Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

التمويل من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (R01DK096075, R01DK107875, و R01DK114506) ووزارة الدفاع الامريكيه (وزاره الخارجية RTRP W81XWH-17-1-0680) ومن المسلم به إلى حد كبير.

تم تنفيذ العزلات الكبدية الاساسيه لهذا البروتوكول من قبل نواه الموارد الخلية (CRC) في مستشفي ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات الامريكيه. تمت الموافقة علي بروتوكول الحيوانية (#2011N000111) من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من مستشفي ماساتشوستس العام.
<p class="jo...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

الحفظ بالتبريد من خلايا الكبد ببطء تجميد النتائج في انخفاض القدرة علي البقاء والتمثيل الأيضي وظيفة. يقدم التزجيج بديلا واعدا للحجز الكلاسيكي بالتبريد ، حيث يتم تجنب الاصابه بالتجمد تماما9. ومع ذلك ، مطلوب الحضانة مع CPAs لخفض معدل التبريد الحرجة8. التالي ، فان التس?...

فقدان القدرة علي البقاء في الخلية والتمثيل الأيضي بعد التجميد من الخلايا الكبدية لا تزال قضية رئيسيه التي تحد من التطبيقات السريرية1,2,3. الطريقة القياسية لحفظ الخلايا الكبدية هي بطيئه التجمد ، والتي يتم تنفيذها قبل احتضان الخلايا الكبدية مع CPA (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [dmso] ، والجلوكوز ، والزلال) وتجميد معدل اللاحقة (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) درجاتالحرارة المبردة 4,5. علي الرغم من العديد من التحسينات المبلغ عنها ، وسميه CPA مع الاختلالات الاسموزي الضارة اثناء تجميد والإجهاد الميكانيكي لتشكيل الجليد لا تزال العيوب الاساسيه لبطء تجميد6،7.
[تزجيج] يقدم ميزه علي [سلو-فريز] في ان أصابه واجبه إلى جليد تشكيل يكون تماما تفاديت بمباشره طور انتقال الماء داخل الزجاج دوله6. ومع ذلك ، للوصول إلى درجه حرارة التحول الزجاج من المياه النقية (-137 درجه مئوية) ، يجب تبريد المياه بمعدلات بترتيب 1,000,000 درجه مئوية في الثانية (اي معدل التبريد الحرجة) لتجنب تشكيل الجليد فوق درجه حرارة التحول الزجاج8 . أضافه CPAs يمكن ان تخفض معدل التبريد الحرجة وزيادة درجه حرارة التحول الزجاج من الحلول المائية9. ومع ذلك ، حتى مع تركيزات تكلفه الاكتساب العالية (علي سبيل المثال ، 40 ٪ v/v dmso أو اعلي) ومع ذلك فان معدلات التبريد السريع مطلوبه لعمليه التزجيج الناجحة8،9.
وتؤدي معدلات التبريد المطلوبة وتركيزات CPA العالية إلى عيبين رئيسيين في التزجيج. أولا ، لتمكين التبريد السريع ، يجب ان تكون العينات كتله حراريه منخفضه. ثانيا ، للوصول إلى تركيزات CPA عاليه مع تجنب الاصابه الاسموزي ، يجب إدخال CPAs ببطء ومعايرتها بالبالكامل بين المقصورات داخل وخارج الخلية6. وهذا يزيد من وقت التعرض للخلايا إلى CPAs السامة. معا ، وهذا يجعل التزجيج عمليه مرهقه التي تقتصر علي عدد قليل من العينات الصغيرة الحجم (ميكروليتر) في وقت واحد. وقد اقترح التزجيج التجميعي كحل محتمل لهذه القيود. من خلال تعريض قطرات الخلايا الضئيلة الحجم (نانولتر) إلى النيتروجين السائل ، فان معدل التبريد يزداد بشكل ملحوظ ، مما يسمح بالتالي بتخفيض كبير في تركيز CPA10،11،12 و13و14. علي الرغم من ان العديد من فوات توليد القطرات عاليه التردد يمكن استخدامها في وقت واحد ، فان حجم القطيرات الصغير للغاية يحد من الانتاجيه إلى ميكروليتر في الدقيقة10، مما يمنع التزجيج الفعال للخلية الكبيرة وحدات التخزين بمقادير اعلي من معدلات المعالجة بترتيب ملليلتر في الدقيقة.
وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله في التزجيج يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي للقطيرات السائبة15. هذه الطريقة الجديدة تعزز الجفاف الاسموزي السريع للتركيز علي تركيز CPA داخل الخلايا من 7.5 ٪ v/v جلايكول الاثيلين و DMSO السابقة مباشره التزجيج ، والقضاء علي الحاجة إلى تاخيرمن كامله من تركيزات CPA السامة. يتم اجراء الجفاف الخلوي في جهاز فلويدريك عن طريق التعرض قصيرة من خلايا الكبد إلى تركيز CPA عاليه الخلية. علي الرغم من ان هذا التعرض يسبب الجفاف الاسموزي السريع ، فانه قصير جدا لتركيز CPA عاليه لتنتشر في الخلايا. مباشره بعد الجفاف ، يتم تحميل الخلايا في قطرات التي يتم المزجج مباشره في النيتروجين السائل. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى الاستيعاب الكامل داخل الخلايا من تركيزات CPA عاليه في حين ان تركيز CPA عاليه الخلية تمكن من التزجيج من قطرات كبيره الحجم ، مما ادي إلى كميات عاليه الانتاجيه مع الحد الأدنى من سميه CPA.
التزجيج الحبريه يحسن القدرة علي البقاء المباشر وعلي المدى الطويل بعد الحفاظ عليها ، فضلا عن المورفولوجية ووظيفة الأيض من الخلايا الكبدية الرئيسية الفئران بالمقارنة مع الحفظ الكلاسيكي بالتبريد ببطء تجميد15. تقدم هذه المخطوطة التفاصيل المنهجية للتزجيج الحبريه السائبة من خلايا كبديه الفئران الاوليه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

التزجيج هو بديل الجليد خاليه واعده لتجميد الكلاسيكية بطيئه (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) بالتبريد من العينات البيولوجية. ويتطلب التزجيج معدلات تبريد سريعة للغاية لتحقيق انتقال المياه إلى المرحلة الزجاجية مع تجنب تشكيل الجليد الضار. علي الرغم من ان مرحله ما قبل الحضانة مع وكلاء كريوبروتيكتيفي (CPA) يمكن ان تقلل من معدل التبريد الحرجة من العينات البيولوجية ، وهناك حاجه عموما إلى تركيزات عاليه لتمكين الجليد خاليه من البرد التجميد عن طريق التزجيج. ونتيجة لذلك ، فان التزجيج يعوقه التسمم ببموجب اتفاق السلام الشامل ويقتصر علي العينات الصغيرة التي يمكن تبريدها بسرعة. وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي السائب. باستخدام هذه الطريقة الجديدة ، يتم أولا احتضان الخلايا مع تركيز CPA منخفض داخل الخلايا. الاستفادة من الجفاف السريع الاسموزي ، تتركز التكلفة النسبية للاكتساب داخل الخلايا مباشره قبل التزجيج ، دون الحاجة إلى تتوازن تركيزات التكلفة الكلية السامة بالبالكامل. يتم تنفيذ الجفاف الخلوية في جهاز فلويدريك ومتكاملة مع توليد الانتاجيه العالية المستمر من قطرات كبيره الحجم التي يتم المزجج في النيتروجين السائل. هذه الطريقة الخالية من الجليد بالتبريد مع سميه الحد الأدنى للاكتساب مناسبه لكميات الخلايا الكبيرة والنتائج في زيادة القدرة علي البقاء في الكبد ووظيفة التمثيل الأيضي بالمقارنة مع الكلاسيكية بطيئه تجميد التبريد. تصف هذه المخطوطة أساليب التزجيج التجميعي الناجح للقطرة السائبة بالتفصيل.

تم استخدام خلايا الكبد الاوليه المعزولة الطازجة من خمسه كبد فئران مختلفه للمقارنة المباشرة للتزجيج الحبريه السائبة إلى الحجز الكلاسيكي بالتبريد باستخدام بروتوكولات التجميد البطيء البارزة المبلغ عنها في الأدبيات4، 5. باختصار ، تم تعليق خلايا الكبد في UW تس...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

تصف هذه المخطوطة طريقه الحفظ بالتبريد الخالية من الجليد للكميات الكبيرة من خلايا الكبد الفئران التي يتم فيها الاحتضان المسبق للخلايا الاوليه مع عوامل كريوبروتيكتيفي بتركيز منخفض والمزجج في قطرات كبيره.

التزجيج الحبريه السائبة للحفاظ علي الخلايا الكبدية الاساسيه

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

يتم التعامل مع التزجيج عادة من خلال سمية العوامل الخفية. وإعادة إدراجها في عينات صغيرة يمكن تبريدها بسرعة. هذا البروتوكول يتيح vitrification من كميات كبيرة من الخلايا أثناء استخدام تركيز منخفض CPA أثناء الحضانة قبل.باستخدام الجفاف التناضحي السريع ، يتركز CPA المنخفض بين القبو في جهاز السوائل مباشرة قبل التزجيج. وهذا يلغي الحاجة إلى توازن كامل تركيزات CPA السامة. قد توفر عملية تزجيج القطرات السائبة خلايا كبدية قابلة للحياة ونشطة أيضًا لاستخدام زراعة الكبد وأجهزة الكبد الاصطناعية الحيوية التي تعوقها حاليًا النتائج غير الكافية بعد الحفظ بالتبريد.قد يمكن تكييف هذه الطريقة لضخاة أنواع الخلايا الأخرى التي تحتاج إلى الحفاظ على التبريد بكميات كبيرة؛ مثل منتجات الدم أو الخلايا الجذعية وغيرها. لتبدأ، وجعل vitrification الحل 1 عن طريق إضافة 40 ملليغرام من BSA إلى 17.0 ملليلتر من جامعة ويسكونسن الحل. استخدم فلتر ميكرومتر 0.22 لتصفية المحلل معقمة وتخزينه عند أربع درجات مئوية.جعل vitrification الحل 2 كما هو موضح في البروتوكول. وتصفية معقمة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تحميل 3.5 ملليلتر من محلول V2 معقم مصفى في حقنة ثلاثة ملليلتر وتخزينها عند أربع درجات مئوية.لإعداد جهاز التزجيج القطرة السائبة، أولا، قطع على طول جانب واحد من خلط الإبر الأكمام الرمادية الخارجية. ثني الأكمام مفتوحة لإزالته من إبرة الخلط. ثم، قطع إبرة الخلط إلى طول 20 ملليمترا وإدراج مأخذ قطع في إبرة حقن قياس 20.الشريحة اثنين من 25 ملليمتر أنابيب السيليكون أقسام على مداخل إبرة الخلط. وتأمين موقفهم مع الغراء. تعقيم هذا التجميع عن طريق autoclaving.املأ قارورة ديوار العقيمة بالنيتروجين السائل. وتعقيم الخارج مع ايزوبروبانول قبل وضعه في معقمة لامينر تدفق الخلية هود الثقافة. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة حيث يمكن للنيتروجين السائل أن يسبب حروقًا خطيرة.لإنشاء جهاز جمع قطرات إدراج قمع مع نفس القطر الخارجي كما القطر الداخلي للديوار، في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. باستخدام ملقط كبيرة، اضغط ببطء على جهاز جمع قطرات أسفل في النيتروجين السائل في وضعها الرأسي النهائي. تأكد من أن أنبوب مخروطي تقع في وضع عمودي في الجزء السفلي من ديوار.ومستوى النيتروجين السائل هو واحد أقل سنتيمتر من حافة القمع. لتركيب مضخة حقنة في موقف عمودي على جدار غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وربط سلسلة من القدمين مضخة حقنة لمسامير جاحظ من خلية ثقافة هود الجدار. ثم، ضع ديوار النيتروجين السائل مع جهاز جمع قطرات تحت مضخة حقنة محمولة عموديا.بعد الحصول على خلايا الكبد الجرذان المعزولة حديثًا ، عد تركيز المخزون عن طريق الاستبعاد الأزرق ثلاثي التحريك. ونقل 40 مليون خلايا كبدية قابلة للحياة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي hepatocytes في 50 مرة G لمدة خمس دقائق دون انقطاع.استلهموا المُنطّع. إعادة تعليق خلايا الكبد في 3.4 ملليلتر من V1 الحل. واحتضان على الجليد لمدة ثلاث دقائق.ثم، إضافة 150 ميكرولترات من DMSO و 150 ميكرولترات من EG؛ مزيج بلطف واحتضان على الجليد مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق. إضافة 150 ميكرولترات من DMSO و 150 ميكرولترات من EG إلى الكبد مرة أخرى ومزيج بلطف. تحميل 3.5 ملليلتر من هذا الخليط في حقنة ثلاثة ملليلتر.أدخل الحقنة مع خلايا الكبد المحتضنة مسبقًا والمحاقن مع V2 Solution على محول مضخة الحقنة. إرفاق اثنين من الإناث Luer قفل خرطوم بارب محولات إلى الحقن. وشريحة أنابيب السيليكون من الجمعية إبرة خلط على تركيبات بارب.ضع هذا التجميع بأكمله في مضخة الحقنة. بعد ثلاث دقائق من الطبعة الأخيرة من DMSO و EG إلى خلايا الكبد، بدء المضخة في ملليلتر اثنين في الدقيقة الواحدة. بعد أن تم إضافة جميع خلايا الكبد إلى النيتروجين السائل وقف المضخة.باستخدام إبرة قياس 20، ثقب 10 ثقوب صغيرة في غطاء أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ولف خارج الغطاء مع فيلم مرن، وخلق صمام من شأنها أن تمكن من الهروب من التبخر النيتروجين السائل المتبقية. لجمع قطرات الكبد vitrified، أولا إزالة القمع من ديوار مع النيتروجين السائل.المقبل، مع ملقط طويلة، إخراج أنبوب مخروطي الذي يحتوي على قطرات من النيتروجين السائل، وصب ببطء من النيتروجين السائل الزائد من أنبوب مخروطي. إغلاق أنبوب مخروطي مع غطاء مثقوب ومن ثم وضع مباشرة الأنبوب المخروطية مغلقة مع قطرات الكبد vitrified مرة أخرى في ديوار مع النيتروجين السائل. وأخيرا، نقل أنبوب مخروطي من النيتروجين السائل إلى كريوتانك النيتروجين السائل.بعد إجراء حل إعادة التروّي مع السكروز و DMEM وسائل الإعلام ثقافة الكبد، استخدم مرشح ميكرومتر 0.22 لتصفية العقيمة. ثم ادفأها إلى 37 درجة مئوية. لإعادة الدفء الكبد إزالة أنبوب مخروطي مع الكبد vitrified من cryotank ونقله في ديوار النيتروجين السائل إلى غطاء محرك السيارة الفرعية.تخفيف طفيفة الغطاء ووضع أنبوب مخروطي مرة أخرى في النيتروجين السائل. العمل بسرعة، إضافة جميع قطرات الكبد vipatocyified إلى الكوابر فارغة، ثم إضافة بسرعة 100 ملليلتر من 37 درجة مئوية حل إعادة الدفء الدافئة في حين اثارة لمدة 10 ثوان. عندما تتم إزالة قطرات من النيتروجين السائل داخل est تجميد يحدث في غضون ثوان إذا لم يتم إعادة الدفء بسرعة قطرات.لذلك ، من المهم إضافة الوسائط التي تعيد الدفء مباشرة إلى القطرات أثناء التحريك. تقسيم محلول إعادة التروّد مع خلايا الكبد إلى أنبوبين مخروطيين 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة دقيقتين في 100 مرة G في أربع درجات مئوية دون انقطاع.استلهموا من المُتشردين ليتركوا حجمًا إجماليًا قدره 12.5 ملليلتر باستخدام علامة تخرج الأنبوب كمرجع. لتخفيف محلول إعادة الوارة إلى 50٪ إضافة 12.5 ملليلتر من الجليد بارد DMEM لكل أنبوب مخروطي. إعادة تعليق واحتضان على الجليد لمدة ثلاث دقائق.لتخفيف محلول إعادة الواردة إلى 25٪ إضافة 25 ملليلتر من الجليد بارد DMEM لكل أنبوب مخروطي. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 50 مرات G في أربع درجات مئوية دون انقطاع، سبيرت فائقة وإعادة تعليق خلايا الكبد في ملليلتر اثنين من المتوسطة الثقافة المطلوب. عند قياسها باختبار الاستبعاد الأزرق ثلاثي التحريك ، والذي يحدد سلامة الغشاء ، أدى تزجيج القطرات السائبة إلى قابلية حيوية الكبدية مباشرة بعد الحفظ بنسبة 79٪ كان هذا أعلى بكثير من 68٪ قابلية البقاء بعد الحفظ المثلى للتبريد الكلاسيكي.وكان العائد من التبزير بالجملة قطرات 56٪الذي كان 10٪ أعلى وأكثر اتساقا من الحفظ المبرد الكلاسيكية. باستخدام مقايسة استقلاب الغراء السابق في الثقافات الكلية والسندويشات على المدى الطويل ، تم قياس النشاط الأيضي في الخلايا الكبدية ليكون أعلى بكثير بعد تزجيج القطرة السائبة ثم بعد الحفظ المبرد الكلاسيكي. كان تخليق الزلال، كمعلمة الأكثر استخداماً من وظيفة الاصطناعية من خلايا الكبد، أكبر من قبل ما يقرب من ضعفين بعد التزجيج قطرات السائبة، ثم بعد الحفظ المبرد الكلاسيكية.تم استخدام إنتاج اليوريا لقياس وظيفة إزالة السموم الكبدية في ثقافة أسبوع واحد. في القطرات السائبة الكبدية vitrified، وكان إنتاج اليوريا أعلى بكثير من ذلك في الكبدات الكبدية التبريد الكلاسيكية. للحصول على نتائج متسقة بعد التبزيم القطرة السائبة من المهم أن تتبع التوقيت بالضبط أثناء الحضانة المسبقة من CPAs وإعادة الدفء كما هو مفصل في هذا البروتوكول.بعد إعادة تثلج الصدر قطرات الكبد vipatocyified سوف ينتهي بك الأمر مع تعليق التحجيم أفضل والتي يمكن استخدامها لذلك في جميع نفس الطرق كما لو كانت معزولة حديثا. وكطريقة محسنة للحفظ، قد يزيد التزجيج الزُكَني السائب من توافر الـ pri-ma للأبحاث والتطبيقات السريرية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

اتباع نهج موائع جزيئية المستندة إلى الحبرية والتضخيم ميكروسفيري-بكر للحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أمبليكونس

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

بروتوكول شكلي للتقييم الموضوعي للسلوك الكيسة أثناء التزجيج والخطوات الاحترار

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

التنقيب عن سلالات الميكروبية للمعالجة الحيوية وتطوير البروبيوتيك للبحوث Metaorganism والحفاظ عليها

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

ارتفاع الإنتاجية الخميرة سلالة Phenotyping مع تسلسل الحمض النووي الريبي القائم على دروبليت

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...