gekooide bomen of in ontlaste bloemen en vervolgens het percentage fruitset9,10,,11,12registreren . Bovendien zijn in het laboratorium gecontroleerde bestuivingen uitgevoerd door een semi-in vivo bloementeelt en analyse van het gedrag van de pollenbuis onder fluorescentiemicroscopie8,13,14,15,16,17. Onlangs hebben moleculaire technieken, zoals PCR-analyse en sequencing, de karakterisering van onverenigbaarheidsrelaties mogelijk gemaakt op basis van de studie van de RNase- en SFB-genen 18,19. In abrikoos zijn drieëndertig S-allelen gemeld (S1 tot S20, S22 tot S30, S52, S53, Sv, Sx), inclusief één allel in verband met zelfcompatibiliteit (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Tot nu toe zijn 26 onverenigbaarheidsgroepen bij deze soort ge stablished volgens het S-genotype S8,9,,17,25,26,27. Cultivars met Sdezelfde S-allelen zijn onderling onverenigbaar, terwijl cultivars met ten minste één verschillend S-allelen bijgevolg in verschillende onverenigbare groepen intercompatibel zijn.
Om de bestuivingsvereisten van abrikozencultivivars te definiëren, beschrijven we een methodologie die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse in abrikozencultivivars. Deze aanpak maakt het mogelijk om incompatibiliteitsgroepen vast te stellen en incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars op te helderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Zelf-incompatibiliteit in Rosaceae wordt bepaald door een Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) dat voornamelijk wordt gecontroleerd door de multiallelic locus S. In abrikoos wordt de bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties steeds belangrijker, omdat het vrijkomen van een belangrijk aantal nieuwe cultivars heeft geleid tot de toename van cultivars met onbekende bestuivingsvereisten. Hier beschrijven we een methodologie die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit met handbestuivingen en microscopie combineert met de identificatie van het S-genotypedoor PCR-analyse. Voor zelf-(in)compatibiliteitsbepaling werden bloemen in het ballonstadium van elke cultivar verzameld in het veld, met de hand bestoven in het laboratorium, vast, en gekleurd met anilineblauw voor de observatie van pollenbuisgedrag onder de fluorescentiemicroscopie. Voor het tot stand brengen van onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars werd DNA van elke cultivar uit jonge bladeren gehaald en werden S-allelesgeïdentificeerd door PCR. Deze aanpak maakt het mogelijk om incompatibiliteitsgroepen vast te stellen en incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars op te helderen, wat een waardevolle informatie biedt om geschikte bestuivers te kiezen bij het ontwerpen van nieuwe boomgaarden en om geschikte ouders in fokprogramma's te selecteren.

Bestuivingsstudies bij abrikoos vereisen het gebruik van bloemen in het late ballonstadium een dag voor de anthese(figuur 1A). Deze fase wordt beschouwd als de meest gunstige voor zowel stuifmeel en stamper collectie, omdat florale structuren zijn bijna volwassen, maar anther dehiscence is nog niet opgetreden. Dit voorkomt de interferentie van ongewenste pollen, niet alleen van stuifmeel van dezelfde bloem, maar ook van andere bloemen, omdat de gesloten bloemblaadjes de koms...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

We presenteren een methodologie om de bestuivingsvereisten van abrikoos(Prunus armeniëca L.) cultivars vast te stellen die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineren met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse.

Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Deze methode kan helpen bij het bepalen van bestuivingsvereisten bij verschillende soorten en het tot stand brengen van onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk maakt om verschillende onverenigbaarheid onder laboratoriumomstandigheden te evalueren. Het vermijden van de vele problemen die kunnen optreden in experimenten uitgevoerd onder veldomstandigheden.Dit maakt identificatie mogelijk samen met toewijding van een aantal cultivar aan de overeenkomstige onverenigbaarheidsgroepen. Het bepalen van de intercompatibiliteitsrelatie tussen cultivars. Deze aanpak kan ook nuttig zijn om zelf-onverenigbaarheid en onverenigbaarheid relatie in andere fruitboom gewassen zoals kersen of pruim te bepalen.Begin met het proeven van de bloemen in het veld. Verzamel de bloemen op ballonstadium, die overeenkomt met fase 58 op de BBCH-schaal voor abrikoos om eerdere bestuiving te voorkomen. In het laboratorium, verwijder de anthers van de bloemen en leg ze op een stuk papier te drogen bij kamertemperatuur.Na 24 uur zeef je de stuifmeelkorrels met een fijn gaas van 26 millimeter. Emasculate een groep van 30 bloemen op dezelfde ballon ontwikkelingsfase voor elke zelf-en kruisbestuiving en plaats de pistolen op bloemist schuim in water 24 uur na emasculatie en bestuiven de pistolen met behulp van een verfborstel met stuifmeel van bloemen van dezelfde cultivar. Bestuiven een andere set pistolen van elke cultivar met stuifmeel van bloemen van een compatibele bestuiver als een controle.Na 72 uur, verwijder de pistolen van de natte bloemist schuim en bevestig de pistolen in een fixatieve oplossing van 3:1 ethanol tot azijnzuur voor ten minste 24 uur op 4 graden Celsius. Gooi vervolgens de fixatieve en voeg 75% ethanol, ervoor te zorgen dat monsters volledig worden ondergedompeld in de oplossing. Monsters kunnen worden opgeslagen in de ethanol op 4 graden Celsius tot gebruik.Verstrooi de stuifmeelkorrels van dezelfde cultivars die worden gebruikt voor de bestuivingen in gestold stuifmeelkiemingsmedium en observeer ze na 24 uur onder de microscoop. Bereid de pistolen voor microscopie door ze 3 keer te wassen met gedestilleerd water gedurende een uur per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, laat ze in 5% natriumsulfaat op 4 graden Celsius voor 24 uur.Dan autoclave ze op een kilogram per centimeter kwadraat gedurende 10 minuten in natriumsulfaat om het weefsel te verzachten. Plaats de autoclaved pistolen over een glazen glijbaan en gebruik een scalpel om de trichomen rond de eierstok te verwijderen. Dan squash het pistool met een coverglass.Breng een druppel anilineblauw over de preparaten aan om eeltige afzettingen te bevlekken tijdens de groei van de pollenbuis en observeer de pollenbuizen langs de stijl met een microscoop volgens de handschriftaanwijzing. Gebruik een commerciële kit om genomisch DNA te extraheren uit jonge bladeren verzameld in het voorjaar. Stel pcr vervolgens in door reagentia te combineren volgens de handbeschrijvingen van het manuscript.Vortexing de reactie mix en verdelen onder de putten in de PCR plaat. Voeg 1 microliter van de DNA-verdunning toe aan elke put en voer PCR uit met behulp van het thermo-cycling programma dat in het manuscript wordt beschreven. Zodra de reactie is voltooid, analyseren van de resultaten met behulp van capillaire elektroforese of agarose gel elektroforese.Voor capillaire elektroforese voeg 1 microliter van het PCR-product toe in de put van de lezerplaat, samen met 1 druppel minerale olie om verdamping van water te voorkomen. Bereid vervolgens de scheidingsplaat voor door scheidingsbuffer toe te voegen. Gebruik de commerciële software voor de genanalyzer om een nieuwe monsterplaat te maken en sla de monsternamen op voor alle putten op de plaat.Selecteer vervolgens de analysemethode en voeg de twee platen in de genanalyzer. Vul de capillaire array met gedestilleerd water. Laad de lineaire polyacrylamide gel en klik op run.Als het analyseren van de PCR resultaten met gel elektroforese, bereiden een 1%agarose gel door het oplossen van agarose in elektroforese lopende buffer volgens manuscript richtingen. Voeg vervolgens 4 microliter nucleïnezuurvlek toe aan de gel en meng zachtjes. Zet een gel lade met een kam en vertragen giet de gel in het midden zorgen om bubbels te voorkomen.Laat de gel op kamertemperatuur tot volledig gestold, ongeveer 30-45 minuten. Zet dan in de elektroforese kamer. Verwijder de kam en bedek deze met een 1x TAE buffer.Laad de gel met de DNA-ladder, gevolgd door de PCR-producten gemengd met ladingkleurstof. Voer vervolgens de gel op 90 volt gedurende 60-90 minuten tot de blauwe kleurstof lijn is op ongeveer 75% van de gel lane. Zodra de run is voltooid, visualiseren van de gel met behulp van een transilluminator.Pollen buis groei in zelf-en kruisbestuivingen werd waargenomen door fluorescentie microscopie om zelf (in)compatibiliteit voor elke cultivar te bepalen. Cultivars werden beschouwd bij zelf-onverenigbaar toen de groei van de stuifmeelbuis werd gearresteerd en zelf-compatibel toen minstens één stuifmeelbuis de basis van de stijl bereikte. 5 primers paar combinaties werden gebruikt om S-alleles te identificeren met behulp van PCR in combinatie met capillaire of gel elektroforese.Ten eerste werden de S-alleles geïdentificeerd door de versterking van de eerste S-RNase intron met behulp van de SRc primer pair. Vervolgens werd de tweede intron van de RNase versterkt met drie primer sets om S6, S9, S1 en S7 allelen te onderscheiden. En de V2 en HVB variabele regio's van het SFB-gen werden versterkt met de AprFBC8 primer ingesteld op de Sc en S8 allelen te identificeren.Zodra de S-allelen zijn geïdentificeerd, kunnen verschillende onverenigbaarheidsgroepen met de genotypen die onderling onverenigbaar zijn, worden vastgesteld. Het is belangrijk om te onthouden om controle te gebruiken bij capillaire elektroforese, omdat ze een automatisch fragmentanalysesysteem gebruiken dat kan rapporteren als meer verschillen in fragmentgrootte waardoor onnauwkeurige allel-identificatie wordt veroorzaakt. De combinatie van microscopie-waarnemingen en genetische analyse heeft geleid tot een zeer nuttige benadering om zelf-onverenigbaarheid in abrikoos te bepalen en de onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars vast te stellen.Zelf-incompatibiliteit is nu de link naar de lokale bevolking in abrikoos. De bepaling van factoren lijkt te zijn betrokken. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn op de genetische opbouw van deze cultivar in abrikoos.De combinatie van deze documentaire benadering resulteert in waardevolle informatie voor de juiste selectie van cultivars in commerciële boomgaarden en patroongenotypes in abrikozenfokprogramma's. Een soortgelijke aanpak kan worden gebruikt in andere houtachtige meerjarige gewassen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Kwantificering van zelf vernieuwing in Muriene Mammosphere culturen

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...