Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
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Diese Forschung wurde von Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R und AGL2015-74071-JIN) finanziert. Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologa Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragén-Europäischer Sozialfonds, Europäische Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundacion Biodiversidad und Agroseguro S.A.

1. Selbst-(In-)Kompatibilitätsbestimmung
<ol><li>Probieren Sie die Blumen auf dem Feld. Es ist notwendig, die Blumen in ballonPhase zu sammeln (Abbildung 1A), entsprechend Stufe 58 auf der BBCH-Skala für Aprikosen28, um unerwünschte vorherige Bestäubung zu vermeiden.</li>
	<li>
Selbst- und Kreuzbestäubungen im Labor
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Anther der Blumen im Ballonstadium und legen Sie sie auf ein Stück Papier, um bei La...

Traditionell waren die meisten kommerziellen Aprikosen-Sorten in Europa selbstkompatibel36. Nichtsdestotrotz hat die Verwendung von nordamerikanischen selbstinkompatiblen Sorten als Eltern in Zuchtprogrammen in den letzten Jahrzehnten zur Freisetzung einer wachsenden Anzahl neuer selbstinkompatibler Sorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen7,8,37geführt. So wird die Bestimmung von Selbst- und Inte...

Selbstinkompatibilität ist eine Strategie der Blühenden Pflanzen, um Selbstbestäubung zu verhindern und Outcrossing1zu fördern. In Rosaceae wird dieser Mechanismus durch ein Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) bestimmt, das hauptsächlich durch den multiallelic locus S2gesteuert wird. Im Stil kodiert das RNase-Gen den S-s-Tylar-Determinanten, eine RNase3, während ein F-Box-Protein, das die S-Pollen-Determinantebestimmt, durch das SFB-Gen 4kodifiziert wird. S-s Die Selbstinkompatibilitätsinteraktion erfolgt durch die Hemmung des Pollenrohrwachstums entlang des Stils, der die Befruchtung der Ovule5,6verhindert.
In Der Aprikosen-Aprikosen-Aprikosen-Erneuerung hat in den letzten zwei Jahrzehnten weltweit eine Sortenerneuerung stattgefunden7,8. Diese Einführung einer wichtigen Anzahl neuer Sorten, aus verschiedenen öffentlichen und privaten Zuchtprogrammen, hat zu einer Zunahme von Aprikosensorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen geführt8.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um den Bestäubungsbedarf in Aprikosen zu bestimmen. Im Feld kann die Selbstverträglichkeit durch kontrollierte Bestäubungen in Käfigbäumen oder in entkalkten Blüten festgestellt werden und anschließend den Prozentsatz der Fruchtmenge9,10,11,12. Darüber hinaus wurden kontrollierte Bestäubungen im Labor durch semi-in vivo Kultur von Blumen und Analyse des Pollenrohrverhaltens unter Fluoreszenzmikroskopie8,13,14,15,16,17durchgeführt. In jüngster Zeit haben molekulare Techniken wie PCR-Analyse und Sequenzierung die Charakterisierung von Inkompatibilitätsbeziehungen ermöglicht, die auf der Untersuchung der RNase- und SFB-Gene 18,19basieren. In Aprikosen wurden 33 S-Allele gemeldet (S1 bis S20, S22 bis S30, S52, S53, Sv, Sx), einschließlich eines Alleels im Zusammenhang mit Selbstkompatibilität (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Bisher wurden 26 Inkompatibilitätsgruppen in dieser Art nach dem S-Genotyp8, S9,,17,25,26,27festgestellt. Sorten mit den gleichen SS-Allelen sind miteinander kompatibel, während Sorten mit mindestens einem anderen S-Allel, die in verschiedenen inkompatiblen Gruppen zugeordnet sind, miteinander kompatibel sind. S
Um die Bestäubungsanforderungen von Aprikosensorten zu definieren, beschreiben wir eine Methode, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch S-Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotyps durch PCR-Analyse in Aprikosensorten kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht die Etablierung von Inkompatibilitätsgruppen und die Aufklärung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Die Selbstinkompatibilität in Rosaceae wird durch ein Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) bestimmt, das hauptsächlich vom multiallelic locus S gesteuert wird. In Der Aprikosen-Aprikosen-Beziehung wird die Bestimmung von Selbst- und Inter-(In-)Kompatibilitätsverhältnissen immer wichtiger, da die Freisetzung einer bedeutenden Anzahl neuer Sorten zu einer Zunahme von Sorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen geführt hat. Hier beschreiben wir eine Methodik, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch Handbestäubungen und Mikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotypsdurch PCR-Analyse kombiniert. Zur Selbst-(In-)Kompatibilitätsbestimmung wurden im Ballonstadium aus jeder Sorte Blumen aus jeder Sorte gesammelt, im Labor von Hand bestäubt, fixiert und mit Anilineblau für die Beobachtung des Pollenrohrverhaltens unter der Fluoreszenzmikroskopie gefärbt. Für die Herstellung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten wurde DNA aus jeder Sorte Saus jungen Blättern extrahiert und S-Allele wurden von PCR identifiziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Einrichtung von Inkompatibilitätsgruppen und die Aufklärung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten, die eine wertvolle Information liefern, um geeignete Bestäubern bei der Gestaltung neuer Obstgärten zu wählen und geeignete Eltern in Zuchtprogrammen auszuwählen.

Bestäubungsstudien an Aprikosen erfordern die Verwendung von Blumen im späten Ballonstadium einen Tag vor der Anthese (Abbildung 1A). Diese Phase gilt als die günstigste für Pollen und Stempel Sammlung, da florale Strukturen sind fast ausgereift, aber Anther Dehiscence hat noch nicht stattgefunden. Dies verhindert die Interferenz unerwünschter Pollen, nicht nur von Pollen aus der gleichen Blüte, sondern auch von anderen Blüten, da die geschlossenen Blütenblätter die...

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Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Wir stellen eine Methodik vor, um die Bestäubungsanforderungen vonAprikosensorten (Prunus armeniaca L.) zu ermitteln, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotyps durch PCR-Analyse kombinieren.

Bestimmung von Selbst- und Inter-(in)Kompatibilitätsbeziehungen in Aprikosen, die Handbestäubung, Mikroskopie und genetische Analysen kombinieren

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Diese Methode kann helfen, Bestäubungsanforderungen in verschiedenen Arten zu bestimmen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten zu etablieren. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Bewertung mehrerer Inkompatibilitäten unter Laborbedingungen ermöglicht. Vermeidung der zahlreichen Probleme, die bei Experimenten auftreten können, die unter Feldbedingungen durchgeführt werden.Dies ermöglicht die Identifizierung zusammen mit der Widmung einer Reihe von Sorten an die entsprechenden Inkompatibilitätsgruppen. Bestimmung der Interkompatibilitätsbeziehung zwischen Sorten. Dieser Ansatz kann auch nützlich sein, um Selbstinkompatibilität und Inkompatibilitätsbeziehung in anderen Obstbaumkulturen wie Kirsche oder Pflaume zu bestimmen.Beginnen Sie mit der Probenahme der Blumen im Feld. Sammeln Sie die Blumen in der Ballonstufe, was Stufe 58 auf der BBCH-Skala für Aprikosen entspricht, um eine vorherige Bestäubung zu vermeiden. Im Labor entfernen Sie die Anther der Blumen und legen Sie sie auf ein Stück Papier, um bei Raumtemperatur zu trocknen.Nach 24 Stunden die Pollenkörner mit einem feinen 26-Millimeter-Netz absieben. Entleeren Sie eine Gruppe von 30 Blüten in der gleichen Ballonentwicklungsphase für jede Selbst- und Kreuzbestäubung und legen Sie die Pistolen 24 Stunden nach der Entschärfung auf Floristschaum in Wasser und bestäuben Sie die Pistolen mit einem Pinsel mit Pollen aus Blumen derselben Sorte. Bestäuben Sie einen weiteren Satz Pistolen jeder Sorte mit Pollen aus Blumen eines kompatiblen Bestäubern als Kontrolle.Nach 72 Stunden die Pistolen vom nassen Floristenschaum entfernen und die Pistolen in einer fixativen Lösung von 3:1 Ethanol auf Essigsäure für mindestens 24 Stunden bei 4 Grad Celsius fixieren. Dann entsorgen Sie das Fixativ und fügen Sie 75% Ethanol hinzu, um sicherzustellen, dass Proben vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Die Proben können bis zum Gebrauch im Ethanol bei 4 Grad Celsius gelagert werden.Streuen Sie die Pollenkörner der gleichen Sorten, die zur Kontrolle von Bestäubungen im erstarrten Pollenkeimmedium verwendet werden, und beobachten Sie sie nach 24 Stunden unter dem Mikroskop. Bereiten Sie die Pistolen für die Mikroskopie vor, indem Sie sie 3 Mal mit destilliertem Wasser für eine Stunde pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche, lassen Sie sie in 5%Natriumsulfit bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden.Dann autoklavieren Sie sie mit einem Kilogramm pro Zentimeter quadratisch für 10 Minuten in Natriumsulfit, um das Gewebe zu erweichen. Legen Sie die autoklavierten Pistolen über eine Glasrutsche und verwenden Sie ein Skalpell, um die Trichome um den Eierstock zu entfernen. Dann zerquetschen Sie die Pistole mit einem Deckglas.Tragen Sie einen Tropfen Anilineblau über die Präparate auf, um lästige Ablagerungen während des Pollenrohrwachstums zu färben, und beobachten Sie die Pollenröhren entlang des Stils mit einem Mikroskop gemäß Manuskriptanweisungen. Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um genomische DNA aus jungen Blättern zu extrahieren, die im Frühjahr gesammelt wurden. Dann PCR einrichten, indem Sie Reagenzien nach Manuskriptanweisungen kombinieren.Wirbeln des Reaktionsmixes und Verteilung unter den Brunnen in der PCR-Platte. Fügen Sie 1 Mikroliter der DNA-Verdünnung in jeden Brunnen und führen SIE PCR mit dem Thermo-Cycling-Programm im Manuskript skizziert. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, analysieren Sie die Ergebnisse mit Kapillarelektrophorese oder Agarose-Gel-Elektrophorese.Für die Kapillarelektrophorese fügen Sie 1 Mikroliter des PCR-Produkts in den Brunnen der Leseplatte zusammen mit 1 Tropfen Mineralöl, um eine Wasserverdunstung zu verhindern. Bereiten Sie dann die Trennplatte durch Zugabe von Trennpuffer vor. Verwenden Sie die kommerzielle Software für den Genanalysator, um eine neue Probenplatte zu erstellen und die Probennamen für alle Brunnen auf der Platte zu speichern.Wählen Sie dann die Analysemethode aus und fügen Sie die beiden Platten in den Genanalysator ein. Füllen Sie das Kapillararray mit destilliertem Wasser. Laden Sie das lineare Polyacrylamid-Gel und klicken Sie auf Ausführen.Wenn die Analyse der PCR-Ergebnisse mit Gelelektrophorese ergibt, bereiten Sie ein 1%Agarose-Gel vor, indem Sie Agarose in Elektrophorese-Laufpuffer nach Manuskriptrichtungen auflösen. Dann 4 Mikroliter Nukleinsäurefleck in das Gel geben und sanft mischen. Richten Sie ein Geltablett mit einem Kamm und Verlangsamung gießen Sie das Gel in der Mitte unter Derherstellung, um Blasen zu vermeiden.Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur, bis es vollständig erstarrt ist, ca. 30-45 Minuten. Dann in die Elektrophoresekammer geben. Entfernen Sie den Kamm und bedecken Sie ihn mit 1x TAE Puffer.Laden Sie das Gel mit der DNA-Leiter gefolgt von den PCR-Produkten gemischt mit Ladefarbstoff. Dann laufen Sie das Gel bei 90 Volt für 60-90 Minuten, bis die blaue Färbelinie bei etwa 75% der Gelspur ist. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, visualisieren Sie das Gel mit einem Transilluminator.Das Wachstum der Pollenröhrchen in Selbst- und Kreuzbestäubungen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, um die Selbstverträglichkeit für jede Sorte zu bestimmen. Kultivaren wurden als selbstkompatibel betrachtet, wenn Pollenrohrwachstum verhaftet wurde und selbstkompatibel, wenn mindestens ein Pollenrohr die Basis des Stils erreicht. 5 Primerpaarkombinationen wurden verwendet, um S-Allele mit PCR in Kombination mit Kapillar- oder Gelelektrophorese zu identifizieren.Zunächst wurden die S-Allele durch die Verstärkung des ersten S-RNase-Introns mit dem SRc-Primerpaar identifiziert. Dann wurde das zweite Intron der RNase mit drei Primersätzen verstärkt, um S6, S9, S1 und S7 Allele zu unterscheiden. Und die V2- und HVB-Variablenregionen des SFB-Gens wurden mit dem AprFBC8-Primer verstärkt, um die Sc- und S8-Allele zu identifizieren.Sobald die S-Allele identifiziert wurden, können verschiedene Inkompatibilitätsgruppen mit den Genotypen festgestellt werden, die interinkompatibel sind. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, die Kontrolle in der Kapillarelektrophorese zu verwenden, da sie ein automatisches Fragmentanalysesystem verwenden, das mehr Unterschiede in der Fragmentgröße melden kann, was zu einer ungenauen Allele-Identifikation führt. Die Kombination von Mikroskopie-Beobachtungen und genetischer Analyse hat zu einem sehr nützlichen Ansatz geführt, um die Selbstinkompatibilität in Aprikosen zu bestimmen und die Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten zu etablieren.Selbstinkompatibilität ist jetzt die Verbindung zu Einheimischen in Aprikosen. Die Bestimmung der Faktoren scheint eine Rolle zu spielen. Zukünftige Anstrengungen müssen sich auf die genetische Erbauung dieser Sorte in Aprikosen konzentrieren.Die Kombination dieses dokumentarischen Ansatzes ergibt wertvolle Informationen für die angemessene Auswahl von Sorten in kommerziellen Obstgärten und Mustergenotypen in Aprikosenzuchtprogrammen. Ein ähnlicher Ansatz kann in anderen holzigen mehrjährigen Kulturen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

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