Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, Eu (AGL2016-77267-R, og AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-European Social Fund, Eu (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad og Agroseguro S.A.

1. Bestemmelse av selvkompatibilitet
<ol><li>Prøv blomstene i feltet. Det er nødvendig å samle blomstene på ballongstadiet (Figur 1A), tilsvarende trinn 58 på BBCH-skalaen for aprikos28, for å unngå uønsket tidligere pollinering.</li>
	<li>
Selv- og krysspollineringer i laboratoriet
	<ol>
<li>Fjern anthers av blomstene på ballong scenen og plassere dem på et stykke papir for å tørke ved laboratorietemperatur.</li>
		<li>...

Tradisjonelt var de fleste kommersielle aprikoseuropeiske sorter selvkompatibele36. Likevel har bruken av nordamerikanske selvkompatibele sorter som foreldre i avlsprogrammer de siste tiårene resultert i utgivelsen av et økende antall nye selvkompatibele kultigjenstander med ukjente pollineringskrav7,8,37. Dermed er fastsettelsen av selv- og inter-(in)kompatibilitetsforhold i aprikoskuler stadig viktige...

Selvinkompatibilitet er en strategi for blomstrende planter for å hindre selvpollinering og fremme outcrossing1. I Rosaceae, denne mekanismen bestemmes av en Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) som hovedsakelig styres av multiallelic locus S2. I stil, RNase genet koder S-stylar determinant, en RNase3, mens en F-boks protein, som bestemmer S-pollen determinant, er kodifisert av SFB genet4. Den selvinkompatibilitet interaksjon finner sted gjennom hemming av pollen rør vekst langs stilen hindrer befruktning av ovule5,6.
I aprikos har en variantfornyelse funnet sted over hele verden i de siste to tiårene7,8. Denne innføringen av et viktig antall nye sorter, fra ulike offentlige og private avlsprogrammer, har resultert i økningen av aprikoskulter med ukjente pollineringskrav8.
Ulike metoder har blitt brukt til å bestemme pollineringskrav i aprikos. I feltet kan selvkompatibilitet etableres ved kontrollerte pollineringer i burtrær eller i emasculated blomster og deretter registrere prosentandelen av frukt sett9,10,11,12. I tillegg har kontrollerte pollineringer blitt utført i laboratoriet av semi-in vivo kultur av blomster og analyse av pollen rør atferd under fluorescens mikroskopi8,13,14,15,16,17. Nylig har molekylære teknikker, som PCR-analyse og sekvensering, tillatt karakterisering av inkompatibilitetsrelasjoner basert på studiet av RNase- og SFB-genene 18,19. I aprikos, trettitre S-alleles har blitt rapportert (S1 til S20, S22 til S30, S52, S53, Sv, Sx), inkludert en allele relatert til selvkompatibilitet (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Hittil har 26 inkompatibilitetsgrupper blitt knivstukket i denne arten i henhold til S-genotype8,9,17,25,26,27. Sorter med samme S-alleles er inter-uforenlige, mens sorter med minst en annen S-allele og dermed tildelt i forskjellige inkompatible grupper, er inter-kompatible.
For å definere pollineringskravene til aprikoskuler, beskriver vi en metodikk som kombinerer fastsettelse av selv-(i)kompatibilitet ved fluorescensmikroskopi med identifisering av S- genotype etter PCR-analysei aprikoskuler. Denne tilnærmingen gjør det mulig å etablere inkompatibilitetsgrupper og belyse inkompatibilitetsrelasjoner mellom sorter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Selvinkompatibilitet i Rosaceae bestemmes av et Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) som hovedsakelig styres av multiallelic locus S. I aprikos er fastsettelsen av selv- og inter-(in)kompatibilitetsforhold stadig viktigere, siden utgivelsen av et viktig antall nye sorter har resultert i økningen av sorter med ukjente pollineringskrav. Her beskriver vi en metodikk som kombinerer fastsettelse av selv-(i)kompatibilitet ved hånd-pollineringer og mikroskopi med identifisering av S-genotype etter PCR-analyse. For selvbestemmelse av kompatibilitet ble blomster på ballongstadiet fra hver sortiator samlet i feltet, håndpollinert i laboratoriet, fast og farget med anilinblå for observasjon av pollenrøratferd under fluorescensmikroskopien. For etablering av inkompatibilitetsforhold mellom sorter ble DNA fra hver sort ble hentet fra unge blader og S-alleles identifisert av PCR. Denne tilnærmingen gjør det mulig å etablere inkompatibilitetsgrupper og belyse inkompatibilitetsforhold mellom sorter, som gir en verdifull informasjon for å velge egnede pollinizers i utformingen av nye frukthager og å velge passende foreldre i avlsprogrammer.

Pollineringsstudier i aprikos krever bruk av blomster på sen ballongstadiet en dag før antese (figur 1A). Dette stadiet regnes som den mest gunstige for både pollen og støvbærersamling, siden blomsterstrukturer er nesten modne, men anther dehiscence har ennå ikke skjedd. Dette forhindrer interferens av uønsket pollen, ikke bare av pollen fra samme blomst, men også fra andre blomster, siden de lukkede kronbladene hindrer ankomsten av insekter som bærer ekstern pollen...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Vi presenterer en metodikk for å etablere pollineringskravene til aprikos (Prunus armeniaca L.) sorter som kombinerer fastsettelse av selv-(i)kompatibilitet ved fluorescensmikroskopi med identifisering av S-genotype ved PCR-analyse.

Bestemmelse av selv- og inter-in)kompatibilitetsrelasjoner i aprikos kombinere hånd-pollinering, mikroskopi og genetiske analyser

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Denne metoden kan bidra til å bestemme pollineringskrav i ulike arter og etablere inkompatibilitetsforhold mellom sorter. Den største fordelen med denne tilnærmingen er at den gjør det mulig å evaluere flere inkompatibilitet under laboratorieforhold. Unngå de mange problemene som kan oppstå i eksperimenter utført under feltforhold.Dette tillater identifikasjon sammen med dedikasjon av en rekke sorter til de tilsvarende inkompatibilitetsgruppene. Bestemme inter-kompatibilitet forholdet mellom sorter. Denne tilnærmingen kan også være nyttig for å bestemme selvinkompatibilitet og inkompatibilitetsforhold i andre frukttreavlinger som kirsebær eller plomme.Begynn med å prøve blomster i feltet. Samle blomstene på ballong scenen, som tilsvarer Stage 58 på BBCH skala for aprikos for å unngå tidligere pollinering. I laboratoriet fjerner du blomstenes anthers og legger dem på et stykke papir for å tørke ved romtemperatur.Etter 24 timer sikt pollenkornene med et fint 26 millimeter nett. Emaskuler en gruppe på 30 blomster på samme ballong utviklingsstadium for hver selv-og krysspollinering og plassere pistolene på blomsterhandler skum i vann 24 timer etter emasculation og pollinere pistoler ved hjelp av en pensel med pollen fra blomster av samme sortimulering. Polliner et annet sett med pistoler av hver sort med pollen fra blomster av en kompatibel pollinizer som en kontroll.Etter 72 timer, fjern pistolene fra det våte blomsterhandlerskummet og fest pistolene i en fikseringsløsning på 3:1 etanol til eddiksyre i minst 24 timer ved 4 grader Celsius. Kast deretter fikseringen og tilsett 75% etanol, og pass på at prøvene er helt nedsenket i løsningen. Prøver kan lagres i etanol ved 4 grader Celsius til bruk.Spre pollenkornene til de samme sortitørene som brukes til kontrollpollineringene i størknet pollenspiringsmedium og observere dem under mikroskopet etter 24 timer. Forbered pistolene for mikroskopi ved å vaske dem 3 ganger med destillert vann i en time per vask. Etter siste vask, la dem stå i 5% natriumsulfitt ved 4 grader Celsius i 24 timer.Deretter autoklav dem på ett kilo per centimeter kvadrert i 10 minutter i natriumsulfitt for å myke vevet. Plasser de autoklavet pistolene over et glasssklie og bruk en skalpell for å fjerne trichomes rundt eggstokken. Deretter squash pistolen med et dekkglass.Påfør en dråpe anilinblå over preparatene for å flekke ufølsomme avsetninger under pollenrørvekst og observere pollenrørene langs stilen med et mikroskop i henhold til manuskriptretninger. Bruk et kommersielt sett for å trekke ut genomisk DNA fra unge blader samlet inn om våren. Deretter setter du opp PCR ved å kombinere reagenser i henhold til manuskriptretninger.Vortexing reaksjonsblandingen og distribuere den mellom brønnene i PCR-platen. Tilsett 1 mikroliter av DNA-fortynningen i hver brønn og kjør PCR ved hjelp av termo-sykkelprogrammet som er skissert i manuskriptet. Når reaksjonen er fullført, analyser resultatene ved hjelp av kapillær elektroforese eller agarose gel elektroforese.For kapillær elektroforese tilsett 1 mikroliter av PCR-produktet i brønnen på leserplaten sammen med 1 dråpe mineralolje for å forhindre vannfordampning. Klargjør deretter separasjonsplaten ved å legge til separasjonsbuffer. Bruk den kommersielle programvaren for genanalysatoren til å lage en ny prøveplate og lagre prøvenavnene for alle brønnene på platen.Velg deretter analysemetoden og sett de to platene inn i genanalysatoren. Fyll kapillærmatrisen med destillert vann. Last den lineære polyakrylamidgelen og klikk løp.Hvis du analyserer PCR-resultatene med gelelektroforese, må du lage en 1% agarosegel ved å oppløse agarose i elektroforese løpebuffer i henhold til manuskriptretninger. Tilsett deretter 4 mikroliter nukleinsyreflekk til gelen og bland forsiktig. Sett opp et gelbrett med en kam og senking hell gelen i midten og ta vare på å unngå bobler.La gelen stå ved romtemperatur til den er helt størknet, ca. 30-45 minutter. Deretter settes inn i elektroforesekammeret. Fjern kammen og dekk den med 1x TAE buffer.Legg gelen med DNA-stigen etterfulgt av PCR-produktene blandet med lastefargestoff. Kjør deretter gelen på 90 volt i 60-90 minutter til den blå fargestofflinjen er på ca 75% av gelbanen. Når løpet er fullført, visualiser gelen ved hjelp av en transilluminator.Pollenrørvekst i selv- og krysspollineringer ble observert av fluorescensmikroskopi for å bestemme selv(i)kompatibilitet for hver sort. Sorter ble ansett som selvkompatibel når pollen rør vekst ble arrestert og selvkompatibel når minst en pollen rør nådde bunnen av stilen. 5 primere parkombinasjoner ble brukt til å identifisere S-alleler ved hjelp av PCR i kombinasjon med kapillær eller gelelektroforese.Først ble S-allelene identifisert ved forsterkning av den første S-RNase intron ved hjelp av SRc primer paret. Deretter ble den andre intronen av RNase forsterket med tre primer sett for å skille S6, S9, S1 og S7 alleler. Og V2- og HVB-variable regionene i SFB-genet ble forsterket med AprFBC8-primeren satt til å identifisere Sc- og S8-allelene.Når S-allelene var identifisert, kan ulike inkompatibilitetsgrupper med genotypene som er interkompatiable, etableres. Det er viktig å huske å bruke kontroll i kapillær elektroforese, siden de bruker et automatisk fragmentanalysesystem som kan rapportere som flere forskjeller i fragmentstørrelse som forårsaker unøyaktig alleleidentifikasjon. Kombinasjonen av mikroskopiobservasjoner og genetisk analyse har resultert i en svært nyttig tilnærming for å bestemme selvinkompatibilitet i aprikos og etablere inkompatibilitetsforholdene mellom sorter.Selvinkompatibilitet er nå koblingen til lokalbefolkningen i aprikos. Fastsettelsen av faktorer synes å være involvert. Fremtidig innsats må fokuseres på den genetiske oppnettingen av denne sorten i aprikos.Kombinasjonen av denne dokumentartilnærmingen resulterer i verdifull informasjon for riktig valg av sorter i kommersielle frukthager og mønster genotyper i aprikos avlsprogrammer. En lignende tilnærming kan brukes i andre treaktige flerårige avlinger.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering av kardiomyocytt DNA syntese og ploidiundersøkelse: En metode for å hjelpe Kvantifisering av kardiomyocytt Regeneration og Omsetning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Kombinerer Intravital fluorescerende mikroskopi (IVFM) med genetisk modeller å studere Engraftment dynamikken i blodkreft cellene benmarg nisjer

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Visualisering av cellesyklus Variasjoner og Bestemmelse av Nukleasjon i postnatal cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyser og gen-funksjon studier med Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiske analyser av akutt alkoholskader i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Behandling av menneskelig hjerte vev mot ekstracellulær Matrix selv montering Hydrogel for In Vitro og i Vivo programmer

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Flere hierarkisk Imaging av føljetong delene for å finne konkrete mobilnettet mål i store volumer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Kvantifisering av Self-fornyelse i murine Mammosphere kulturer

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...