Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) og P30-DK050306 (pilot Grant til KJW).

Alle metoder, der involverer brug af mus er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af IACUC af Penn Office af dyrevelfærd på University of Pennsylvania.
1. klargøring af reagens
<ol><li>
Cycloheximide
	<ol>
<li>For at gøre 500 μL af 0,1 g/mL cycloheximid, suspendere 50 mg cycloheximid i 500 μL methanol. Forsigtig: Cycloheximid er ekstremt giftigt for miljøet og kan forårsage medfødt misdannelse. Alt affald og buffere, der indeho...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-SEQ er en teknik til celletype-specifik isolering af oversætte mRNA via epitope-mærkede ribosomer og præsenterer et alternativ til FACS tilgange, da det omgår begrænsninger såsom tids krav af FACS9. I stedet, FÆLDE tillader hurtig og effektiv isolering af RNA direkte fra bulk væv, hjælpe med at undgå eventuelle ændringer i genekspression. Trap-SEQ er især velegnet til brug i den genbefolke Fah-/- muselever, da hepatocytter ekspansion efter fjernelse af nitisin...

Som det vigtigste metaboliske organ i hvirveldyr er leveren ansvarlig for glucosehomøostase, serumprotein syntese, galdesyre sekretion og xenobiotisk metabolisme og afgiftning. Leveren besidder en ekstraordinær evne til at regenerere den skadede parenkym ved udsættelse for toksiner for at forhindre umiddelbar leversvigt1. Men, svigt af regenerering kan forekomme i fastsættelsen af acetaminophen eller alkohol overforbrug, hvilket kan føre til akut leversvigt2. Endvidere, kronisk leverskade forårsaget af viral hepatitis infektion, fedt leversygdom, og steatohepatitis kan forårsage lever fibrose, cirrhose, og hepatocellulære karcinom3. Den eneste tilgængelige helbredende behandling for slutstadiet leversygdom er transplantation, men er begrænset af organmangel, forhindrer effektiv behandling for alle patienter4. En bedre forståelse af nyttiggørelsesprocessen efter giftig leverskade er derfor afgørende for udviklingen af behandlinger til stimulering af regenerering, der er tilstrækkelig til at redde funktionen i det sygdomsramte organ.
Den mest bredt anvendte model system til studiet af lever regenerering er delvis hepatektomi i gnavere, hvor en stor del af leveren er gensendt til at stimulere hurtig hepatocyt ekspansion5. Men, delvis hepatektomi ikke rekapitulere hepatocyt ekspansion efter giftige leverskade på grund af manglen på immuncelle infiltration og hepatocyt celle nekrose ofte observeret i fastsættelsen af akut leverskade hos mennesker6. En mere egnet system til at modellere denne form for organ fornyelse er Fah-/- mus, som mangler funktionelle fumarylacetoacetat hydrolase (Fah) kræves for korrekt tyrosin metabolisme og udvikler alvorlige leverskader fører til døden7. Disse mus kan vedligeholdes i en sund tilstand på ubestemt tid ved behandling med lægemidlet nitisinin i drikkevandet. Alternativt kan FAH-ekspression genoprettes ved transgene levering til en delmængde af hepatocytter, som vil ekspandere for at genbefolke leveren ved nitisinaffjernelse8.
For at profilere genekspression ændringer af genbefolkede hepatocytter, et værktøj til specifikt at isolere replisering hepatocytter i Fah-/- mus uden kontaminering fra de tilstødende skadede hepatocytter og andre celletyper er påkrævet. Desværre, fluorescens-assisteret celle sortering (FACS) af hepatocytter er vanskelig, da (1) skrøbelighed af genbefolker hepatocytter fører til dårlig genopretning efterlever perfusion, (2) replicerende hepatocytter er meget varierende i størrelse, gør isolation af en ren population af FACS vanskeligt, og (3) proceduren tid fra leveren perfusion til RNA isolation er større end 2 h, dermed genekspression profiler kan undergår betydelige kunstige ændringer, før prøverne erhverves9.
Alternativt giver ekspression af epitope-mærkede ribosomer specifikt til genbefolkning af hepatocytter mulighed for hurtig isolering af aktivt at oversætte mRNA bundet af ribosomer ved hjælp af affinitets rensning umiddelbart efter organhøst, med bulk lever vævs lysater. Her beskriver vi en protokol til at udføre oversættelse-ribosome affinitet rensning (TRAP)10 efterfulgt af High-gennemløb RNA-sekventering (Trap-SEQ), til specifikt at isolere og profilere mRNA i genbefolkning hepatocytter i Fah-/- mus9. Coexpression af grønt fluorescerende protein-Tagged ribosomale protein (GFP: RPL10A) med FAH tillader affinitet rensning af oversætte mRNA bundet af polysomer indeholdende GFP: RPL10A. Denne metode undgår enhver celle dissociation trin, såsom leveren perfusion at isolere skrøbelige genbefolgende hepatocytter. I stedet, det udnytter lysis af hele orgel væv og antistoffer til hurtigt at udtrække RNA specifikt fra målcellerne. Endelig giver isolering af rigelig, høj kvalitet mRNA via TRAP-SEQ mulighed for downstream-applikationer såsom sekvensering analyse til at profilere den dynamiske ændring af genekspression under genpopulationsprocessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Lever genbestand efter skade er et afgørende træk ved pattedyr, som forhindrer umiddelbar organsvigt og død efter eksponering af miljømæssige toksiner. En dybere forståelse af ændringerne i genekspression, der opstår under genpopulation kunne hjælpe med at identificere terapeutiske mål for at fremme genoprettelsen af leverfunktionen i fastsættelsen af skader. Ikke desto mindre, metoder til at isolere specifikt de genbefolgende hepatocytter hæmmes af en mangel på celle markører, begrænsede cellenumre, og skrøbelighed af disse celler. Udviklingen af oversætte ribosom affinitets rensning (Trap) teknologi i forbindelse med Fah-/- musemodel til at rekapitulere genpopulation i fastsættelsen af leverskade tillader genekspression profilering af genbefolkning Hepatocytter. Med TRAP, celletype-specifikke oversætte mRNA er hurtigt og effektivt isoleret. Vi udviklede en metode, der udnytter FÆLDE med affinitets baseret isolering af oversættelse af mRNA fra hepatocytter, der selektivt udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged ribosomale protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP omgår den lange tidsperiode, der kræves for fluorescens-aktiveret celle sortering, som kan ændre genekspressions profilen. Desuden, da kun de genbefolkede hepatocytter udtrykker GFP: RPL10A fusion protein, den isolerede mRNA er blottet for kontaminering fra de omgivende skadede hepatocytter og andre celletyper i leveren. Affiniteten-renset mRNA er af høj kvalitet og tillader downstream PCR-eller High-gennemløb sekvensering-baseret analyse af genekspression.

For at profilere genekspression i at genbefolde hepatocytter af Fah-/- musen, gfp: Rpl10a fusion og Fah Trans Genes er co-leveret inden for en Trans-holdige plasmid8 (fælde vektor) til lever ved Hydrodynamisk injektion (figur 1A). Fjernelsen af nitisinan inducerer en giftig leverskade, der skaber et selektions Tryk for hepatocytter stabilt at udtrykke Fah at genbefolke den skadede...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Oversættelse af ribosom affinitets rensning (Trap) muliggør hurtig og effektiv isolering af celletype specifik oversættelse af mRNA. Her demonstrerer vi en metode, der kombinerer Hydrodynamisk hale-vene injektion i en musemodel af leveren genindsættelse og fælde for at undersøge udtryks profilen for at genbefolde hepatocytter.

Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Med TRAP-seq kan vi isolere RNA'et fra specifikke celletyper, såsom hepatocytterne, der genbefolker i den skadede lever for at analysere de genekspressionsændringer, der forekommer i disse celler. Det kræver ikke nogen skridt til at fjerne uønskede celler fra vævet. Celletypespecifikke RNA er isoleret ved affinitetsrensning fra hele organlysater.Denne teknik hjælper os med at afgøre, hvordan specifikke celler reagerer på skader, som kan hjælpe med at identificere nye strategier eller lægemidler til bekæmpelse af leversygdom. Dette kunne bruges til at identificere, hvordan leverceller reagerer på forskellige typer af leverskader. I øjeblikket er der få muligheder for alvorlige akutte leverskader og denne metode vil bidrage til at fingerpeg os ind i nye behandlinger.Denne metode opstod i hjernen. I leveren forestillede vi os, at det kunne bruges til at undersøge dynamiske ændringer i en række celletyper, hepatocytterne, galdegangsceller, Kupffer-celler og endotelceller for at nævne nogle få. Demonstration af proceduren vil være Amber Wang, en kandidat studerende og min mentee.Til at begynde, resuspend magnetiske perler ved blid pipettering. Saml perlerne på en magnetisk stander i mere end et minut og fjern supernatanten. Fjern derefter mikrocentrifugerøret fra den magnetiske stativ og tilsæt en milliliter PBS, efterfulgt af pipettering op og ned for at vaske perlerne.Anl. Placer røret tilbage på den magnetiske holder i mere end et minut for at samle perlerne og fjerne PBS. For at forberede protein L-belagt perler, tilsæt 16 mikroliter af biotinyleret protein L til de resuspenderede og vaskede magnetiske perler og tilsæt 1X PBS at gøre det endelige volumen en milliliter, hvis du bruger en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør, eller 1,5 milliliter, hvis du bruger en to-milliliter mikrocentrifuge rør. Inkuber de magnetiske perler med biotinyleret protein L i 35 minutter ved stuetemperatur på en rørrotator.Derefter placere røret på den magnetiske stå i mere end et minut og fjern supernatanten for at indsamle proteinet L-belagte perler. Fjern mikrocentrifugerøret fra den magnetiske stander, og tilsæt en milliliter PBS med 3%BSA-buffer efterfulgt af blid pipettering mindst fem gange for at vaske proteinet L-belagte perler. Igen, placere røret på den magnetiske stå i mere end et minut og fjern supernatant til at indsamle de belagte perler.Gentag BSA vask yderligere fire gange. Dernæst tilsættes 50 mikrogram antistoffer for GFP antistof 19C8 og GFP antistof 19F7 hver i proteinet L-belagte perler, og inkubere i en time ved fire grader Celsius på et rør rotator. For at indsamle affinitetsmatrixen skal røret anbringes på den magnetiske stander i mere end et minut, og supernatanten fjernes.Tag røret væk fra den magnetiske stativ og tilsæt en milliliter lavsalt buffer. Rør forsigtigt op og ned for at vaske affinitetsmatrixen, og gentag den lavsalt buffer, der vasker yderligere to gange. Opslæned perlerne i 200 mikroliter af lav-salt buffer, at gøre 200 mikroliter af affinitet matrix.Først skal du oprette vævssliberen, så PTFE-glasrørene kan placeres på is under homogenisering. Fyld fire milliliter kold lysisbuffer i PTFE-glasrørene. Læg leveren på en petriskål.Brug en kniv til at isolere 200 til 500 milligram lever stykker og flytte ind i PTFE glasrør. Placer det resterende levervæv i et forkølet mikrocentrifugerør og flashfrysning i flydende nitrogen. Homogeniser prøverne i en motordrevet homogenisator, begyndende ved 300 omdr./min. i mindst fem slag for at adskille hepatocytter fra leverstrukturen.Sænk glasrøret hver gang. Undgå befrugtning, som kan forårsage proteindenaturering, ved at holde støderen under opløsningen. Derefter hæve hastigheden til 900 rpm til fuldt homogenisere levervæv i mindst 12 fulde slagtilfælde.Lysatet overføres til mærkede og forkølede rør med højst en milliliter lysat hver. For at starte nukleare lysis, centrifuge leveren lysate ved 2, 000 gange g ved fire grader Celsius i 10 minutter, derefter overføre supernatant til en ny pre-kølet mikrocentrifuge rør på is. Tilsæt 1/9th af supernatant volumen på 10% NP-40 i mikrocentrifuge røret på is og bland opløsningen ved forsigtigt at vende røret.Drej hurtigt mikrocentrifugerørene med en minicentrifuge og tilsæt 1/9th af prøvevolumenet på 10%DOC. Bland ved forsigtigt at invertere mikrocentrifugerørene og hurtigt dreje mikrocentrifugerørene ned og inkubere på is i fem minutter. Centrifuge atomlysatet ved 20,000 gange g ved fire grader Celsius i 10 minutter og overfør supernatanten til nye forkølede mikrocentrifugerør på is.For hvert rør skal du tage 1% af supernatantens samlede volumen ud som en præimmunitetskontrol. Anvend præimmunoprecipitationskontroller på en rørrotator ved fire grader Celsius natten over. Vær ekstra forsigtig med forsigtigt at opsbruge affinitetsmatrixen ved pipettering, og tilsæt derefter 200 mikroliter til hver prøve.Inkuber lysatet ved fire grader Celsius natten over med blid blanding på et rør rotator. For at isolere RNA, hurtigt dreje ned rørene indeholder lysater i mini centrifuge og indsamle perlerne ved at placere på den magnetiske rack i mindst et minut. Opsamler supernatanten i yderligere mikrocentrifugerør.Der tilsættes en milliliter frisk høj saltbuffer til hvert rør, efterfulgt af blid pipettering mindst fem gange uden at indføre bobler. Saml perlerne på den magnetiske stå på is i over et minut og fjern supernatanten. Gentag vasketrinnene yderligere fire gange.Fjern derefter mikrocentrifugerørene fra den magnetiske stander og læg den ved stuetemperatur i fem minutter for at varme op. Opslæm perlerne i 100 mikroliter lysis buffer med 0,7 mikroliter af beta-mercaptoethanol at frigive bundet RNA fra affinitet matrix. Vortex rørene i mindst fem sekunder ved den højeste hastighed og hurtigt spin ned.Derefter inkuberes rørene ved stuetemperatur i 10 minutter. Anskaf rørene på den magnetiske stand i mindst et minut, opsam derefter supernatanten, og fortsæt straks til RNA-oprydning i henhold til RNA-renseprotokollen i sættet. For at opnå maksimal kvalitet af det isolerede RNA skal du udføre alle valgfrie trin, herunder DNase-fordøjelse og alle RNA-edlutionstrin, herunder den anbefalede forvarmning af elution-bufferen til 60 grader Celsius.I denne undersøgelse blev GFP-L10A fusion og Fah transgene co-leveret inden for en transposon-holdige plasmid fælde vektor til lever ved hydrodynamisk injektion. Fjernelsen af nitisinon inducerede en toksisk leverskade. Immunfluorescensfarvning bekræftede sameksistensen af FAH og GFP-L10A fusionsproteinet og de repopulerende hepatocytter efter to ugers genindfolkning af lever.Den quiescent prøve produceret det højeste udbytte af fusion protein, da alle hepatocytes udtrykke GFP-L10A efter AAV8-TBG-Cre injektion. Omvendt var næsten ingen RNA kan påvises i kontrol af vildtypen, som ikke havde GFP-L10A transgene, hvilket indikerer, at TRAP-proceduren er meget specifik og har en lav baggrund. Når TRAP blev brugt på levervæv under genpopulation med GFP-L10A transduced hepatocytes, rigelige høj kvalitet RNA blev opnået.I modsætning hertil blev der ikke fundet nogen RNA-spor via Bioanalyzer til den negative kontrolprøve. Gsta1-udtrykket blev fremkaldt af over tigange i repopulerende hepatocytter sammenlignet med quiescent hepatocytes, mens der ikke blev påvist nogen tærskelcyklusværdier med TRAP-isoleret RNA fra den vilde typemus på grund af manglende input-RNA. Ved homogenisering af vævet, sørg for at flytte støderen langsomt for at forhindre befrugtning.Efter isolering af RNA kan sekvensering med høj gennemløb eller qPCR udføres for at analysere genekspression. Med TRAP-seq har vi nu en metode til specifikt at isolere RNA fra at genbefolke hepatocytter og analysere ændringen i genekspression under genudfolkning af leveren. Dette giver os mulighed for at identificere gener, der er ændret i løbet af denne proces og potentielle terapeutiske mål for behandling af leverskader.Cycloheximide og DTT, som er til stede i flere buffere, er begge giftige. Affald bør indsamles og kasseres i henhold til institutionelle retningslinjer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...