Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Это исследование финансировалось Ministerio de Ciencia, Innovaci'n y Universidades-Европейский фонд регионального развития, Европейский союз (AGL2016-77267-R, и AGL2015-74071-JIN); Национальный институт Инвестигазон-и-Текнология Агрария и Алиментария (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Европейский социальный фонд Гобьерно-де-Арагон, Европейский союз (A12_17R A12_17R, Фонд Биодиверсидад и Агросегуро С.А.

1. Определение самоуправства (в)совместимости
<ol><li>Попробуйте цветы в поле. Необходимо собрать цветы на воздушном шаре этапе(рисунок 1А), соответствующие стадии 58 по шкале BBCH для абрикоса28, чтобы избежать нежелательных предыдущих опыления.</li>
	<li>
<str...

Традиционно, большинство коммерческих абрикосовых европейских сортов были совместимы36. Тем не менее, использование североамериканских самоухотных сортов в качестве родителей в программах разведения в последние десятилетия привело к выпуску все большего числа новых нес...

Самосовместимость является стратегия цветения растений для предотвращения самоопыления и содействия outcrossing1. В Rosaceae этот механизм определяется гаметофитической системой самосовместимости (GSI), которая в основном контролируется многоаллюровым локусом S2. В стиле, ген RNase кодирует S-stylar determinant, RNase3, в то время как белок F-box, который определяет S-пыльцудетерминант, кодифицирован геном SFB 4. Взаимодействие с автосмешазнанием происходит через ингибирование роста пыльцевой трубки по стилю, предотвращающее оплодотворение яйцеклетки5,,6.
В абрикосе, разнообразие обновления состоялась во всем мире в последние два десятилетия7,8. Это введение значительного количества новых сортов, из различных государственных и частных программ разведения, привело к увеличению сортов абрикоса с неизвестными требованиями опыления8.
Различные методологии были использованы для определения требований опыления в абрикосе. В поле, самостоятельной (в) совместимость может быть установлена контролируемых опыляний в клетке деревьев или в выхолощенных цветов, а затем записи процент фруктов набор9,10,11,12. Кроме того, в лаборатории были проведены контролируемые опыления полуинфицейной культурой цветов и анализ поведения пыльцы трубки под флуоресценцией микроскопии8,,13,,14,,15,,16,17. В последнее время молекулярные методы, такие как анализ пЦР и секвенирование, позволили характеристику несовместимости отношений на основе изучения генов RNase и SFB 18,19. В абрикосе, тридцать три S-аллелей были зарегистрированы (S1 до S20, S22 до S30, S52, S53, SV, Sх), в том числе один аллель, связанные с само совместимости (Sc)12,18,20,21,22,23,24. До сих пор, 26 групп несовместимости были стабилизированных в этом виде в соответствии сS-генотип8,9,17,25,26,27. Сорта с теми Sже S-аллелями несовместимы, в то время как сорта с по крайней мере с одним разным S-аллельом и, следовательно, распределенные в разных несовместимых группах, являются взаимосвязанными. S
Для определения требований к опыления абрикосовых сортов мы описываем методологию, которая сочетает в себе определение самостоятельной (в) совместимости флуоресценции микроскопии с определением S-генотипапутем анализа ПЦР в абрикосовых сортах. Такой подход позволяет создавать группы несовместимости и выяснение взаимосвязей между сортами.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Самосовместимость в розацеи определяется гаметофитической системой самосовместимости (GSI), которая в основном контролируется мультиаллеловым локусом S. В абрикосе определение отношений между собой и между собой приобретает все большее значение, поскольку высвобождение значительного числа новых сортов привело к увеличению сортов с неизвестными требованиями к опылению. Здесь мы описываем методологию, которая сочетает в себе определение самостоятельности (в) совместимости путем S-ручных опыления и микроскопии с определением S-генотипа путем анализа ПЦР. Для самостоятельного (в) определение совместимости, цветы на воздушном шаре этапе от каждого сорта были собраны в поле, ручной опыляется в лаборатории, фиксированной, и окрашенные с анилиновым синим для наблюдения поведения трубки пыльцы под флуоресценции микроскопии. Для установления несовместимости отношений между сортами, ДНК из каждого сорта Sбыла извлечена из молодых листьев и S-аллели были определены ПЦР. Такой подход позволяет создавать группы несовместимости и выясывать несовместимость отношений между сортами, что дает ценную информацию для выбора подходящих опылителей при проектировании новых садов и выбора соответствующих родителей в программах разведения.

Исследования опыления в абрикосе требуют использования цветов на поздней стадии воздушного шара за день до антеза(Рисунок 1А). Эта стадия считается наиболее благоприятной как для пыльцы, так и для коллекции пистилов, так как цветочные структуры почти зрелые, но...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Представляем методологию определения требований к опылинию сортов абрикоса(Prunus armeniaca L.), сочетающих определение самостоятельной (в) совместимости флуоресценции микроскопией с идентификацией S-генотипа с помощью анализа ПЦР.

Определение отношений к само- и межповреждению в сочетании с абрикосом, комбинируя опыление рук, микроскопию и генетический анализ

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Этот метод может помочь определить требования к опылению у различных видов и установить несовместимость отношений между сортами. Основным преимуществом такого подхода является то, что он позволяет оценить несколько несовместимости в лабораторных условиях. Как избежать многочисленных проблем, которые могут возникнуть в экспериментах, выполняемых в полевых условиях.Это позволяет идентифицировать наряду с посвящением ряда сортов соответствующим группам несовместимости. Определение взаимосвязи между сортами совместимости. Этот подход также может быть полезен для определения взаимосвязи между самосовместимостью и несовместимостью в других культурах плодовых деревьев, таких как вишня или слива.Начните с отбора проб цветов в поле. Соберите цветы на этапе воздушного шара, который соответствует этапу 58 по шкале BBCH для абрикоса, чтобы избежать предыдущего опыления. В лаборатории удалите пыльы цветов и поместите их на лист бумаги, чтобы высохнуть при комнатной температуре.Через 24 часа сито пыльцы зерна с тонкой 26 миллиметровой сеткой. Emasculate группы из 30 цветов на той же стадии развития шара для каждого самоуправления и перекрестного опыления и место пистолеты на флорист пены в воде 24 часов после выхолощения и опылить пистолеты с помощью кисти с пыльцой из цветов того же сорта. Опылять другой набор пистолетов каждого сорта с пыльцой из цветов совместимого опылителя в качестве контроля.Через 72 часа, удалить пистолеты из мокрой пены флориста и исправить пистолеты в фиксативном растворе 3:1 этанола уксусной кислоты, по крайней мере 24 часов при 4 градусах по Цельсию. Затем отбросьте фиксатор и добавьте 75% этанола, убедившись, что образцы полностью погружены в раствор. Образцы могут храниться в этаноле при 4 градусах цельсия до их использования.Разбросать пыльцевые зерна тех же сортов, используемых для контроля опылений в затвердело пыльцы прорастания среды и наблюдать их под микроскопом после 24 часов. Подготовка пистолетов для микроскопии путем мытья их 3 раза с дистиллированной водой в течение одного часа за стирку. После последней стирки оставьте их в 5% сульфита натрия при 4 градусах по Цельсию в течение 24 часов.Затем автоклав их на один килограмм сантиметра в квадрате в течение 10 минут в сульфите натрия, чтобы смягчить ткани. Поместите автоматические пистолеты на стеклянную горку и используйте скальпель, чтобы удалить трихомы вокруг яичника. Затем раздавить пистолет с крышкой.Нанесите каплю анилинового синего цвета на препараты, чтобы испачкать мозкие отемки во время роста пыльцы и наблюдать за пыльцой трубок вдоль стиля с микроскопом в соответствии с рукописными указаниями. Используйте коммерческий комплект для извлечения геномной ДНК из молодых листьев, собранных весной. Затем на настройку ПЦР путем объединения реагентов в соответствии с рукописными указаниями.Вихревая смесь реакции и распределение ее между скважинами в пластине ПЦР. Добавьте 1 микролитр разбавления ДНК в каждый колодец и запустите ПЦР с помощью термо-велосипедной программы, изложенной в рукописи. После завершения реакции проанализируйте результаты с помощью капиллярного электрофореза или электрофореза агарозного геля.Для капиллярного электрофореза добавьте 1 микролитр продукта ПЦР в колодец плиты считывателя вместе с 1 каплей минерального масла для предотвращения испарения воды. Затем подготовьте разделительную пластину, добавив буфер разделения. Используйте коммерческое программное обеспечение для анализа генов, чтобы создать новую пластину образца и сохранить имена образцов для всех скважин на пластине.Затем выберите метод анализа и вставьте две пластины в анализатор генов. Заполните капиллярный массив дистиллированной водой. Загрузите линейный полиакриламинидный гель и нажмите пробег.При анализе результатов ПЦР с помощью гель-электрофорез, подготовить 1%agarose гель путем растворения агарозы в электрофорез работает буфер в соответствии с рукописными направлениями. Затем добавьте 4 микролитров пятна нуклеиновой кислоты в гель и аккуратно перемешайте. Настройка гель лоток с гребнем и замедление залить гель в середине заботясь, чтобы избежать пузырьков.Оставьте гель при комнатной температуре до полного затвердеть, около 30-45 минут. Затем положить в камеру электрофорез. Снимите гребень и накройте его 1x буфером TAE.Загрузите гель с помощью ДНК-лестницы, за которой последуют продукты ПЦР, смешанные с погрузочным красителем. Затем запустите гель на 90 вольт в течение 60-90 минут, пока синий краситель линия составляет примерно 75% от геля переулок. После завершения пробега визуализуйте гель с помощью трансиллюминатора.Рост пыльцы трубки в само- и перекрестных опылений наблюдался с помощью флуоресценции микроскопии, чтобы определить себя (в)совместимость для каждого сорта. Культивары считались несовместимыми, когда рост пыльцы трубки был арестован и совместим, когда по крайней мере одна пыльца трубки достигли основания стиля. 5 комбинаций пары грунтовки были использованы для идентификации S-аллелей с использованием ПЦР в сочетании с капилляром или гель-электрофорезом.Во-первых, S-аллели были определены по усилению первого S-RNase интрона с помощью пары SRc грунтовки. Затем второй интрон RNase был усилен тремя наборами грунтовки, чтобы различать аллели S6, S9, S1 и S7. И V2 и HVB переменных регионах гена SFB были усилены aprFBC8 грунтовки набор для выявления Sc и S8 аллели.После того, как S-аллели были определены, различные группы несовместимости с генотипами, которые являются взаимо несовместимыми могут быть установлены. Важно помнить, чтобы использовать контроль в капиллярных электрофорез, так как они используют автоматическую систему анализа фрагментов, которые могут сообщить, как больше различий в размерах фрагментов вызывает неточную идентификацию аллелей. Сочетание наблюдений микроскопии и генетического анализа привело к очень полезному подходу к определению само несовместимости абрикоса и установлению несовместимости между сортами.Самосовместимость в настоящее время является связующим звеном с местными жителями в абрикосе. Определение факторов, как представляется, связано с этим. Будущие усилия должны быть сосредоточены на генетическом назиданию этого сорта абрикоса.Сочетание этого документального подхода приводит к получению ценной информации для соответствующего выбора сортов в коммерческих садах и генотипов в программах разведения абрикосов. Аналогичный подход может быть использован и в других древесных многолетних культур.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Обработка тканей человека сердца к внеклеточного матрикса самостоятельной сборки Гидрогель для In Vitro и In Vivo приложений

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Количественная оценка самообновления в культурах Murine Mammosphere

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...