Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Finansiering fra de amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 og R01DK114506) og det amerikanske forsvarsministerium (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er stærkt anerkendt.

Den primære hepatocyt isoleringer for denne protokol blev udført af cellen Resource Core (CRC) på Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Dyre protokollen (#2011N000111) blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Massachusetts General Hospital.
1. bulkdråbe forvitrifikation
<ol><li>Klargør forvitrifikationsløsninger.
	<ol>
<li>Tilsæt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) til 17,0 ml af University of Wisconsin-opl?...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Kryopreservation af hepatocytter ved langsom frysning resulterer i nedsat levedygtighed og metabolisk funktion. Vitrification tilbyder et lovende alternativ til klassisk Kryopreservation, da frostskader helt undgås9. Præinkubation med CPAs er dog påkrævet for at sænke den kritiske afkølingshastighed8. Derfor hæmmes forvitrifikation af CPA-toksicitet17 og begrænset til små stikprøve mængder. I bestræbelserne på at overvinde disse begræns...

Tab af cellelevedygtighed og metabolisk funktion efter Kryopreservation af hepatocytter er stadig et stort problem, der begrænser kliniske anvendelser1,2,3. Benchmarkmetoden for hepatocyt kryopræservering er langsom frysning, som udføres ved præ-inkupering af hepatocytter med CPA (dimethylsulfoxid [DMSO], glucose og albumin) og efterfølgende kontrollerede sats frysning (ved ca. 1 °c/min) til kryogene temperaturer4,5. Trods mange rapporterede optimeringer, er CPA toksicitet sammen med skadelige osmotiske ubalancer under frysning og mekanisk belastning af isdannelse fortsat grundlæggende ulemper ved langsom frysning6,7.
Forvitrifikation giver en fordel i forhold til langsom frysning i, at skaden på grund af isdannelse er helt undgås ved en direkte fase overgang af vand i glasset tilstand6. For at nå glasovergangstemperaturen i rent vand (-137 °C) skal vandet dog afkøles med en hastighed på 1.000.000 grader Celsius pr. sekund (dvs. den kritiske afkølingshastighed) for at undgå isdannelse over glasovergangstemperaturen8 . Tilsætning af CPAs kan sænke den kritiske afkølingshastighed og øge glasovergangstemperaturen af vandige opløsninger9. Men selv med høje CPA-koncentrationer (f. eks. 40% v/v DMSO eller højere) kræves der ikke desto mindre hurtige afkølingshastigheder for at opnå en vellykket forvitrifikation på8,9.
De påkrævede afkølingshastigheder og høje CPA-koncentrationer resulterer i to store ulemper ved forvitrifikation. For det første skal prøverne have en lav termisk masse for at muliggøre hurtig afkøling. For det andet, for at nå høje CPA koncentrationer og samtidig undgå osmotisk skade, CPAs skal langsomt indføres og fuldt ud ligevægt mellem intra-og ekstracellulære rum6. Dette øger eksponeringstid af celler til giftige CPAs. Sammen, dette gør forglasning en besværlig proces, der er begrænset til et par små størrelser prøver (mikroliter) ad gangen. Droplet vitrifikation er blevet foreslået som en potentiel løsning på disse begrænsninger. Ved at udsætte de minimale celle belastede dråber (nanoliere) til flydende nitrogen øges afkølingshastigheden betydeligt, hvilket derfor giver mulighed for en betydelig reduktion af CPA-koncentrationen10,11,12 ,13,14. Selv om flere højfrekvente dråber-genererende dyser potentielt kan anvendes samtidigt, begrænser den ekstremt lille Dråbestørrelse dataoverførselshastigheden til mikroliter pr. minut10, hvilket udelukker effektiv forvitning af store celle volumener med størrelser højere forarbejdnings hastigheder på rækkefølgen af milliliter pr. minut.
For nylig blev det påvist, at disse iboende begrænsninger af forvitrifikation kan overvindes ved bulk dråbe vitrifikation15. Denne nye metode udnytter hurtig osmotisk dehydrering til at koncentrere en intracellulær CPA koncentration af 7,5% v/v ethylenglycol og DMSO umiddelbart før forvitrifikation, eliminere behovet for fuld ligevægt af toksiske CPA koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed ved en kort eksponering af hepatocytterne til en høj ekstracellulær CPA koncentration. Selv om denne eksponering forårsager hurtig osmotisk dehydrering, det er for kort til den høje CPA koncentration at diffus ind i cellerne. Umiddelbart efter dehydrering indlæses cellerne i dråber, der er direkte vitrificeret i flydende nitrogen. Denne metode eliminerer behovet for fuld intracellulær optagelse af høje CPA-koncentrationer, mens den høje ekstrellulære CPA-koncentration muliggør forvitrifikation af store små dråber, hvilket resulterer i høje gennemløb med minimal CPA-toksicitet.
Dråbe vitrifikation forbedrer direkte og langsigtet levedygtighed efter konservering, samt morfologi og metabolisk funktion af primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk Kryopreservation ved langsomt frysning15. Dette manuskript giver de metodologiske detaljer for bulk dråbe vitrifikation af primære rotte hepatocytter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Forvitrifikation er et lovende isfrit alternativ til klassisk langsom frysning (ved ca. 1 °C/min) Kryopreservation af biologiske prøver. Forvitrifikation kræver ekstremt hurtige afkølingshastigheder for at opnå overgang af vand til glas fasen, samtidig med at skadelig isdannelse undgås. Selvom præ-inkubation med kryoprotective-midler (CPA) kan reducere den kritiske afkølingshastighed for biologiske prøver, er der generelt behov for høje koncentrationer for at muliggøre iskold kryopræservering ved vitrifikation. Som følge heraf hæmmes vitrifikation af CPA toksicitet og begrænset til små prøver, der kan afkøles hurtigt. Det blev for nylig påvist, at disse iboende begrænsninger kan overvindes ved bulk dråbe forvitrifikation. Ved hjælp af denne nye metode, celler er først præ-inkuberet med en lav intracellulær CPA koncentration. Ved at udnytte hurtig osmotisk dehydrering er den intracellulære CPA koncentreret direkte forud for forvitringen, uden at det er nødvendigt fuldt ud at ækvibrere toksiske CPA-koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed og integreret med kontinuerlig høj gennemløb generation af store størrelser dråber, der er vitrificeret i flydende nitrogen. Denne isfri kryopreserverings metode med minimal CPA-toksicitet er velegnet til store celle mængder og resulterer i øget hepatocyt levedygtighed og metabolisk funktion i forhold til klassisk langsom frysning Kryopreservation. Dette manuskript beskriver metoderne til vellykket bulk-dråbe vitrifikation i detaljer.

Nyisolerede primære hepatocytter fra fem forskellige rotte lever blev anvendt til en direkte sammenligning af bulk-dråbe vitrificering til klassisk Kryopreservation ved hjælp af de fremtrædende Slow-frysning protokoller, der er rapporteret i litteraturen4, 5. kort sagt blev hepatocytterne suspenderet i UW suppleret med BSA (2,2 mg/ml), glucose (333 mm) og DMSO (10% v/v) og frosset ved hjælp af en kontrolleret hastighed fryser. Efter opbevaring ved-196 °C, ...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Dette manuskript beskriver en isfri kryopreserverings metode for store mængder rotte hepatocytter, hvor primære celler er præ-inkuberet med kryoprotective midler i en lav koncentration og vitrificeret i store dråber.

Bulk dråbe vitrifikation for primær Hepatocyte konservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrificering håndteres typisk af toksicitet af kryoprotektive midler. Og genindsættes til små prøver, der kan afkøles hurtigt. Denne protokol muliggør vitrificering af store cellemængder, mens der ved hjælp af en lav CPA-koncentration under inkubation.Ved hjælp af hurtig osmotisk dehydrering er den lave interkælder CPA koncentreret i væskeanordningen lige foran vitrificering. Dette eliminerer behovet for fuldt ligevægtstoksiske CPA-koncentrationer. Bulk dråbe vitrificering kan give levedygtige og metabolisk aktive hepatocytter til brug hepatocytes transplantation og bio-kunstige leverenheder, som vores i øjeblikket hæmmet af utilstrækkelige resultater efter kryopræservering.Denne metode kan potentielt tilpasses til vitrificering af andre celletyper, der skal kryokonserveres i store mængder, såsom blandt andet blodprodukter eller stamceller. Til at begynde, gøre vitrificering Løsning 1 ved at tilføje 40 milligram BSA til 17.0 milliliter university of Wisconsin løsning. Brug et 0,22 mikrometerfilter til at sterilt filtrere opløsningen og opbevares ved fire grader Celsius.Gør vitrificering løsning 2 som beskrevet i protokollen. Og sterilt filtrere det gennem et 0,22 mikrometerfilter. Der indlæses 3,5 milliliter sterilt filtreret V2-opløsning i en tre millilitersprøjte, og opbevares ved fire grader Celsius.For at forberede bulk dråbe vitrificering apparat, først skæres langs den ene side af blandenåle ydre grå ærme. Bøj ærmet åben for at fjerne det fra blandenålen. Skær derefter blandenålen til en længde på 20 millimeter og sæt dens cutoff stikkontakt i en 20 gauge injektion nål.Skub to 25 millimeter siliciumrør sektioner over indløb af blandenålen. Og sikre deres position med lim. Steriliser denne samling ved autoklavering.Fyld en steril Dewar kolbe med flydende nitrogen. Og sterilisere ydersiden med isopropanol før du placerer den i en steril Laminer flow-celle kultur hætte. Sørg for at bære passende personlige værnemidler, da flydende nitrogen kan forårsage alvorlige forbrændinger.For at oprette dråbesamlingsenheden skal du indsætte en tragt med samme ydre diameter som dewarens indre diameter i et konisk rør på 50 milliliter. Ved hjælp af store faktæmpninger skal du langsomt trykke dråbeopsamlingsanordningen ned i det flydende nitrogen i sin endelige lodrette position. Sørg for, at det koniske rør hviler lodret i bunden af Dewar.Og det flydende kvælstofniveau er en centimeter lavere end kanten af tragten. Hvis du vil montere en sprøjtepumpe i lodret position på væggen i cellekulturhætten, skal du binde en snor fra sprøjtepumpens fødder til skruer, der stikker ud fra cellekulturhættevæggen. Anvend derefter det flydende nitrogen Dewar med dråbeopsamlingsenheden under den vertikalt monterede sprøjtepumpe.Efter at have opnået frisk isolerede rotte hepatocytter, tælle bestanden koncentration ved tri-pan blå udelukkelse. Og overfør 40 millioner levedygtige hepatocytter til et 50 milliliter konisk rør. Centrifuge hepatocytter på 50 gange G i fem minutter uden pause.Aspirate supernatant. Re-suspendere hepatocytterne i 3,4 milliliter V1 Solution. Og inkuber på is i tre minutter.Derefter tilsættes 150 mikroliter DMSO og 150 mikroliter EG;bland forsigtigt og inkuberes på is igen i tre minutter. Tilsæt 150 mikroliter DMSO og 150 mikroliter af EG til hepatocytterne igen og bland forsigtigt. Der skal vejes 3,5 milliliter af denne blanding i en 3 millilitersprøjte.Sæt sprøjten med forinskuberede hepatocytter og sprøjten med V2-opløsning på sprøjtepumpeadapteren. Fastgør to Hun Luer Lock slange-barb adaptere til sprøjterne. Og skub silicium slangen af blandenål forsamling over modhager fittings.Ansting hele samlingen i sprøjtepumpen. Tre minutter efter den sidste udgave af DMSO og EG til hepatocytterne, skal du starte pumpen med to milliliter i minuttet. Efter at alle hepatocytter er blevet tilsat til den flydende kvælstof stoppe pumpen.Ved hjælp af en 20 gauge nål, punktering 10 små huller i låget af en 50 milliliter konisk rør. Og pak ydersiden af låget med en fleksibel film, hvilket skaber en ventil, der vil gøre det muligt at slippe for at fordampe overskydende flydende nitrogen. For at indsamle de forglassede hepatocytdråber skal du først fjerne tragten fra Dewar med flydende nitrogen.Dernæst, med lange faketter, tage det koniske rør, der indeholder dråberne fra det flydende kvælstof, og langsomt hælde den overskydende flydende kvælstof fra det koniske rør. Luk det koniske rør med det punkterede låg, og anslå det lukkede koniske rør med forglasset hepatocytedråber tilbage i Dewar med flydende nitrogen. Endelig overføres det koniske rør fra det flydende kvælstof til en flydende nitrogenkyotank.Når du har lavet rewarming-opløsningen med saccharose og DMEM hepatocytkulturmedier, skal du bruge et 0,22 mikrometerfilter til at sterilt filtrere det. Så varm den til 37 grader Celsius. For at rewarm hepatocytterne skal du fjerne det koniske rør med forglasset hepatocytter fra kryotanken og transportere det i en flydende nitrogen Dewar til subkulturhætten.Løsn hætten let, og anslænke det koniske rør tilbage i det flydende nitrogen. Arbejde hurtigt, tilsæt alle de forglasset hepatocyte dråber til et tomt bægerglas, derefter hurtigt tilføje 100 milliliter 37 grader Celsius varm rewarming opløsning under omrøring i 10 sekunder. Når dråberne fjernes fra flydende nitrogen intra-est frysning sker inden for få sekunder, hvis dråberne ikke hurtigt rewarmed.Derfor er det vigtigt direkte at tilføje de rewarming medier til dråberne under omrøring. Opdel den rewarming opløsning med hepatocytter i to 50 milliliter koniske rør. Centrifuge rørene i to minutter ved 100 gange G ved fire grader Celsius uden pause.Inspirer supernatanterne for at efterlade et samlet volumen på 12,5 milliliter ved hjælp af rørets gradueringsmærke som reference. For at fortynde rewarming opløsningen til 50%tilsæt 12,5 milliliter iskold DMEM pr konisk rør. Re-suspendere og inkubere på is i tre minutter.For at fortynde rewarming opløsningen til 25%tilsæt 25 milliliter iskold DMEM pr konisk rør. Efter centrifugering i fem minutter ved 50 gange G ved fire grader Celsius uden pause, aspirere supernatant og re-suspendere hepatocytter i to milliliter af den ønskede kultur medium. Målt ved tre-pan blå udelukkelse test, som bestemmer membran integritet, bulk dråbe vitrificering resulterede i en direkte post-bevarelse hepatocyte levedygtighed på 79%Dette var betydeligt højere end 68%levedygtighed efter klassisk optimeret kryopræservering.Udbyttet af bulk dråbe vitrificering var 56%, Hvilket var 10% højere og mere konsekvent end klassisk kryopræservering. Ved hjælp af presto-lim metabolisering assay i langsigtede college og sandwich kulturer, metabolisk aktivitet på hepatocytter blev målt til at være betydeligt højere efter bulk dråbe vitrification derefter efter klassisk kryopræservering. Albumin syntese, som den mest udbredte parameter for syntetisk funktion hepatocytes, var større ved næsten dobbelt efter bulk dråbe vitrification, derefter efter klassisk kryopræservering.Urea produktion blev brugt til at måle hepatocyt afgiftning funktion i en uge kultur. I bulk dråbeglasset hepatocytter, urea produktionen var betydeligt højere end i klassiske cryopreserve hepatocytes. For ensartede resultater efter bulk dråbe vitrificering er det vigtigt præcist at følge timingen under præ-inkubation af CPA'er og rewarming som beskrevet i denne protokol.Efter rewarming de forglasset hepatocyte dråber vil du ende op med en bedre dimensionering suspension, som derfor kan bruges på alle de samme måder, som hvis de var frisk isoleret. Som en forbedret konserveringsmetode kan bulkdråbevitificering øge tilgængeligheden pri-ma til forskning og kliniske anvendelser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescenspåvisning metoder for mikrofluide dråbe platforme

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescens Detection for Droplet Microfluidics Brug af optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Cirkulerende MicroRNA Kvantificering Brug DNA-bindende Dye Kemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Mikrofluidapparat Flow Afdeling Model for trombocytinfusion og Hæmostase Måler blodpladeaflejring og fibrindannelse i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En dråbe mikrofluid tilgang og Microsphere-PCR-amplifikation til enkeltstrenget DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Morfometrisk protokol for en objektiv vurdering af Blastocyst adfærd under vitrifikation og opvarmning trin

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobielle stammer for bioremediation og probiotika udvikling for meta organ forskning og konservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Høj gennemløb Gær Strain Fænotryk med Dråbe-baseret RNA Sekventering

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...