Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, União Europeia (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-000); Gobierno de Aragón-European Social Fund, União Europeia (Grupo Consolidado A12_17R), Fundação Biodiversidad e Agroseguro S.A.

1. Determinação de auto-(in)compatibilidade
<ol><li>Prove as flores no campo. É necessário coletar as flores no estágio do balão(Figura 1A),correspondente ao estágio 58 na escala BBCH para damasco28, para evitar polinização prévia indesejada.</li>
	<li>
Polinizações auto e cruzadas em laboratório
	<ol>
<li>Retire os anteratos das flores no estágio do balão e coloque-os em um pedaço de papel para secar à temperatura ...

Tradicionalmente, a maioria das cultivares europeias de damasco comercial eram autocompatíveis36. No entanto, o uso de cultivares autocompatíveis norte-americanas como pais em programas de reprodução nas últimas décadas resultou na liberação de um número crescente de novas cultivares auto-incompatíveis com requisitos de polinização desconhecidos7,,8,,37. Assim, a determinação das relações ...

A autoincompatibilidade é uma estratégia de floração das plantas para prevenir a auto polinização e promover o outcrossing1. Em Rosaceae, esse mecanismo é determinado por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multitélico S2. No estilo, o gene RNase codifica o determinante S-stylar, um RNase3, enquanto uma proteína F-box, que determina o determinante do pólen S,é codificada pelo gene SFB 4. A interação de autoincompatibilidade ocorre através da inibição do crescimento do tubo de pólen ao longo do estilo que impede a fertilização do ovule5,6.
No damasco, uma renovação varietal ocorreu em todo o mundo nas últimas duas décadas7,8. Essa introdução de um importante número de novas cultivares, de diferentes programas de reprodução pública e privada, resultou no aumento de cultivares de damasco com requisitos desconhecidos de polinização8.
Diferentes metodologias têm sido usadas para determinar os requisitos de polinização em damasco. No campo, a auto-compatibilidade pode ser estabelecida por polinização controlada em árvores enjauladas ou em flores emasculadas e,posteriormente,registrando o percentual de conjunto de frutas9,10,,11,12. Além disso, polinizações controladas têm sido realizadas em laboratório pela cultura semi-in vivo de flores e análise do comportamento do tubo de pólen sob microscopia de fluorescência8,,13,,14,,15,,16,17. Recentemente, técnicas moleculares, como análise e sequenciamento de PCR, permitiram a caracterização de relações de incompatibilidade com base no estudo dos genes RNase e SFB 18,19. No damasco, foram relatados 33 S-alelos(S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), incluindo um alelo relacionado com auto-compatibilidade(Sc)12, 18,,18,20,,21,,22,,23,,24. Até agora, 26 grupos de incompatibilidade foram estabelecidos nesta espécie de acordo com o S-genótipo8,9,17,25,26,27. Cultivares com os mesmos alelos Ssão intercompatíveis, enquanto cultivares com pelo menos um s-alelodiferente e, consequentemente, alocados em diferentes grupos incompatíveis, são intercompatíveis.
Para definir os requisitos de polinização das cultivares de damasco, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do genótipo Spela análise pcr em cultivares de damasco. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

A autoincompatibilidade em Rosaceae é determinada por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multiloelico S. No damasco, a determinação das relações de auto e inter-(in)compatibilidade é cada vez mais importante, uma vez que a liberação de um importante número de novas cultivares resultou no aumento de cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Aqui, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por polinizações manuais e microscopia com a identificação do genótipo Spela análise pcr. Para a determinação de auto-(in)compatibilidade, foram coletadas flores em fase de balão de cada cultivar no campo, polinizado à mão em laboratório, fixado e manchado com azul anilina para observação do comportamento do tubo de pólen sob a microscopia de fluorescência. Para o estabelecimento de relações de incompatibilidade entre cultivares, o DNA Sde cada cultivar foi extraído de folhas jovens e S-alelos foram identificados pela PCR. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares, o que fornece informações valiosas para escolher polinizadores adequados na concepção de novos pomares e selecionar pais apropriados em programas de reprodução.

Estudos de polinização em damasco exigem o uso de flores na fase final do balão um dia antes da anestesia (Figura 1A). Esta etapa é considerada a mais favorável tanto para a coleta de pólen quanto para pistil, uma vez que as estruturas florais estão quase maduras, mas a deshiscência anther ainda não ocorreu. Isso evita a interferência de pólen indesejado, não só de pólen da mesma flor, mas também de outras flores, uma vez que as pétalas fechadas impedem a che...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Determinação das Relações de Auto e Inter-(in)compatibilidade em Damasco combinando polinização manual, microscopia e análises genéticas

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Este método pode ajudar a determinar os requisitos de polinização em diferentes espécies e estabelecer relações de incompatibilidade entre cultivares. A principal vantagem dessa abordagem é que permite avaliar várias incompatibilidades em condições laboratoriais. Evitando os inúmeros problemas que podem ocorrer em experimentos realizados em condições de campo.Isso permite a identificação, juntamente com a dedicação de uma série de cultivares aos grupos de incompatibilidade correspondentes. Determinando a relação inter-compatibilidade entre cultivares. Essa abordagem também pode ser útil para determinar a autocompatibilidade e a incompatibilidade em outras culturas de árvores frutíferas, como cereja ou ameixa.Comece por provar as flores no campo. Colete as flores na fase de balão, que corresponde ao Estágio 58 na escala BBCH para damasco para evitar a polinização anterior. No laboratório, retire os anteratos das flores e coloque-as em um pedaço de papel para secar à temperatura ambiente.Depois de 24 horas, peneirar os grãos de pólen com uma malha fina de 26 milímetros. Emascular um grupo de 30 flores no mesmo estágio de desenvolvimento de balões para cada polinização auto e cruzada e colocar as pistolas na espuma florista na água 24 horas após a emasculação e polinizar as pistolas usando um pincel com pólen de flores da mesma cultivar. Polinizar outro conjunto de pistolas de cada cultivar com pólen de flores de um polinizador compatível como controle.Após 72 horas, retire as pistolas da espuma florista molhada e fixe as pistolas em uma solução fixa de 3:1 etanol para ácido acético por pelo menos 24 horas a 4 graus Celsius. Em seguida, descarte o fixador e adicione 75% de etanol, certificando-se de que as amostras estão completamente submersas na solução. As amostras podem ser armazenadas no etanol a 4 graus Celsius até o uso.Espalhe os grãos de pólen das mesmas cultivares utilizadas para as polinizações de controle em meio de germinação solidificada de pólen e observe-os sob o microscópio após 24 horas. Prepare as pistolas para microscopia lavando-as 3 vezes com água destilada durante uma hora por lavagem. Após a última lavagem, deixe-os em 5% de sulfito de sódio a 4 graus Celsius por 24 horas.Em seguida, autoclave-os a um quilograma por centímetro quadrado por 10 minutos em sulfite de sódio para suavizar o tecido. Coloque as pistolas autoclaved sobre um slide de vidro e use um bisturi para remover as casas tricas ao redor do ovário. Em seguida, esmague a pistola com um óculos de cobertura.Aplique uma gota de azul anilina sobre os preparativos para manchar depoimentos insensos durante o crescimento do tubo de pólen e observe os tubos de pólen ao longo do estilo com um microscópio de acordo com as instruções do manuscrito. Use um kit comercial para extrair DNA genômico de folhas jovens coletadas na primavera. Em seguida, configure o PCR combinando reagentes de acordo com as instruções do manuscrito.Vortexing a mistura de reação e distribuindo-o entre os poços na placa PCR. Adicione 1 microliter da diluição de DNA em cada poço e execute PCR usando o programa termociclístico descrito no manuscrito. Uma vez que a reação esteja completa, analise os resultados usando eletroforese capilar ou eletroforese de gel agarose.Para a eletroforese capilar adicione 1 microliter do produto PCR no poço da placa do leitor, juntamente com 1 gota de óleo mineral para evitar a evaporação da água. Em seguida, prepare a placa de separação adicionando tampão de separação. Use o software comercial para o analisador genético para criar uma nova placa de amostra e salvar os nomes da amostra para todos os poços na placa.Em seguida, selecione o método de análise e insira as duas placas no analisador genético. Encha a matriz capilar com água destilada. Carregue o gel de poliacrilamida linear e clique em executar.Se analisar os resultados do PCR com eletroforese de gel, prepare um gel de 1% de agarose dissolvendo agarose em tampão de execução eletroforese de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, adicione 4 microliters de mancha de ácido nucleico ao gel e misture suavemente. Configure uma bandeja de gel com um pente e a lentidão despeje o gel no meio, tomando cuidado para evitar bolhas.Deixe o gel em temperatura ambiente até solidificar completamente, cerca de 30-45 minutos. Então coloque na câmara de eletroforese. Remova o pente e cubra-o com 1x de tampão TAE.Carregue o gel com a escada de DNA seguido pelos produtos PCR misturados com corante de carga. Em seguida, execute o gel a 90 volts por 60-90 minutos até que a linha de corante azul esteja em aproximadamente 75% da pista de gel. Uma vez que a corrida esteja completa, visualize o gel usando um transilluminador.O crescimento do tubo de pólen em polinizações auto e cruzadas foi observado por microscopia de fluorescência para determinar a compatibilidade auto(in)para cada cultivar. As cultivares foram consideradas auto-incompatíveis quando o crescimento do tubo de pólen foi preso e autocompatível quando pelo menos um tubo de pólen atingiu a base do estilo. 5 combinações de pares de primers foram usadas para identificar S-alelos usando PCR em combinação com eletroforese capilar ou gel.Primeiro, os selados S foram identificados pela amplificação do primeiro intron S-RNase usando o par de primer SRc. Em seguida, o segundo intron da RNase foi amplificado com três conjuntos de primer para distinguir alelos S6, S9, S1 e S7. E as regiões variáveis V2 e HVB do gene SFB foram amplificadas com o primer AprFBC8 definido para identificar os alelos Sc e S8.Uma vez identificados os S-alelos, diferentes grupos de incompatibilidade com os genótipos intercompatíveis podem ser estabelecidos. É importante lembrar de usar o controle em eletroforese capilar, uma vez que eles usam um sistema automático de análise de fragmentos que pode relatar como mais diferenças no tamanho do fragmento causando identificação de alelo imprecisa. A combinação de observações de microscopia e análise genética resultou em uma abordagem muito útil para determinar a autocompatibilidade no damasco e estabelecer as relações de incompatibilidade entre as cultivares.A autoincompatibilidade é agora o elo com os locais em damasco. A determinação dos fatores parece estar envolvida. O esforço futuro deve ser focado na edificação genética desta cultivar em damasco.A combinação desta abordagem documental resulta em informações valiosas para a seleção adequada de cultivares em pomares comerciais e genótipos de padrões em programas de criação de damascos. Uma abordagem semelhante pode ser usada em outras culturas perenes amadeiradas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Biologia do Desenvolvimento

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...