Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

De financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 en R01DK114506) en het Amerikaanse ministerie van defensie (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wordt sterk erkend.

De primaire hepatocyte isolaties voor dit protocol werden uitgevoerd door de Cell resource core (CRC) bij Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Het Animal Protocol (#2011N000111) werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Massachusetts General Hospital.
1. bulk druppel verglazing
<ol><li>Bereid de vitrificatie-oplossingen.
	<ol>
<li>Voeg 40 mg bovien serumalbumine (BSA) toe aan 17,0 mL van de Universiteit van...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Cryopreservation van hepatocyten door Slow-bevriezing resulteert in verminderde levensvatbaarheid en metabole functie. Vitrificatie biedt een veelbelovend alternatief voor klassieke cryopreservering, omdat het bevriezen van letsel volledig wordt vermeden9. Echter, pre-incubatie met Ocmw's is nodig om de kritische koelsnelheid te verlagen8. Bijgevolg wordt de vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit17 en beperkt tot kleine monstervolumes. In inspann...

Verlies van de levensvatbaarheid van de cel en metabole functie na cryopreservatie van hepatocyten is nog steeds een belangrijk probleem dat de klinische toepassingen beperkt1,2,3. De benchmark methode van hepatocyte cryopreservatie is traag invriezen, die wordt uitgevoerd door het pre-incuberen van de hepatocyten met CPA (dimethylsulfoxide [DMSO], glucose en albumine) en daaropvolgende gecontroleerde snelheid bevriezing (bij ongeveer 1 °c/min) tot cryogene temperaturen4,5. Ondanks veel gerapporteerde optimalisaties blijven CPA-toxiciteit samen met schadeveroorzakende osmotische onevenwichtigheden tijdens het invriezen en mechanische stress van ijsvorming fundamentele nadelen van traag bevriezen van6,7.
Vitrificatie biedt een voordeel ten opzichte van langzaam invriezen in dat letsel als gevolg van ijsvorming wordt volledig vermeden door een directe faseovergang van water in de glas staat6. Om de Glasovergangstemperatuur van zuiver water (-137 °C) te bereiken, moet het water echter worden gekoeld tegen snelheden in de volgorde van 1.000.000 graden Celsius per seconde (d.w.z. de kritische koelsnelheid) om ijsvorming boven de glazen overgangstemperatuur te voorkomen8 . Toevoeging van Ocmw's kan de kritische koelsnelheid verlagen en de Glasovergangstemperatuur van waterige oplossingen9verhogen. Echter, zelfs met hoge CPA-concentraties (bijv. 40% v/v DMSO of hoger) zijn de snelle koelsnelheden niettemin vereist voor een succesvolle verglavering van8,9.
De vereiste koelsnelheden en hoge CPA-concentraties resulteren in twee belangrijke nadelen van vitrificatie. Ten eerste, om snelle koeling mogelijk te maken, moeten de monsters een lage thermische massa hebben. Ten tweede, om hoge CPA-concentraties te bereiken terwijl osmotische schade wordt vermeden, moet de Ocmw's langzaam worden ingevoerd en volledig worden geëscaleerd tussen de intra-en extracellulaire compartimenten6. Dit verhoogt de blootstellingstijd van cellen tot toxische Ocmw's. Samen maakt dit de verglavering tot een omslachtig proces dat beperkt is tot enkele kleine samples (micro liters) tegelijkertijd. Droplet-vitrificatie is voorgesteld als een mogelijke oplossing voor deze beperkingen. Door minuscule cel-beladen druppeltjes (nanoliters) aan vloeibare stikstof bloot te stellen, wordt de koelsnelheid aanzienlijk verhoogd, waardoor een aanzienlijke reductie van de CPA-concentratie mogelijk is10,11,12 ,13,14. Hoewel meerdere hoogfrequente druppel genererende nozzles gelijktijdig kunnen worden gebruikt, beperkt de extreem kleine druppelgrootte de doorvoer tot micro liters per minuut10, wat een efficiënte verglazing van grote cellen uitsluit volumes met magnitudes hogere verwerkingssnelheden op de orde van milliliter per minuut.
Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen van vitrificatie kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes vitrificatie15. Deze nieuwe methode maakt gebruik van snelle osmotische dehydratie om een intracellulaire CPA-concentratie van 7,5% v/v ethyleenglycol en DMSO onmiddellijk voorafgaand aan vitrificatie te concentreren, waardoor de noodzaak van volledige evenwichting van toxische CPA-concentraties wordt geëlimineerd. De cellulaire dehydratie wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat door een korte blootstelling van de hepatocyten aan een hoge extracellulaire CPA-concentratie. Hoewel deze blootstelling snelle osmotische uitdroging veroorzaakt, is het te kort om de hoge CPA-concentratie te verspreiden in de cellen. Onmiddellijk na uitdroging worden de cellen geladen in druppels die rechtstreeks in vloeibare stikstof worden verglaasd. Deze methode elimineert de noodzaak van volledige intracellulaire opname van hoge CPA-concentraties, terwijl de hoge extracellulaire CPA-concentratie vitrificatie van groot formaat druppels mogelijk maakt, resulterend in hoge doorvoer volumes met minimale CPA-toxiciteit.
Druppel vitrificatie verbetert de levensvatbaarheid op de directe en lange termijn na conservering, evenals de morfologie en metabole functie van primaire rat hepatocyten in vergelijking met klassieke cryopreservatie door Slow-bevriezing15. Dit manuscript verschaft de methodologische Details voor bulk druppel verglazing van primaire rat hepatocyten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Vitrificatie is een veelbelovend ijsvrij alternatief voor klassiek langzaam invriezen (bij ongeveer 1 °C/min) cryopreservering van biologische monsters. Vitrificatie vereist extreem snelle koelsnelheden om de overgang van water in de glas fase te bereiken, terwijl schadelijke ijsvorming wordt vermeden. Hoewel pre-incubatie met cryoprotective agents (CPA) de kritische koelsnelheid van biologische monsters kan verminderen, zijn hoge concentraties in het algemeen nodig om ijsvrije cryopreservering door vitrificatie mogelijk te maken. Hierdoor wordt vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit en beperkt tot kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes verglazing. Met behulp van deze nieuwe methode worden cellen eerst vooraf geïnincubeerd met een lage intracellulaire CPA-concentratie. Door gebruik te maken van snelle osmotische uitdroging, is de intracellulaire CPA direct voor vitrificatie geconcentreerd, zonder de noodzaak om toxische CPA-concentraties volledig te equilibraten. De cellulaire uitdroging wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat en geïntegreerd met continue hoge doorvoer generatie van groot formaat druppels die zijn verglaasd in vloeibare stikstof. Deze Ice-Free cryopreservatie-methode met minimale CPA-toxiciteit is geschikt voor grote celhoeveelheden en resulteert in een verhoogde levensvatbaarheid van hepatocyten en metabole functie in vergelijking met klassieke langzaam invriezing cryopreservatie. Dit manuscript beschrijft de methoden voor een succesvolle verglazing van de bulk druppel in detail.

Vers geïsoleerde primaire hepatocyten van vijf verschillende rat levers werden gebruikt voor een directe vergelijking van bulk druppel verglazing naar klassieke cryopreservatie met behulp van de vooraanstaande Slow-Vries protocollen gerapporteerd in de literatuur4, 5. Kortom, de hepatocyten werden opgeschort in uw aangevuld met BSA (2,2 mg/ml), glucose (333 mm), en DMSO (10% v/v) en bevroren met een gecontroleerde frequentie vriezer. Na opslag bij-196 °C werde...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Dit manuscript beschrijft een ijsvrije cryopreservatie-methode voor grote hoeveelheden rat hepatocyten waarbij primaire cellen worden voorgeïnpoleerd met cryoprotective agenten in een lage concentratie en verglaasd in grote druppels.

Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrificatie wordt meestal behandeld door toxiciteit van cryoprotectieve middelen. En opnieuw ingevoegd in kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Dit protocol maakt vitrificatie van grote celhoeveelheden mogelijk tijdens het gebruik van een lage CPA-concentratie tijdens pre-incubatie.Met behulp van snelle osmotische uitdroging, de lage inter-kelder CPA is geconcentreerd in de vloeistof apparaat direct voor vitrificatie. Dit elimineert de noodzaak van volledig evenwichts giftige CPA concentraties. Bulkdruppel vitrificatie kan levensvatbare en metabolisch actieve hepatocyten voor het gebruik van hepatocyten transplantatie en bio-kunstmatige lever apparaten die onze momenteel belemmerd door onvoldoende resultaten na cryopreservatie.Deze methode kan mogelijk worden aangepast voor vitrificatie van andere celtypen die in grote hoeveelheden moeten cryo-verduurzaamd zijn;zoals bloedproducten of stamcellen. Om te beginnen, maak vitrification Oplossing 1 door het toevoegen van 40 milligram BSA tot 17,0 milliliter van de Universiteit van Wisconsin Solution. Gebruik een filter van 0,22 micrometer om de oplossing te steriliseren en op te slaan op vier graden Celsius.Maak vitrification Solution 2 zoals beschreven in het protocol. En steriel filter het door een 0,22 micrometer filter. Laad 3,5 milliliter steriel gefilterde V2-oplossing in een spuit van drie milliliter en bewaar op vier graden Celsius.Ter voorbereiding van de bulk druppelglavermaak apparaat, eerst, gesneden langs de ene kant van de mengnaalden buitenste grijze huls. Buig de mouw open om deze uit de mengnaald te verwijderen. Snijd vervolgens de mengnaald tot een lengte van 20 millimeter en steek de cut-off uitlaat in een 20-meter injectienaald.Schuif twee 25 millimeter silicium buizen secties over de inhammen van de mengnaald. En zet hun positie vast met lijm. Steriliseren deze assemblage door autoclaving.Vul een steriele Dewar-kolf met vloeibare stikstof. En steriliseer de buitenkant met isopropanol voordat je het in een steriele Laminer flow-cell kweekkap plaatst. Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen als vloeibare stikstof kan ernstige brandwonden veroorzaken.Voor het maken van de druppel collectie apparaat steek een trechter met dezelfde buitenste diameter als de binnenste diameter van de Dewar, in een 50 milliliter conische buis. Druk met grote tangen het druppelophaalapparaat langzaam naar beneden in de vloeibare stikstof in de uiteindelijke verticale positie. Zorg ervoor dat de conische buis in verticale positie aan de onderkant van de Dewar rust.En het vloeibare stikstofniveau is een centimeter lager dan de rand van de trechter. Om een spuitpomp te monteren op een verticale positie op de muur van de celcultuurkap, bind een touw van de voeten van de spuitpomp aan schroeven die uit de muur van de celkweekkap uitsteken. Plaats vervolgens de vloeibare stikstof Dewar met het druppelverzamelapparaat onder de verticaal gemonteerde spuitpomp.Na het verkrijgen van vers geïsoleerde ratten hepatocyten, tellen de voorraad concentratie door tri-pan blauwe uitsluiting. En breng 40 miljoen levensvatbare hepatocyten over in een 50 milliliter conische buis. Centrifuge de hepatocyten op 50 keer G gedurende vijf minuten zonder pauze.Aspirate de supernatant. Schors de hepatocyten opnieuw in 3,4 milliliter V1 Solution. En drie minuten lang incuberen op ijs.Voeg vervolgens 150 microliter DMSO en 150 microliter eg-liters toe;meng voorzichtig en broed nogmaals gedurende drie minuten op ijs. Voeg 150 microliter DMSO en 150 microliter EG weer toe aan de hepatocyten en meng voorzichtig. Laad 3,5 milliliter van dit mengsel in een spuit van drie milliliter.Plaats de spuit met voorgebroede hepatocyten en de spuit met V2 Solution op de spuitpompadapter. Bevestig twee Vrouwelijke Luer Lock slang-barb adapters aan de spuiten. En schuif de silicium buizen van de mengnaald assemblage over de barb fittingen.Plaats deze hele montage in de spuitpomp. Drie minuten na de laatste editie van DMSO en EG aan de hepatocyten, start de pomp op twee milliliter per minuut. Immers hepatocyten zijn toegevoegd aan de vloeibare stikstof stoppen met de pomp.Met behulp van een 20-meter naald, punctie 10 kleine gaatjes in het deksel van een 50 milliliter conische buis. En wikkel de buitenkant van het deksel met een flexibele film, het creëren van een klep die het mogelijk maakt de ontsnapping van verdampende overgebleven vloeibare stikstof. Om de verglaasde hepatocyte druppels te verzamelen, moet u eerst de trechter uit de Dewar verwijderen met vloeibare stikstof.Vervolgens, met lange tangen, haal je de conische buis eruit die de druppels uit de vloeibare stikstof bevat en giet je langzaam de overtollige vloeibare stikstof uit de conische buis. Sluit de conische buis met het doorboorde deksel en plaats de gesloten conische buis met verglaasde hepatocytedruppels direct terug in de Dewar met vloeibare stikstof. Breng ten slotte de conische buis van de vloeibare stikstof over in een vloeibare stikstof cryotank.Na het maken van de opwarmoplossing met sacharose en DMEM hepatocyte kweekmedia, gebruik je een filter van 0,22 micrometer om het te steriliseren. Dan warm het op tot 37 graden Celsius. Om de hepatocyten te warmen verwijder de conische buis met verglaasde hepatocyten uit de cryotank en transporteert deze in een vloeibare stikstof Dewar naar de subcultuurkap.Maak de dop licht los en plaats de conische buis terug in de vloeibare stikstof. Snel werken, voeg alle verglaasde hepatocyte druppels aan een lege beker, voeg dan snel 100 milliliter van 37 graden Celsius warme opwarmoplossing tijdens het roeren gedurende 10 seconden. Wanneer de druppels worden verwijderd uit vloeibare stikstof intra-est bevriezing optreedt binnen enkele seconden als de druppels niet snel worden opgewarmd.Daarom is het van cruciaal belang om de opwarmmedia direct toe te voegen aan de druppels tijdens het roeren. Verdeel de opwarmoplossing met hepatocyten in twee conische buizen van 50 milliliter. Centrifugeren de buizen gedurende twee minuten op 100 keer G bij vier graden Celsius zonder pauze.Aspirate de supernatants om een totaal volume van 12,5 milliliter met behulp van de buis afstuderen merk als referentie te verlaten. Om de opwarmoplossing tot 50% te verdunnen voeg 12,5 milliliter ijskoude DMEM per conische buis toe. Drie minuten opnieuw ophangen en uitbroeden op ijs.Om de opwarmoplossing te verdunnen tot 25%voeg 25 milliliter ijskoude DMEM per conische buis. Na vijf minuten centrifugeren bij 50 keer G bij vier graden Celsius zonder pauze, de supernatant aanzuigen en de hepatocyten opnieuw op te schorten in twee milliliters van het gewenste kweekmedium. Gemeten door tri-pan blauwe uitsluiting testen, die membraan integriteit bepaalt, bulk druppel vitrification resulteerde in een directe post-conservering hepatocyte levensvatbaarheid van 79%Dit was aanzienlijk hoger dan de 68%levensvatbaarheid na klassieke geoptimaliseerde cryopreservatie.De opbrengst van bulkdruppel vitrification was 56%, dat was 10% hoger en consistenter dan klassieke cryopreservatie. Met behulp van presto-lijm metabolisatie test in de lange termijn college en sandwich culturen, metabole activiteit op de hepatocyten werd gemeten om aanzienlijk hoger te zijn na bulk druppel vitrification dan na de klassieke cryopreservatie. Albumin synthese, als de meest gebruikte parameter van synthetische functie van hepatocyten, was groter door bijna twee keer na bulk druppel vitrification, dan na de klassieke cryopreservatie.Ureum productie werd gebruikt om hepatocyte ontgifting functie te meten in een een week cultuur. In bulk druppelvergladde hepatocyten was de ureumproductie aanzienlijk hoger dan die in klassieke cryopreserve hepatocyten. Voor consistente resultaten na bulkdruppel vitrification is het belangrijk om de timing precies te volgen tijdens de pre-incubatie van CPA's en het opwarmen zoals beschreven in dit protocol.Na het opwarmen van de verglaasde hepatocyte druppels zul je eindigen met een betere sizing suspensie die daarom op dezelfde manieren kan worden gebruikt alsof ze vers geïsoleerd zijn. Als een verbeterde conserveringsmethode kan bulkdruppel vitrification de beschikbaarheid pri-ma voor onderzoek en klinische toepassingen verhogen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...