Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigaciàn y Tecnolog à Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragàn-European Social Fund, European Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundaciàn Biodiversidad e Agroseguro S.A.

1. Determinazione dell'auto-in()compatibilità
<ol><li>Assaggia i fiori nel campo. È necessario raccogliere i fiori in fase di palloncino (Figura 1A), corrispondente alla fase 58 sulla scala BBCH per albicocca28, per evitare l'impollinazione precedente indesiderata.</li>
	<li>
Auto e cross-impollinazioni in laboratorio
	<ol>
<li>Rimuovere le antre dei fiori in fase di palloncino e metterli su un pezzo di carta per asciugare a tempe...

Tradizionalmente, la maggior parte delle cultivar europee di albicocche commerciali erano auto-compatibili36. Tuttavia, l'uso di cultivar auto-incompatibili nordamericane come genitori nei programmi di allevamento negli ultimi decenni ha portato al rilascio di un numero crescente di nuove cultivar auto-incompatibili con requisiti di impollinazione sconosciuti7,8,37. Pertanto, la determinazione delle relaz...

L'autoincompatibilità è una strategia di fioritura delle piante per prevenire l'autoimpollinazione e promuovere l'outcrossing1. In Rosaceae, questo meccanismo è determinato da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S2. Nello stile, il gene RNase codifica il determinante tylar S-s,un RNase3, mentre una proteina F-box, che determina il determinante S-pollen,è codificata dal gene SFB 4. L'interazione di autoincompatibilità avviene attraverso l'inibizione della crescita del tubo di polline lungo lo stile impedendo la fecondazione dell'ovulo5,6.
In albicocca, un rinnovamento varietale ha avuto luogo in tutto il mondo negli ultimi due decenni7,8. Questa introduzione di un numero importante di nuove cultivar, provenienti da diversi programmi di allevamento pubblico e privato, ha portato all'aumento delle cultivar di albicocche con requisiti di impollinazione sconosciuti8.
Diverse metodologie sono state utilizzate per determinare i requisiti di impollinazione nell'albicocca. Nel campo, l'auto-(in)compatibilità può essere stabilita da impollinazioni controllate in alberi in gabbia o in fiori evirati e successivamente registrando la percentuale di set di frutta9,10,11,12. Inoltre, in laboratorio sono state effettuate impollinazioni controllate dalla cultura semi-in vivo dei fiori e dall'analisi del comportamento del tubo di polline sotto microscopia a fluorescenza8,13,14,15,16,17. Recentemente, le tecniche molecolari, come l'analisi pcR e il sequenziamento, hanno permesso la caratterizzazione delle relazioni di incompatibilità basate sullo studio dei geni RNase e SFB 18,19. In albicocca, 33 S-alleli sono stati segnalati (S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), tra cui un allele correlato con autocompatibilità (S)12,18,20,21,22,23,24. Finora, 26 gruppi di incompatibilità sono stati accoltellati in questa specie secondo la S-genotipo8,9,17,25,26,27. S Le cultivar con gli stessi S-allelisono intercompatibili, mentre le cultivar con almeno un allele Adiverso e, di conseguenza, assegnate in diversi gruppi incompatibili, sono intercompatibili.
Per definire i requisiti di impollinazione delle cultivar di albicocca, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell'auto-in)compatibilità mediante microscopia a fluorescenza con l'identificazione del genotipo S-mediante l'analisi PCR nelle cultivar di albicocca. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

L'autoincompatibilità in Rosaceae è determinata da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S. In albicocca, la determinazione delle relazioni di auto-e inter-compatibilità è sempre più importante, poiché il rilascio di un numero importante di nuove cultivar ha portato all'aumento delle cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo caso, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell'auto-compatibilità mediante impollinazioni manuali e microscopia con l'identificazione del genotipo S mediantel'analisi PCR. Per la determinazione dell'auto-in)compatibilità, i fiori in fase di palloncino da ogni cultivar sono stati raccolti sul campo, impollinati a mano in laboratorio, fissati e macchiati con blu anilina per l'osservazione del comportamento del tubo di polline sotto la microscopia a fluorescenza. Per l'instaurazione di relazioni di incompatibilità tra le cultivar, il DNA di ogni cultivar è stato estratto da foglie giovani e gli alleli Ssono stati identificati dalla PCR. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e di chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar, che fornisce una preziosa informazione per scegliere i minacciappropriati adatti nella progettazione di nuovi frutteti e per selezionare i genitori appropriati nei programmi di allevamento.

Gli studi di impollinazione in albicocca richiedono l'uso di fiori nella fase tarda del palloncino un giorno prima dell'analisi (Figura 1A). Questa fase è considerata la più favorevole sia per la raccolta del polline che per la raccolta del pistilo, poiché le strutture floreali sono quasi mature, ma l'inestesia non si è ancora verificata. Questo impedisce l'interferenza di polline indesiderato, non solo di polline dallo stesso fiore, ma anche da altri fiori, poiché i pe...

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Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Presentiamo una metodologia per stabilire i requisiti di impollinazione dell'albicocca(Prunus armeniaca L.) che combinano la determinazione dell'auto-in) della microscopia a fluorescenza con l'identificazione del genotipo S mediante l'analisi PCR.

Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Questo metodo può aiutare a determinare i requisiti di impollinazione in diverse specie e stabilire relazioni di incompatibilità tra cultivar. Il vantaggio principale di questo approccio è che consente di valutare diverse incompatibilità in condizioni di laboratorio. Evitare i numerosi problemi che possono verificarsi negli esperimenti eseguiti in condizioni di campo.Ciò consente l'identificazione insieme alla dedizione di un certo numero di cultivar ai corrispondenti gruppi di incompatibilità. Determinazione della relazione di intercompatibilità tra cultivar. Questo approccio può anche essere utile per determinare l'autoincompatibilità e la relazione di incompatibilità in altre colture di alberi da frutto come ciliegia o prugna.Inizia assaggiando i fiori nel campo. Raccogli i fiori in fase di palloncino, che corrisponde allo stage 58 sulla scala BBCH per l'albicocca per evitare l'impollinazione precedente. In laboratorio, rimuovere le anthers dei fiori e posizionarle su un pezzo di carta per asciugare a temperatura ambiente.Dopo 24 ore setacciare i grani di polline con una sottile rete da 26 millimetri. Eviculare un gruppo di 30 fiori nella stessa fase di sviluppo del palloncino per ogni autoimpollinazione e cross-impollinazione e posizionare le pistole sulla schiuma fioraio in acqua 24 ore dopo l'emaculazione e impollinare le pistole usando un pennello con polline dai fiori della stessa cultivar. Impollinare un altro set di pistole di ogni cultivar con polline dai fiori di un impollinatore compatibile come controllo.Dopo 72 ore, rimuovere le pistole dalla schiuma fioraia bagnata e fissare le pistole in una soluzione fissativa di etanolo 3:1 in acido acetico per almeno 24 ore a 4 gradi Celsius. Quindi scartare il fissatore e aggiungere il 75% di etanolo, assicurandosi che i campioni siano completamente immersi nella soluzione. I campioni possono essere conservati nell'etanolo a 4 gradi Celsius fino all'uso.Spargere i granelli di polline delle stesse cultivar utilizzate per le impollinazioni di controllo nel mezzo di germinazione del polline solidificato e osservarli al microscopio dopo 24 ore. Preparare le pistole per la microscopia lavandole 3 volte con acqua distillata per un'ora per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciarli in solfito di sodio al 5% a 4 gradi Celsius per 24 ore.Quindi autoclavarli a un chilogrammo per centimetro squadrato per 10 minuti in solfito di sodio per ammorbidire il tessuto. Posizionare le pistole autoclavate sopra uno scivolo di vetro e usare un bisturi per rimuovere i tricomi intorno all'ovaio. Quindi schiacciare la pistola con un coverglass.Applicare una goccia di blu anilina sui preparati per macchiare le deposizioni inchiodate durante la crescita del tubo di polline e osservare i tubi di polline lungo lo stile con un microscopio secondo le indicazioni manoscritte. Usa un kit commerciale per estrarre il DNA genomico da giovani foglie raccolte in primavera. Quindi impostare la PCR combinando i reagenti in base alle indicazioni manoscritte.Vortice del mix di reazione e distribuzione tra i pozzi nella piastra PCR. Aggiungere 1 microlitro della diluizione del DNA in ogni pozzo ed eseguire pcr utilizzando il programma di termo-ciclismo delineato nel manoscritto. Una volta completata la reazione, analizzare i risultati utilizzando elettroforesi capillare o elettroforesi a gel di agarosio.Per l'elettroforesi capillare aggiungere 1 microliter del prodotto PCR nel pozzo della piastra lettore insieme a 1 goccia di olio minerale per evitare l'evaporazione dell'acqua. Quindi preparare la piastra di separazione aggiungendo il tampone di separazione. Utilizzare il software commerciale per l'analizzatore genico per creare una nuova piastra campione e salvare i nomi dei campioni per tutti i pozzi sulla piastra.Quindi selezionare il metodo di analisi e inserire le due piastre nell'analizzatore genico. Riempire l'array capillare con acqua distillata. Caricare il gel lineare in poliacrilammide e fare clic su Esegui.Se si analizzano i risultati della PCR con elettroforesi del gel, preparare un gel di agarosio dell'1% sciogliendo l'agarosio nel buffer di funzionamento dell'elettroforesi secondo le indicazioni manoscritte. Quindi aggiungere 4 microlitri di macchia di acido nucleico al gel e mescolare delicatamente. Impostare un vassoio di gel con un pettine e rallentare versare il gel nel mezzo facendo attenzione ad evitare bolle.Lasciare il gel a temperatura ambiente fino a completa solidifica, circa 30-45 minuti. Quindi mettere nella camera di elettroforesi. Rimuovere il pettine e coprirlo con 1 tampone TAE.Caricare il gel con la scala del DNA seguita dai prodotti PCR mescolati con colorante di carico. Quindi eseguire il gel a 90 volt per 60-90 minuti fino a quando la linea di tintura blu è a circa il 75% della corsia di gel. Una volta completata l'esecuzione, visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore.La crescita del tubo di polline nelle autoimpollinazioni e incrociate è stata osservata dalla microscopia a fluorescenza per determinare l'autocompatibilità per ogni cultivar. Le cultivar erano considerate auto-incompatibili quando la crescita del tubo di polline fu arrestata e autocompatibile quando almeno un tubo di polline raggiunse la base dello stile. 5 combinazioni di coppie di primer sono state utilizzate per identificare gli alleli S utilizzando PCR in combinazione con elettroforesi capillare o gel.In primo luogo, gli alleli S furono identificati dall'amplificazione del primo introne S-RNasi usando la coppia di primer SRc. Quindi il secondo introne della RNasi fu amplificato con tre set di primer per distinguere gli alleli S6, S9, S1 e S7. E le regioni variabili V2 e HVB del gene SFB sono state amplificate con il primer AprFBC8 impostato per identificare gli alleli Sc e S8.Una volta identificati gli alleli S, è possibile stabilire diversi gruppi di incompatibilità con i genotipi inter incompatibili. È importante ricordare di usare il controllo nell'elettroforesi capillare, poiché usano un sistema automatico di analisi dei frammenti che può segnalare come maggiori differenze nelle dimensioni dei frammenti causando un'identificazione imprecisa dell'allele. La combinazione di osservazioni di microscopia e analisi genetica ha portato ad un approccio molto utile per determinare l'autoincompatibilità nell'albicocca e stabilire le relazioni di incompatibilità tra cultivar.L'autoincompatibilità è ora il collegamento con la gente del posto in albicocca. La determinazione dei fattori sembra essere coinvolta. Gli sforzi futuri devono essere concentrati sull'edificazione genetica di questa cultivar nell'albicocca.La combinazione di questo approccio documentario si traducono in preziose informazioni per l'appropriata selezione di cultivar in frutteti commerciali e genotipi di modelli nei programmi di allevamento di albicocche. Un approccio simile può essere utilizzato in altre colture legnose perenni.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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