Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
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この研究は、シエンシア大臣、イノベルシダーデス・イ・ウニバーシダーデス・ヨーロピアン地域開発基金、欧州連合(AGL2016-77267-R、AGL2015-74071-JIN)によって資金提供されました。インスティトゥート・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・イ・テクノロジア・アグラリア・イ・アリメンタリア(RFP2015-00015-00,RTA2017-00003-00);ゴビエルノ・デ・アラゴン・ヨーロピアン・ソーシャル・ファンド、欧州連合(グルポ・コンソリダド・A12_17R)、フンダシオン・バイオディビジダード、アグロゼグロS.A.

1. 自己(in)互換性判定
<ol><li>畑の花を試す。気球段階で花を集める必要があります (図1A),アプリコット28のためのBBCHスケールのステージ58に対応し、不要な以前の受粉を避けるために.</li>
	<li>
実験室での自己受粉とクロス受粉
	<ol>
<li>バルーンステージで花のアンサーを取り除き、実験室の温度で乾燥させるために紙の上に置?...

伝統的に、ほとんどの市販アプリコットヨーロッパの品種は、自己互換性のある36でした。それにもかかわらず、過去数十年の繁殖プログラムにおける親としての北米の自己適合性品種の使用は、未知の受粉要件77、8、378,37を持つ新しい自己互換性のない品種の増加をもたらした。したがって、アプリコ?...

自己非適合性は、自己受粉を防ぎ、1を越えることを促進するために植物を開花させる戦略です。酒さでは、この機構は、主に多アレリック軌跡S22によって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。この様式では、RNase遺伝子はS−sタイラー決定基であるRNase3をコードし3、一方、S−花粉決定基を決定するFボックスタンパク質は、SFB遺伝子4によって体系化される。自己非適合性相互作用は、排卵体5,6,6の受精を防止するスタイルに沿った花粉管の成長の阻害を通じて行われる。
アプリコットでは、品種の更新は、過去20年間で世界中で行われました7,,8.この重要な数の新しい品種の導入は、異なる公的および民間の繁殖プログラムから、未知の受粉要件を有するアプリコット品種の増加をもたらした8。
アプリコットの受粉要件を決定するために、さまざまな方法論が使用されてきました。この分野では、ケージの木や魅惑的な花の中で制御された花粉化によって自己(in)互換性が確立され、その後、果実セット99、10、11、1210,11,12の割合を記録することができる。また、半生体内の花の培養や蛍,光顕微鏡,8、13、14、15、16、1713,14,の下で花粉管挙動の分析によって実験室で制御された受粉が行われている。151617近年、PCR解析やシーケンシングなどの分子技術により、RNase遺伝子とSFB遺伝子18,19,の研究に基づく非相溶関係の特徴付けが可能となった。アプリコットでは、33個のS対立アレス(S1〜S S20、S S22〜S S30、S,52、S S53、S Sv、S Sx)が報告されている(S Sc)12、18、20、21、22、23、24。22,23,2412,18,2021,cこれまで、26の非適合群は、S-遺伝子,型8、9、17、25、26、279,17に従ってこの種で刺されています。,26,27825同じS-allelesSを持つ品種は相互に互換性がありませんが、少なくとも1つの異なるS-対立アレスを持つ品種は、異なる非互換性グループに割り当てられ、相互互換性があります。
アプリコット品種の受粉要件を定義するために、蛍光顕微鏡による自己適合性の決定とアプリコット品種におけるPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせた方法論を記述する。このアプローチは、非互換性グループを確立し、品種間の非互換性関係を解明することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

酒さにおける自己非適合性は、主に多アレリック軌跡Sによって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。アプリコットでは、重要な数の新しい品種が放出され、未知の受粉要件を持つ品種が増加しているため、自己および相互互換性関係の決定がますます重要になっています。ここでは、自己(in)の適合性を、手受粉法と顕微鏡による、PCR解析によるS-遺伝子型の同定と組み合わせた方法論を述べた。自己(in)適合性決定のために、各品種からのバルーンステージで花を現場に集め、実験室で手受粉し、固定し、蛍光顕微鏡下で花粉管の挙動を観察するためにアニリンブルーで染色した。品種間の非相溶性関係の確立のために、各品種からDNAを若葉から抽出し、S-アレスをPCRによって同定した。このアプローチは、非互換性グループを確立し、新しい果樹園の設計に適切な受粉者を選択し、繁殖プログラムで適切な親を選択するための貴重な情報を提供する品種間の非互換性関係を解明することができます。

アプリコットの受粉研究は、麻酔の前日に風船の後期段階で花を使用する必要があります(図1A)。花の構造はほぼ成熟しているので、この段階は花粉とピスティルコレクションの両方にとって最も有利であると考えられていますが、アンサーの非難はまだ起こっていません。これは、閉じた花びらは外部花粉を運ぶ昆虫の到着を妨げるので、同じ花から花粉?...

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Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

蛍光顕微鏡による自己適合性とPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせたアプリコット(プルヌスアルメニアカL.)品種の受粉要件を確立する方法論を提示する。

手受粉、顕微鏡、遺伝子解析を組み合わせたアプリコットにおける自己と相互の関係の決定

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

この方法は、異なる種の受粉要件を決定し、品種間の非互換性関係を確立するのに役立ちます.このアプローチの主な利点は、実験室の条件下でいくつかの非互換性を評価できることです。フィールド条件下で行う実験で発生する可能性のある多くの問題を回避します。これは、対応する非互換性グループに品種の数の献身と一緒に識別を可能にします.品種間の相互互換性関係を決定する。このアプローチは、チェリーやプラムのような他の果樹作物における自己非適合性および非互換性関係を決定するのにも有用である。まずは畑の花をサンプリングします。以前の受粉を避けるためにアプリコットのためのBBCHスケールのステージ58に対応するバルーンステージで花を収集します。実験室では、花のアンサーを取り除き、室温で乾燥させるために紙の上に置きます。24時間後、細かい26ミリメートルのメッシュで花粉粒をふるいにかける。自己受粉とクロス受粉の各同じバルーン発達段階で30本の花のグループをエマキュレートし、発育後24時間後に水中の花屋の泡にピストルを置き、同じ品種の花から花粉を入れたペイントブラシを使用してピストルを受粉させます。コントロールとして互換性のある受粉者の花から花粉と各品種のピストルの別のセットを受粉します。72時間後、湿った花屋の泡からピストルを取り出し、3:1エタノールから酢酸への固定溶液でピストルを摂氏4度で少なくとも24時間固定します。その後、固定液を捨てて75%エタノールを加え、サンプルが溶液に完全に沈み込まないようにします。試料は使用するまで摂氏4度でエタノールに保存することができます。固化花粉発芽培地でコントロール受粉に使用される同じ品種の花粉粒を散乱し、24時間後に顕微鏡下で観察する。1回の洗浄で蒸留水で3回洗浄して、顕微鏡用ピストルを準備します。最後の洗浄後、24時間摂氏4度で5%亜硫酸ナトリウムに入れます。その後、組織を柔らかくするために亜硫酸ナトリウムで10分間平方メートルあたり1キログラムでそれらをオートクレーブします。ガラススライドの上にオートクレーブピストルを置き、メスを使用して卵巣の周りの毛状突起を取り除きます。その後、カバーグラスでピストルを押しつぶします。花粉管の成長中に無神経な堆積物を染色し、原稿の指示に従って顕微鏡でスタイルに沿って花粉管を観察する準備の上にアニリンブルーの滴を適用します。春に採取した若葉からゲノムDNAを抽出する市販キットを使用します。次に原稿の指示に従って試薬を組み合わせてPCRをセットアップします。反応ミックスをボルテックスし、PCRプレート内のウェル間で分配する。各ウェルに1マイクロリットルのDNA希釈液を加え、原稿に概説されているサーモサイクリングプログラムを使用してPCRを実行します。反応が完了したら、毛細管電気泳動またはアガロースゲル電気泳動を用いて結果を解析します。毛細管電気泳動の場合は、水の蒸発を防ぐために、1滴のミネラルオイルと一緒に、PCR産物の1マイクロリットルをリーダープレートのウェルに加えます。次いで分離バッファーを添加して分離プレートを準備します。遺伝子分析装置の市販ソフトウェアを使用して、新しいサンプルプレートを作成し、プレート上のすべてのウェルのサンプル名を保存します。次に、分析方法を選択し、2つのプレートを遺伝子分析装置に挿入します。キャピラリーアレイに蒸留水を充填します。リニアポリアクリルアミドゲルをロードし、実行をクリックします。PCR結果をゲル電気泳動で分析する場合は、原稿の指示に従って電気泳動実行バッファーにアガロースを溶解して1%アガロースゲルを調製します。その後、ゲルに核酸染色の4マイクロリットルを追加し、穏やかに混合します。くしでゲルトレイを設定し、泡を避けるために注意して真ん中にゲルを注ぎます。ゲルを完全に固まるまで室温にして、約30〜45分間放置する。その後、電気泳動室に入れます。コームを取り外し、1x TAEバッファで覆います。ゲルにDNAラダーをセットし、続いてPCR製品をローディング染料と混合します。その後、青い染料ラインがゲルレーンの約75%になるまで、60〜90分間90ボルトでゲルを実行します。実行が完了したら、トランイルミニューエータを使用してゲルを視覚化します。自己及びクロス受粉における花粉管の成長は、各品種の自己(in)適合性を決定する蛍光顕微鏡法によって観察された。品種は、花粉管の成長が逮捕されたときに自己互換性がないと考えられ、少なくとも1つの花粉管がスタイルのベースに達したときに自己互換性がありました。5プライマーペアの組み合わせは、毛細血管またはゲル電気泳動と組み合わせてPCRを使用してS対立遺伝子を同定するために使用した。まず、S-対立体を、SRcプライマー対を用いた最初のS-RNaseイントロンの増幅によって同定した。次に、RNaseの第2イントロンを、S6、S9、S1、およびS7対立を区別するために3つのプライマーセットで増幅した。そしてSFB遺伝子のV2およびHVB可変領域を、ScおよびS8対立遺伝子を同定するために設定されたAprFBC8プライマーで増幅した。いったんS対立遺伝子が同定されると、相互に非互換である遺伝子型との異なる非互換性グループを確立することができる。毛細管電気泳動では、フラグメントサイズの違いが不正確なアレル同定を引き起こすため、より多くの違いを報告できる自動フラグメント分析システムを使用するため、制御を使用することを忘れないでください。顕微鏡観察と遺伝子解析の組み合わせは、アプリコットの自己非適合性を決定し、品種間の非互換性関係を確立するために非常に有用なアプローチをもたらしました。自己非互換性は現在、アプリコットの地元の人々へのリンクです。要因の決定が関係しているようです。将来の努力は、アプリコットでこの品種の遺伝的な教化に焦点を当てる必要があります。このドキュメンタリーアプローチの組み合わせは、アプリコットの繁殖プログラムで商業果樹園とパターン遺伝子型の品種の適切な選択のための貴重な情報をもたらす。同様のアプローチは、他の木質多年生作物で使用することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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