Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Denna forskning finansierades av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, Europeiska unionen (AGL2016-77267-R och AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Europeiska socialfonden, Europeiska unionen (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad och Agroseguro S.A.

1. Fastställande av själv(i)förenlighet
<ol><li>Prova blommorna på fältet. Det är nödvändigt att samla blommorna på ballongstadiet (Figur 1A), motsvarande steg 58 på BBCH-skalan för aprikos28, för att undvika oönskad tidigare pollinering.</li>
	<li>
Själv- och korspollinationer i laboratoriet
	<ol>
<li>Ta bort anthers av blommorna på ballong skede och placera dem på ett papper för att torka vid laboratorietemperatur...

Traditionellt var de flesta kommersiella aprikos europeiska sorter självkompatibla36. Ändå har användningen av nordamerikanska själv oförenliga sorter som föräldrar i avelsprogram under de senaste decennierna resulterat i frisläppandet av ett ökande antal nya själv oförenliga sorter med okänd pollinering krav7,8,37. Således är fastställandet av själv- och inter-(in)kompatibilitetsrelation...

Självinkompatibilitet är en strategi för blommande växter för att förhindra självpollinering och främja outcrossing1. I Rosaceae bestäms denna mekanism av ett gametophytic självinkompatibilitetssystem (GSI) som huvudsakligen styrs av multiallelic locus S2. I stil, RNase genen kodar S-stylar avgörande, en RNase3, medan en F-box protein, som bestämmer S-pollen beterminant, kodifieras av SFB genen 4. Den självinkompatibilitet interaktion sker genom hämning av pollen röret tillväxt längs stilen förhindra befruktning av ägglossningen5,6.
I aprikos, en sort förnyelse har ägt rum över hela världen under de senaste två decennierna7,8. Detta införande av ett stort antal nya sorter, från olika offentliga och privata avelsprogram, har resulterat i en ökning av aprikos sorter med okänd pollinering krav8.
Olika metoder har använts för att fastställa pollinering krav i aprikos. På fältet kan självkompatibilitet fastställas genom kontrollerade pollineringar i burträd eller i emasculated blommor och därefter registrera andelen frukt som9,,10,,11,12. Dessutom har kontrollerade pollineringar utförts i laboratoriet genom semi-in vivo kultur av blommor och analys av pollenröret beteende under fluorescensmikroskopi8,13,14,15,16,17. Nyligen har molekylära tekniker, såsom PCR-analys och sekvensering, gjort det möjligt att karakterisera inkompatibilitetsrelationer baserade på studien av RNase- och SFB-generna 18,19. I aprikos har trettiotre S-alleler rapporterats(S1 till S20, S22 till S30, S52, S53, Sv, Sx), inklusive en allel relaterad med självkompatibilitet(Sc)12,18,,20,,21,,22,23,24. Hittills har 26 inkompatibilitetsgrupper huggits i denna art enligt S-genotyp8,9,17,25,26,27. S Sorter med samma S-alleler är oförenliga mellan sorter, medan sorter med minst en annan S-alleloch följaktligen tilldelas i olika oförenliga grupper, är inte förenliga. S
För att definiera pollineringskraven för aprikossorter beskriver vi en metod som kombinerar bestämning av själv-(i)kompatibilitet genom fluorescensmikroskopi med identifiering av S-genotyp genom PCR-analys i aprikossorter. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att upprätta inkompatibilitetsgrupper och belysa inkompatibilitetsrelationer mellan sorter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Självinkompatibilitet i Rosaceae bestäms av ett gametophytic self-inkompatibilitetssystem (GSI) som huvudsakligen styrs av multiallelic locus S. I aprikos, beslutsamheten av själv- och inter-(in)förenlighet förhållandena är mer och mer viktig, sedan frigöraren av ett viktigt nummer av nya kultivars har resulterat i förhöjningen av sorterna med okända pollineringkrav. Här beskriver vi en metod som kombinerar bestämning av själv-(i)kompatibilitet genom handpollinationer och mikroskopi med identifiering av S-genotyp genom PCR-analys. För själv-(i)kompatibilitet bestämning, blommor på ballong skede från varje sort samlades i fältet, handpollinas i laboratoriet, fast, och färgas med aniline blå för observation av pollenröret beteende under fluorescensmikroskopi. För att upprätta oförenlighetsförhållanden mellan sorter extraherades DNA från varje sort från Sunga blad och S-alleler identifierades av PCR. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att upprätta inkompatibilitetsgrupper och belysa oförenlighetsrelationer mellan sorter, vilket ger en värdefull information för att välja lämpliga pollinatörer i utformningen av nya fruktträdgårdar och att välja lämpliga föräldrar i avelsprogram.

Pollineringsstudier i aprikos kräver användning av blommor i slutet av ballongstadiet en dag före antes (figur 1A). Detta skede anses vara den mest gynnsamma för både pollen och fisktillsamling, eftersom blomstrukturer är nästan mogna, men anther dehiscence har ännu inte inträffat. Detta förhindrar inblandning av oönskad pollen, inte bara av pollen från samma blomma utan också från andra blommor, eftersom de slutna kronbladen hindrar ankomsten av insekter som b...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Vi presenterar en metod för att fastställa pollinering krav aprikos(Prunus armeniaca L.) sorter som kombinerar bestämning av self-(in)kompatibilitet genom fluorescensmikroskopi med identifiering av S-genotyp av PCR analys.

Bestämning av själv- och inter-(in)kompatibilitetsrelationer i aprikos som kombinerar handpollinering, mikroskopi och genetiska analyser

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Denna metod kan hjälpa till att bestämma pollineringskrav i olika arter och fastställa oförenlighetsförhållanden mellan sorter. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att det möjliggör utvärdering av flera oförenlighet under laboratorieförhållanden. Undvika de många problem som kan uppstå i experiment som utförs under fältförhållanden.Detta möjliggör identifiering tillsammans med dedikation av ett antal sorter till motsvarande oförenlighet grupper. Fastställande av förhållandet mellan sorter mellan sorter. Detta tillvägagångssätt kan också vara användbart för att bestämma självinkompatibilitet och oförenlighet relation i andra frukt träd grödor som körsbär eller plommon.Börja med att provtagning blommorna i fältet. Samla blommorna i ballongstadiet, vilket motsvarar Steg 58 på BBCH-skalan för aprikos för att undvika tidigare pollinering. I laboratoriet, ta bort anthers av blommorna och placera dem på ett papper för att torka vid rumstemperatur.Efter 24 timmar, sikta pollenkornen med en fin 26 millimeters nät. Emasculate en grupp av 30 blommor på samma ballong utvecklingsstadium för varje själv-och korspollinering och placera pistolerna på florist skum i vatten 24 timmar efter emasculation och pollinera pistoler med hjälp av en pensel med pollen från blommor av samma sort. Pollinera en annan uppsättning pistoler av varje sorter med pollen från blommor av en kompatibel pollinerare som en kontroll.Efter 72 timmar, ta bort pistolerna från den våta florist skum och fixa pistolerna i en fixativ lösning av 3:1 etanol till ättiksyra i minst 24 timmar vid 4 grader Celsius. Sedan kasta fixative och tillsätt 75%etanol, se till att proverna är helt nedsänkt i lösningen. Prover kan förvaras i etanolen vid 4 grader Celsius tills användning.Sprid pollenkornen hos samma sorter som används för kontrollpollineinationerna i stelnat pollensytminsmedium och observera dem i mikroskopet efter 24 timmar. Förbered pistolerna för mikroskopi genom att tvätta dem 3 gånger med destillerat vatten i en timme per tvätt. Efter den sista tvätten, lämna dem i 5%natriumsulfit vid 4 grader Celsius i 24 timmar.Sedan autoklav dem på ett kilo per centimeter i kvadrat i 10 minuter i natriumsulfit för att mjuka upp vävnaden. Placera autoklaverade pistoler över en glasrutschkana och använd en skalpell för att ta bort trichomes runt äggstocken. Sedan squash pistolen med ett täckglas.Applicera en droppe anilinblå över förberedelserna för att fläcka känslokalla nedfall under pollenrörs tillväxt och observera pollenrören längs stilen med ett mikroskop enligt manuskriptriktningar. Använd ett kommersiellt kit för att extrahera genomiskt DNA från unga blad som samlats in på våren. Sedan ställa in PCR genom att kombinera reagenser enligt manuskriptet riktningar.Vortexing reaktionen mix och fördela den bland brunnarna i PCR-plattan. Tillsätt 1 mikroliter av DNA-utspädningen i varje brunn och kör PCR med hjälp av termo-cykling programmet som beskrivs i manuskriptet. När reaktionen är klar, analysera resultaten med hjälp av kapillärelektrofores eller agarosgelelektrofores.För kapillärelektrofores tillsätt 1 mikroliter av PCR-produkten i brunnen av läsaren plattan tillsammans med 1 droppe mineralolja för att förhindra vatten avdunstning. Förbered sedan separationsplattan genom att tillsätta separationsbuffert. Använd den kommersiella programvaran för genanalysatorn för att skapa en ny provplatta och spara provnamnen för alla brunnar på plattan.Välj sedan analysmetoden och för in de två plattorna i genanalysatorn. Fyll kapillärmaten med destillerat vatten. Ladda den linjära polyakrylamidgelen och klicka på kör.Om analysera PCR resultaten med gel elektrofores, förbereda en 1%agaros gel genom att lösa upp agaros i elektrofores rinnande buffert enligt manuskriptet riktningar. Tillsätt sedan 4 mikroliter av nukleinsyrafläcken till gelén och blanda försiktigt. Ställ in en gelbricka med en kam och saktar häll gelen i mitten var noga med att undvika bubblor.Låt gelen vara i rumstemperatur tills den är helt stelnad, ca 30-45 minuter. Lägg sedan in i elektroforeskammaren. Ta bort kammen och täck den med 1x TAE buffert.Ladda gelen med DNA-stegen följt av PCR-produkterna blandat med lastningsfärg. Kör sedan gelen på 90 volt i 60-90 minuter tills den blå färga linjen är på cirka 75%av gelen körfält. När körningen är klar, visualisera gelen med hjälp av en transilluminator.Pollen röret tillväxt i själv-och korspollineinering observerades av fluorescence mikroskopi att bestämma self(in)kompatibilitet för varje sorter. Sorter ansågs vara själv oförenliga när pollen rör tillväxt greps och självkompatibla när minst ett pollenrör nådde basen av stilen. 5 primers parkombinationer användes för att identifiera S-alleler med hjälp av PCR i kombination med kapillär eller gelelektrofores.Först identifierades S-allelerna genom förstärkningen av den första S-RNase-intron med hjälp av SRc primerparet. Därefter förstärktes den andra intronen av RNasen med tre primeruppsättningar för att skilja S6- S9-, S1-, och S7-alleler. Och V2 och HVB variabla regioner i SFB genen förstärktes med AprFBC8 primer inställd på att identifiera Sc och S8 alleler.När S-allelerna hade identifierats kan olika oförenlighetsgrupper med de genotyper som är interkompatibla fastställas. Det är viktigt att komma ihåg att använda kontroll i kapillärelektrofores, eftersom de använder ett automatiskt fragmentanalyssystem som kan rapportera som fler skillnader i fragmentstorlek som orsakar felaktig allelidentifiering. Kombinationen av mikroskopi observationer och genetisk analys har resulterat en mycket användbar metod för att fastställa självinkompatibilitet i aprikos och fastställa oförenligheten relationer mellan sorter.Självinkompatibilitet är nu länken till lokalbefolkningen i aprikos. Fastställandet av faktorer verkar vara inblandade. Framtida insatser måste inriktas på den genetiska uppdärningen av denna sort i aprikos.Kombinationen av denna dokumentära metod är resultatet i värdefull information för lämpligt urval av sorter i kommersiella fruktträdgårdar och mönster genotyper i aprikos avelsprogram. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas i andra vedartade fleråriga grödor.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Bedömning av cardiomyocyte DNA-syntes och ploiditet: En metod för att Assist Kvantifiering av cardiomyocyte Regeneration och omsättning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Att kombinera Intravital fluorescerande mikroskopi (IVFM) med genetiska modeller att studera Engraftment Dynamics av hematopoetiska celler till benmärgen nischer

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Visualisering av cellcykeln Variationer och bestämning av Kärnbildning i Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyser och genfunktion studier Använda Twin plats MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Bearbetning av mänskliga hjärtvävnad mot extracellulära Matrix självmonterande Hydrogel för In Vitro och In Vivo applikationer

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkiska avbildning av seriell avsnitt för att hitta specifika cellulära mål inom stora volymer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Kvantifiering av självförnyelse i murina Mammosphere kulturer

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...