Name: determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Bu araştırma Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Development Fund, Avrupa Birliği (AGL2016-77267-R ve AGL2015-74071-JIN) tarafından finanse edilmiştir; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad ve Agroseguro S.A.

1. Kendi kendine uyumluluk tayini
<ol><li>Alandaki çiçekleri tadına var. İstenmeyen önceki tozlaşmayıFigure 1Aönlemek için, kayısı28için BBCH ölçeğinde 58.</li>
	<li>
Laboratuvarda kendi kendine ve çapraz tozlaşmalara
	<ol>
<li>Balon aşamasında çiçek anthers çıkarın ve laboratuvar sıcaklığında kuruması için bir kağıt parçası üzerine yerleştirin.</li>
		<li>24 saat sonra polen tanelerini ince bir ?...

Geleneksel olarak, en ticari kayısı Avrupa çeşitleri kendi kendine uyumlu36edildi. Bununla birlikte, son yıllarda üreme programlarında ebeveyn olarak Kuzey Amerika kendini uyumsuz çeşitlerin kullanımı bilinmeyen tozlaşma gereksinimleri7ile yeni kendini uyumsuz çeşitlerin artan sayıda serbest bırakılması ile sonuçlandı7 ,8,37. Bu nedenle kayısı çeşitlerinde öz ve inter-(in) uyumlul...

Kendi kendine uyumsuzluk kendi kendine tozlaşma önlemek ve1outcrossing teşvik çiçekli bitkilerin bir stratejidir. Rosaceae'de bu mekanizma, esas olarak multiallelic locus S2tarafından kontrol edilen Gametofitik Kendi Kendine Uyumsuzluk Sistemi (GSI) tarafından belirlenir. Tarzında, RNase geni S-stylar determinant kodlar, bir RNase3, Bir F-box protein, S-polenbelirleyici belirler, SFB gen4tarafından kodlanmış iken . Kendi kendine uyumsuzluk etkileşimi ovule döllenme engelleyen tarzı boyunca polen tüpü büyüme inhibisyonu yoluyla gerçekleşir5,6.
Kayısı, bir varietal yenileme son yirmi yılda dünya çapında yer almıştır7,8. Yeni çeşitlerin önemli bir sayı bu giriş, farklı kamu ve özel üreme programlarından, bilinmeyen tozlaşma gereksinimleri ile kayısı çeşitlerinin artmasına neden olmuştur8.
Kayısıda tozlaşma gereksinimlerini belirlemek için farklı metodolojiler kullanılmıştır. Alanında, kendini-(in)uyumluluk kafesli ağaçlarda veya hadım edilmiş çiçeklerde kontrollü pollinations tarafından kurulmuş ve daha sonra meyve seti yüzdesi kayıt9,10,11,12. Buna ek olarak, kontrollü pollinations çiçek yarı-in vivo kültür ve floresan mikroskopi8altında polen tüp davranış analizi tarafından laboratuvarda yapılmıştır 8,13,14,15,16,17. Son zamanlarda, pcr analizi ve dizileme gibi moleküler teknikler, RNase ve SFB genlerinin çalışmasına dayalı uyumsuzluk ilişkilerinkarakterizasyonu izin var18,19. Kayısıda, otuz üç S-alel bildirilmiştir (S1 - S20, S22 - S30, S52, S53, Sv, Sx), kendi kendine uyumluluk ile ilgili bir alel dahil (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Şimdiye kadar, 26 uyumsuzluk grupları S-genotip8,9,17,,25,26,27göre bu tür bıçaklanmış edilmiştir. Aynı Salellerine sahip çeşitleri birbirine uyumsuz, en az bir farklı S-alel ile ve dolayısıyla farklı uyumsuz gruplara ayrılan çeşitleri birbirine uyumludur.
Kayısı çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini tanımlamak için, flüoresan mikroskobu ile öz-(in)uyumluluk tayinini, kayısı çeşitlerinde PCR analizi ile S-genotipinin tanımlanması ile birleştiren bir metodoloji yi tanımlıyoruz. Bu yaklaşım uyumsuzluk gruplarının oluşturulmasına ve tarikatlar arasındaki uyumsuzluk ilişkilerinin açıklığa kavuşturulmasına olanak sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEQ System Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 4 x 25 &#181;mol</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab GeXP Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Separation Gel LPA-1</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>391438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 100bp</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Meter BASIC 20</td>
			<td>Crison</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack P 25 T</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Forward</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Reverse</td>
			<td>Isogen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Stand Autoclave</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses

Rosaceae'de kendi kendine uyumsuzluk, esas olarak multiallelik lokus S tarafından kontrol edilen Gametofitik Kendi Kendine Uyumsuzluk Sistemi (GSI) tarafından belirlenir. Kayısıda, önemli sayıda yeni çeşidinin serbest bırakılması bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip çeşitlerin artmasına yol açtığı ndan, öz ve inter-(in) uyumluluk ilişkilerinin belirlenmesi giderek daha önemlidir. Burada, el-polenler ve mikroskopi ile öz-(in)uyumluluğunun belirlenmesini PCR analizi ile S-genotipinin tanımlanması ile birleştiren bir metodolojiyi açıklıyoruz. Uyumluluk tespiti için, her bir çeşitten balon aşamasında çiçekler toplanmış, laboratuvarda elle tozlaşmış, sabit lenmiş ve floresan mikroskopisi altında polen tüpü davranışlarının gözlemi için anilin mavisi ile boyanmıştır. Çeşitleri arasında uyumsuzluk ilişkilerinin kurulması için, her çeşitdna genç yapraklarından elde edildi ve S-alel PCR tarafından tespit edildi. Bu yaklaşım, yeni meyve bahçeleri tasarımında uygun tozlaştırıcıları seçmek ve Üreme programlarında uygun ebeveynleri seçmek için değerli bilgiler sağlayan çeşitler arasındaki uyumsuzluk ilişkilerini açıklığa kavuşturmaya ve uyumsuzluk ilişkileri ortaya çıkarmasına olanak sağlar.

Kayısıda tozlaşma çalışmaları, antezten bir gün önce geç balon evresinde çiçek kullanılmasını gerektirir (Şekil 1A). Çiçek yapıları neredeyse olgun olduğundan bu aşama hem polen hem de pistil koleksiyon için en uygun evre olarak kabul edilir, ancak anher ayrılması henüz gerçekleşmemiştir. Kapalı yaprakları dış polen taşıyan böceklerin gelişini engellediği için, bu sadece aynı çiçekten değil, diğer çiçeklerden de istenmeyen polenl...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses at JoVE.com

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Flüoresan mikroskopi ile öz-genotiyon un belirlenmesini birleştiren kayısı(Prunus armeniaca L.) çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini niçin pcr analizi ile s-genotipinin tanımlanması ile biraraya getiren bir metodoloji salıyoruz.

El-Tozlaşma, Mikroskopi ve Genetik Analizleri Birleştiren Kayısıda Öz ve İnter-(in)Uyumluluk İlişkilerinin Belirlenmesi

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Bu yöntem, farklı türlerde tozlaşma gereksinimlerini belirlemeye ve çeşitleri arasında uyumsuzluk ilişkileri kurulmasına yardımcı olabilir. Bu yaklaşımın en büyük avantajı, laboratuvar koşullarında çeşitli uyumsuzlukların değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır. Alan koşullarında gerçekleştirilen deneylerde oluşabilecek çok sayıda sorundan kaçınmak.Bu, bir dizi çeşidin ilgili uyumsuzluk gruplarına ithafı ile birlikte tanımlamasağlar. Çeşitleri arasındaki uyumluluk ilişkisinin belirlenmesi. Bu yaklaşım aynı zamanda kiraz veya erik gibi diğer meyve ağacı bitkileri kendi kendine uyumsuzluk ve uyumsuzluk ilişkisini belirlemek için yararlı olabilir.Alandaki çiçekleri örnekleyerek başlayın. Önceki tozlaşmaönlemek için kayısı için BBCH ölçeğinde Sahne 58 karşılık gelen balon aşamasında, çiçekleri toplayın. Laboratuvarda, çiçek anthers çıkarın ve oda sıcaklığında kuruması için bir kağıt parçası üzerine yerleştirin.24 saat sonra polen tanelerini 26 milimetrelik ince bir örgü ile elek. Her kendi kendine ve çapraz tozlaşma için aynı balon gelişim aşamasında 30 çiçek bir grup emasculate ve emasculation 24 saat sonra su çiçekçi köpük üzerinde tabanca yerleştirin ve aynı tarikat çiçekpolen ile bir boya fırçası kullanarak tabanca tozlaşma. Bir kontrol olarak uyumlu bir tozlaştırıcı çiçek polen ile her çeşit tabanca başka bir dizi tozlaşma.72 saat sonra, ıslak çiçekçi köpük tabanca kaldırmak ve 4 santigrat derece en az 24 saat asetik asit 3:1 etanol bir fiksatif çözelti tabanca düzeltmek. Daha sonra fiksatif atın ve% 75 etanol ekleyin, örnekleri tamamen çözelti içinde batık olduğundan emin olun. Numuneler kullanıma kadar etanolde 4 santigrat derecede saklanabilir.Katılaşmış polen çimlenme ortamında kontrol polenleri için kullanılan aynı çeşitlerin polen tanelerini dağıtın ve 24 saat sonra mikroskop altında gözlemleyin. Tabancaları her yıkamada bir saat damıtılmış suyla 3 kez yıkayarak mikroskopi için hazırlayın. Son yıkamadan sonra, 24 saat boyunca 4 santigrat derecede %5 sodyum sülfit bırakın.Sonra bir kilogram santimetre kare 10 dakika sodyum sülfit doku yumuşatmak için onları otoklav. Bir cam slayt üzerine otoklavlı tabanca yerleştirin ve yumurtalık etrafında trichomes kaldırmak için bir neşter kullanın. Sonra bir coverglass ile tabanca ezmek.Polen tüpü büyümesi sırasında duyarsız depozeleri lekelemek için preparatların üzerine bir damla aniline mavisi uygulayın ve polen tüplerini el yazması talimatlara göre bir mikroskopla stili boyunca gözlemleyin. İlkbaharda toplanan genç yapraklardan genomik DNA elde etmek için ticari bir kit kullanın. Daha sonra el yazması talimatlara göre reaktifleri birleştirerek PCR'yi ayarlayın.Reaksiyon karışımını girdaplayıp PCR plakasındaki kuyular arasında dağıtın. Her kuyuya 1 mikrolitre DNA seyreltme ekleyin ve el yazmasında özetlenen termo-bisiklet programını kullanarak PCR çalıştırın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, kapiller elektroforez veya agarose jel elektroforez kullanarak sonuçları analiz.Kapiller elektroforez ler için, su buharlaşmasını önlemek için 1 damla mineral yağ ile birlikte okuyucu plakasının kuyusuna 1 mikrolitre PCR ürün ekleyin. Daha sonra ayırma tamponu ekleyerek ayırma plakasını hazırlayın. Yeni bir örnek plaka oluşturmak ve plakaüzerindeki tüm kuyular için örnek adlarını kaydetmek için gen analizörü için ticari yazılımı kullanın.Daha sonra analiz yöntemini seçin ve iki plakayı gen analizörüne yerleştirin. Kılcal damar dizisini distile suyla doldurun. Lineer poliakrilamid jel yük ve çalıştır tıklatın.PCR sonuçlarını jel elektroforez ile analiz ediyorsanız, el yazması yönlere göre tampon çalıştıran elektroforezdeki agarose eriterek %1 agarose jel hazırlayın. Sonra jel için nükleik asit leke 4 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırın. Bir tarak ile bir jel tepsi ayarlayın ve kabarcıklar önlemek için özen orta jel dökün yavaşlıyor.Tamamen katılaşmış kadar oda sıcaklığında jel bırakın, yaklaşık 30-45 dakika. Sonra elektroforez odasına koyun. Tarak çıkarın ve 1x TAE tampon ile kaplayın.Jeli DNA merdiveni ile yükleyin ve ardından PCR ürünleri yükleme boyası ile karıştırın. Sonra mavi boya hattı jel şerit yaklaşık% 75 olana kadar 60-90 dakika boyunca 90 volt jel çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, jeli bir transilluminator kullanarak görselleştirin.Floresan mikroskopi ile her bir çeşit için kendi kendine uyumluluğu belirlemek için polen tüpü büyümesi gözlendi. Polen tüpü büyümesi tutuklandığında ve en az bir polen tüpü tarzının tabanına ulaştığında kendi kendine uyumlu olarak kabul edildi. 5 astar çifti kombinasyonları kılcal veya jel elektroforez ile birlikte PCR kullanarak S-alelleri tanımlamak için kullanılmıştır.İlk olarak, S-alelleri SRc primer çifti kullanılarak ilk S-RNase intron amplifikasyonu ile tespit edilmiştir. Daha sonra RNase'nin ikinci intronu, S6, S9, S1 ve S7 alellerini ayırt etmek için üç astar setiyle güçlendirildi. SFB geninin V2 ve HVB değişken bölgeleri, Sc ve S8 alellerini tanımlamak için AprFBC8 astar seti ile güçlendirilmiştir.S-alelleri belirlendikten sonra, uyumsuz genotiplerle farklı uyumsuz gruplar oluşturulabilir. Kapiller elektroforezlerde kontrolü kullanmayı unutmamak önemlidir, çünkü parça boyutunda yanlış alel tanımlamasına neden olan daha fazla farklılık olarak rapor edebilen otomatik bir parça analiz sistemi kullanırlar. Mikroskopi gözlemleri ve genetik analizin birleşimi kayısıda kendi kendine uyumsuzluğu belirlemek ve çeşitleri arasındaki uyumsuzluk ilişkilerini kurmak için çok yararlı bir yaklaşım almıştır.Kendi kendine uyumsuzluk artık kayısı yerlileriçin bağlantıdır. Faktörlerin belirlenmesi dahil gibi görünüyor. İleride yapılacak çalışmalar kayısıdaki bu çeşidin genetik olarak dinlendirilmesine odaklanmalıdır.Bu belgesel yaklaşımın birleşimi, ticari meyve bahçelerinde çeşitlerin uygun seçimi ve kayısı yetiştirme programlarında desen genotiplerinin seçilmesi için değerli bilgilerle sonuçlanmaz. Benzer bir yaklaşım diğer odunsu çok yıllık bitkileri kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...