Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי Ministerio de Ciencia, האוניברסיטה האירופית לפיתוח האזור האירופי, האיחוד האירופי (AGL2016-77267-R, ו AGL2015-74071-ג'ין); המכון הלאומי לשימור (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); הקרן האירופית למדעי החברה, האיחוד האירופי (גריפו באסדדו A12_17R), Biodiversidad, וAgroseguro דרום אמריקה

1. קביעת תאימות עצמית (in)
<ol><li>. לדגום את הפרחים בשדה יש צורך לאסוף את הפרחים בשלב הבלון (איור 1א), המתאים לשלב 58 בסולם bbch עבור משמש28, כדי למנוע האבקה קודמת לא רצויה.</li>
	<li>
המאביקים במעבדה
	<ol>
<li>הסירו את האנונים של הפרחים על במת בלון ומניחים אותם ע...

באופן מסורתי, זנים מסחריים משמשים באירופה היו בעלי תאימות עצמית36. למרות זאת, השימוש בזנים של צפון אמריקה בלתי-מתאימים לעצמי כהורים בתוכניות רבייה בעשורים האחרונים הביא לשחרורו של מספר גדל והולך של זנים חדשים שאינם תואמים לעצמי עם דרישות האבקה מוכרות7,<sup class...

אי-סבילות עצמית היא אסטרטגיה של צמחים פורחים כדי למנוע האבקה עצמית ולקדם את המעבר1. ב ורדיים, מנגנון זה נקבע על ידי מערכת התאמה עצמית של Gamet Tic (GSI) כי הוא נשלט בעיקר על ידי multiallelic לוקוס S2. בסגנון, הגן rnase מקודד את דטרמיננטה s-sטיילר, rnase3, בעוד חלבון בקופסה F, אשר קובע את הדטרמיננטה של אבקה, הוא מסווג על ידי גן sfb 4. האינטראקציה עצמית אי-תאימות מתרחשת דרך עיכוב של צמיחת שפופרת אבקה לאורך הסגנון מניעת הפריה של הביצית5,6.
בשמש, התקיימה התחדשות בין-שנים ברחבי העולם בשני העשורים האחרונים7,8. הקדמה זו של מספר גדול של זנים חדשים, מתוכניות הרבייה הציבוריות והפרטיות השונות, הביאה לגידול זנים משמשים בעלי דרישות האבקה לא ידועות8.
שיטות שונות שימשו לקביעת דרישות ההאבקה בשמש. בתחום, ניתן ליצור תאימות עצמית (in) על-ידי המאביקים מבוקרים בעצי בכלוב או בפרחים מסורס ולאחר מכן מקליטים את אחוז הפרי שהוגדר9,10,11,12. בנוסף, המאביקים מבוקרים בוצעו במעבדה על ידי vivo למחצה ב תרבות של פרחים וניתוח של התנהגות שפופרת אבקה תחת מיקרוסקופ הזריחה8,13,14,15,16,17. לאחרונה, טכניקות מולקולריות, כגון ניתוח PCR ורצף, הרשו לאפיון של קשרי אי-תאימות המבוססים על חקר הגנים של rnase ו- sfb 18,19. בשמש, 33 S-alleles דווחו (s1 עד S20, s22 אל s30, s52, s53, sv, sx), כולל alleles אחד הקשורים בתאימות עצמית (Sc)12,18,20,21,22,23,24. עד עכשיו, 26 קבוצות אי-סבילות הפכו לאורווה במין זה על פי ה- S-גנוטיפ8,9,17,25,26,27. זנים עם אותו ס-אללים הם בלתי-תואמים, בעוד שהזנים עם שינוי s-alleles אחד לפחות, וכתוצאה מכך, מוקצים בקבוצות שונות שאינן תואמות, הן תואמות.
כדי להגדיר את דרישות ההאבקה של זנים משמש, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת את התאימות העצמית (בתוך) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR בזנים משמש. גישה זו מאפשרת להקים קבוצות אי-תאימות ולהבהיר קשרי אי-תאימות בין זנים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

אי-סבילות עצמית ב ורדיים נקבעת על ידי מערכת התאמה עצמית של Gamet Tic (GSI) כי הוא נשלט בעיקר על ידי multiallelic לוקוס S. בשמש, הקביעה של יחסי התאימות העצמית והבין (in) היא חשובה יותר ויותר, שכן שחרורו של מספר חשוב של זנים חדשים הביא לגידול זנים עם דרישות האבקה לא ידועות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת את ההגדרה של התאמה עצמית (בתוך) באמצעות המאביקים ומיקרוסקופ עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR. בקביעת תאימות עצמית (in), הפרחים הנמצאים בשלב בלון מכל זנים נאספו בשדה, מואבקים בתוך המעבדה, קבועים ומוכתמים בכחול אנילין להתבוננות בהתנהגות שפופרת האבקה תחת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. להקמת יחסי התאמה בין זנים, דנ א מכל זנים הופק מעלים צעירים ו-S-alleles זוהו על ידי ה-PCR. גישה זו מאפשרת להקים קבוצות אי-תאימות ולהבהיר קשרי אי-תאימות בין זנים, המספקים מידע רב ערך לבחירת המאביקים המתאימים בעיצוב מטעים חדשים ולבחירת הורים מתאימים בתוכניות רבייה.

לימודי האבקה בשמש דורשים שימוש בפרחים בשלב הבלון המאוחר יום לפני התזה (איור 1א). שלב זה נחשב לחיובי ביותר עבור האוסף האבקה והפיסטיל, שכן מבנים פרחוניים הם כמעט בוגרים, אבל הדחיניות עדיין לא התרחשה. זה מונע הפרעה של אבקה בלתי רצויה, לא רק של אבקה מאותו פרח אלא גם מפרחי...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.

קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

שיטה זו יכולה לסייע בקביעת דרישות האבקה במינים שונים ולבסס יחסי אי התאמה בין זנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מאפשרת להעריך מספר אי התאמה בתנאי מעבדה. הימנעות מבעיות רבות שעלולות להתרחש בניסויים המבוצעים בתנאי שדה.זה מאפשר זיהוי יחד עם מסירות של מספר cultivar לקבוצות אי תאימות המתאימות. קביעת הקשר הבין-תאימותי בין זנים. גישה זו יכולה גם להיות שימושית כדי לקבוע את חוסר תאימות עצמית ואת יחסי אי תאימות בגידולים אחרים עץ פרי כמו דובדבן או שזיף.התחל על ידי דגימת הפרחים בשדה. לאסוף את הפרחים בשלב בלון, אשר מתאים שלב 58 בסולם BBCH עבור משמש כדי למנוע האבקה קודמת. במעבדה, להסיר את anthers של הפרחים מניחים אותם על פיסת נייר להתייבש בטמפרטורת החדר.לאחר 24 שעות, לנטר את גרגרי האבקה עם רשת בסדר 26 מילימטר. לסרס קבוצה של 30 פרחים באותו שלב התפתחותי בלון עבור כל האבקה עצמית צולבת ולה מניחים את האקדחים על קצף הפרחים במים 24 שעות לאחר סירוס ולהאביק את האקדחים באמצעות מברשת צבע עם אבקה מפרחים של אותו cultivar. להאביק קבוצה נוספת של אקדחים של כל cultivar עם אבקה מפרחים של מאביק תואם כפקד.לאחר 72 שעות, להסיר את האקדחים מקצף הפרחים הרטובים ולתקן את האקדחים בתמצית תיקון של 3:1 אתנול לחומצה אצטית לפחות 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השלך את התיקון והוסף 75%אתנול, וודא שהדגימות שקועות לחלוטין בפתרון. דגימות ניתן לאחסן באתנול ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.מפזרים את גרגרי האבקה של אותם זנים המשמשים להאבקות הבקרה במדיום נביטת אבקה מוצק ומתבוננים בהם מתחת למיקרוסקופ לאחר 24 שעות. הכינו את האקדחים למיקרוסקופיה על ידי שטיפתם 3 פעמים במים מזוקקים במשך שעה אחת לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר אותם 5% נתרן סולפיט ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.ואז autoclave אותם בקילוגרם אחד סנטימטר בריבוע במשך 10 דקות נתרן סולפיט כדי לרכך את הרקמה. מניחים את האקדחים autoclaved מעל מגלשת זכוכית ולהשתמש אזמל כדי להסיר את trichomes סביב השחלה. ואז למחוץ את האקדח עם כיסוי.החל טיפה של כחול אנילין על ההכנות כתם תצהירים קשוחים במהלך צמיחת צינור אבקה ולצפות צינורות אבקה לאורך הסגנון עם מיקרוסקופ על פי הוראות כתב היד. השתמש בערכה מסחרית כדי לחלץ דנ"א גנומי מעלים צעירים שנאספו באביב. לאחר מכן הגדר את PCR על-ידי שילוב רייגנטים בהתאם לכיווני כתב היד.מערבולת התגובה לערבב ולהפיץ אותו בין בארות בצלחת PCR. הוסף מיקרוליטר אחד של דילול הדנ"א לכל באר והפעל את PCR באמצעות תוכנית התרמו-רכיבה על אופניים המתוארת בכתב היד. לאחר השלמת התגובה, לנתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה נימי או אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.עבור אלקטרופורזה נימי להוסיף 1 microliter של המוצר PCR לתוך באר של צלחת הקורא יחד עם 1 טיפה של שמן מינרלי כדי למנוע אידוי מים. לאחר מכן הכינו את לוח ההפרדה על-ידי הוספת מאגר הפרדה. השתמש בתוכנה המסחרית עבור מנתח הגנים כדי ליצור צלחת מדגם חדשה ולשמור את שמות המדגם עבור כל בארות על הצלחת.לאחר מכן בחר את שיטת הניתוח והכנס את שתי הלוחות לתוך מנתח הגנים. ממלאים את מערך נימי במים מזוקקים. לטעון את ג'ל פוליאקרילמיד ליניארי ולחץ לרוץ.אם מנתחים את תוצאות ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, הכינו ג'ל 1%agarose על ידי המסת אגרוז במאגר פועל אלקטרופורזה בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן מוסיפים 4 מיקרוליטרים של כתם חומצת גרעין לג'ל ומערבבים בעדינות. הגדר מגש ג'ל עם מסרק והאטה לשפוך את הג'ל באמצע דואג להימנע בועות.השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר עד שהתמצקות מלאה, כ-30-45 דקות. ואז לשים בתא אלקטרופורזה. הסר את המסרק ולכסות אותו עם מאגר TAE 1x.לטעון את הג'ל עם סולם ה-DNA ואחריו מוצרי PCR מעורבב עם טעינת צבע. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 90 וולט במשך 60-90 דקות עד קו הצבע הכחול הוא כ 75% של נתיב ג'ל. לאחר השלמת הריצה, דמיינו את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור.צמיחת צינור האבקה עצמית והאבקה צולבת נצפתה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע תאימות עצמית (ב) עבור כל cultivar. זנים נחשבו עצמית עולה בקנה אחד כאשר צמיחת צינור אבקה נעצר ותואם את עצמו כאשר לפחות צינור אבקה אחד הגיע לבסיס של הסגנון. 5 שילובי זוג פריימרים שימשו לזיהוי S-alleles באמצעות PCR בשילוב עם אלקטרופורזה נימי או ג'ל.ראשית, ה-S-alleles זוהו על ידי הגברה של ה-S-RNase intron הראשון באמצעות זוג פריימר SRc. ואז האסטרון השני של RNase הוגבר עם שלושה סטים פריימר להבחין S6, S9, S1, ו S7 אללים. ואזורי משתנה V2 ו- HVB של הגן SFB הוגברו עם פריימר AprFBC8 להגדיר לזהות את אללים Sc ו- S8.לאחר שזוהו ה- S-alleles, ניתן ליצור קבוצות שונות של אי-תאימות עם הגנוטיפים שאינם תואמים זה לזה. חשוב לזכור להשתמש בשליטה באלקטרופורזה נימית, שכן הם משתמשים במערכת ניתוח שברים אוטומטית שיכולה לדווח על הבדלים נוספים בגודל הקטע וגורמים לזיהוי אלל לא מדויק. השילוב של תצפיות מיקרוסקופיות וניתוח גנטי הביא לגישה שימושית מאוד כדי לקבוע אי התאמה עצמית של משמש ולבסס את יחסי אי התאמה בין זנים.אי התאמה עצמית היא כיום הקישור למקומיים משמש. נראה כי קביעת הגורמים מעורבת. מאמץ עתידי צריך להיות ממוקד בהטמימות הגנטית של הכת הזו במ משמש.השילוב של גישה תיעודית זו הוא תוצאה של מידע רב ערך עבור הבחירה המתאימה של זנים במטעים מסחריים גנוטיפים דפוס בתוכניות רבייה משמש. גישה דומה ניתן להשתמש בגידולים רב שנתיים עציים אחרים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...