Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
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Le financement des National Institutes of Health des États-Unis (R01DK096075, R01DK107875 et R01DK114506) et du département américain de la Défense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) est grandement reconnu.

Les isolements primaires d'hépatocyte pour ce protocole ont été exécutés par le noyau de ressource de cellules (CRC) au Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, Etats-Unis. Le protocole animal (#2011N000111) a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts General Hospital.
1. Vitrification des gouttelettes en vrac
<ol><li>Préparer les solutions de vitrification.
	<ol>
<li>Ajouter 40 mg d'album...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. 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La cryoconservation des hépatocytes par congélation lente entraîne une viabilité réduite et une fonction métabolique. Vitrification offre une alternative prometteuse pour la cryoconservation classique, comme les dommages de congélation est complètement évité9. Cependant, la pré-incubation avec les CPA est nécessaire pour abaisser le taux de refroidissement critique8. Par conséquent, la vitrification est entravée par la toxicitécpA 17 e...

La perte de la viabilité cellulaire et de la fonction métabolique après la cryoconservation des hépatocytes est toujours un problème majeur qui limite les applications cliniques1,2,3. La méthode de référence de la cryoconservation des hépatocytes est la congélation lente, qui est effectuée en pré-incubant les hépatocytes avec CPA (sulfoxide de diméthyle [DMSO], glucose et albumine) et le gel contrôlé subséquent (à environ 1 oC/min) pour températures cryogéniques4,5. Malgré de nombreuses optimisations signalées, la toxicité de CPA ainsi que les déséquilibres osmotiques préjudiciables pendant le gel et le stress mécanique de la formation de glace demeurent des inconvénients fondamentaux du gel lent6,7.
Vitrification offre un avantage sur le gel lent dans cette blessure due à la formation de glace est complètement évitée par une transition de phase directe de l'eau dans l'état de verre6. Toutefois, pour atteindre la température de transition du verre de l'eau pure (-137 oC), l'eau doit être refroidie à des taux de l'ordre d'un million de degrés Celsius par seconde (c.-à-d. le taux de refroidissement critique) afin d'éviter la formation de glace au-dessus de la température de transition du verre8 . L'ajout de CPA peut abaisser le taux critique de refroidissement et augmenter la température de transition de verre des solutions aqueuses9. Cependant, même avec des concentrations élevées de CPA (par exemple, 40% v/v DMSO ou plus) des taux de refroidissement rapide sont néanmoins nécessaires pour une vitrification réussie8,9.
Les taux de refroidissement requis et les concentrations élevées de CPA entraînent deux inconvénients majeurs de la vitrification. Tout d'abord, pour permettre un refroidissement rapide, les échantillons doivent avoir une faible masse thermique. Deuxièmement, pour atteindre des concentrations élevées de CPA tout en évitant les blessures osmotiques, les CPA doivent être introduits lentement et entièrement équilibrés entre les compartiments intra- et extracellulaires6. Cela augmente le temps d'exposition des cellules aux CPA toxiques. Ensemble, cela rend la vitrification un processus lourd qui se limite à quelques échantillons de petite taille (microlitres) à la fois. La vitrification des gouttelettes a été proposée comme solution potentielle à ces restrictions. En exposant de minuscules gouttelettes chargées de cellules (nanolitres) à l'azote liquide, le taux de refroidissement est considérablement augmenté, ce qui permet par conséquent une réduction considérable de la concentration de CPA10,11,12 ,13,14. Bien que plusieurs buses à haute fréquence génératrices de gouttelettes pourraient potentiellement être utilisées simultanément, la taille extrêmement petite de gouttelette limite le débit aux microlitres par minute10,qui empêche la vitrification efficace de grandes cellules volumes avec des taux de traitement plus élevés de magnitudes de l'ordre de millilitres par minute.
Récemment, il a été démontré que ces limitations inhérentes de la vitrification peuvent être surmontées par la vitrification des gouttelettes en vrac15. Cette nouvelle méthode tire parti de la déshydratation osmotique rapide pour concentrer une concentration intracellulaire de CPA de 7,5% v/v d'éthylène glycol et DMSO immédiatement avant la vitrification, éliminant le besoin d'équilibre complet des concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide par une brève exposition des hépatocytes à une concentration extracellulaire élevée de CPA. Bien que cette exposition provoque une déshydratation osmotique rapide, il est trop court pour que la concentration élevée de CPA se diffuse dans les cellules. Immédiatement après la déshydratation, les cellules sont chargées en gouttelettes qui sont directement vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode élimine le besoin d'une pleine prise intracellulaire de fortes concentrations de CPA tandis que la concentration extracellulaire élevée de CPA permet la vitrification des gouttelettes de grande taille, ayant pour résultat des volumes de débit élevés avec la toxicité minimale de CPA.
La vitrification des gouttelettes améliore la viabilité directe et à long terme après la préservation, ainsi que la morphologie et la fonction métabolique des hépatocytes de rat primaires par rapport à la cryoconservation classique par congélation lente15. Ce manuscrit fournit les détails méthodologiques pour la vitrification en vrac des hépatocytes de rat primaire.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

La vitrification est une solution de rechange prometteuse sans glace pour la cryoconservation classique de la congélation lente (à environ 1 oC/min) des échantillons biologiques. La vitrification nécessite des taux de refroidissement extrêmement rapides pour assurer la transition de l'eau dans la phase de verre tout en évitant la formation de glace dommageable. Bien que la pré-incubation avec des agents cryoprotecteurs (CPA) puisse réduire le taux critique de refroidissement des échantillons biologiques, des concentrations élevées sont généralement nécessaires pour permettre la cryoconservation sans glace par vitrification. En conséquence, la vitrification est entravée par la toxicité cpA et limitée aux petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Il a été récemment démontré que ces limitations inhérentes peuvent être surmontées par la vitrification en vrac des gouttelettes. Utilisant cette nouvelle méthode, les cellules sont d'abord pré-incubées avec une faible concentration intracellulaire de CPA. Tirant parti de la déshydratation osmotique rapide, l'APC intracellulaire est concentré directement avant la vitrification, sans avoir besoin d'équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide et intégrée à la génération continue à haut débit de grosses gouttelettes qui sont vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode de cryoconservation sans glace avec une toxicité minimale de CPA convient aux grandes quantités de cellules et a comme conséquence la viabilité accrue d'hépatocyte et la fonction métabolique comparée à la cryoconservation lente-congélation classique. Ce manuscrit décrit en détail les méthodes de vitrification réussie des gouttelettes en vrac.

Des hépatocytes primaires fraîchement isolés de cinq foies de rat différents ont été utilisés pour une comparaison directe de la vitrification des gouttelettes en vrac à la cryoconservation classique en utilisant les protocoles prééminents de congélation lente rapportés dans la littérature4, 5. En bref, les hépatocytes ont été suspendus dans UW complétés avec BSA (2.2 mg/mL), glucose (333 mM), et DMSO (10% v/v) et congelés à l'aide d'un cong?...

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Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Ce manuscrit décrit une méthode de cryoconservation sans glace pour de grandes quantités d'hépatocytes de rat par laquelle les cellules primaires sont pré-incubées avec des agents cryoprotecteurs à une faible concentration et vitrifiées dans de grandes gouttelettes.

Vitrification en vrac de gouttelette pour la conservation primaire d'hépatocyte

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

La vitrification est généralement traitée par la toxicité des agents cryoprotecteurs. Et réinséré à de petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Ce protocole permet la vitrification de grandes quantités cellulaires tout en utilisant une faible concentration de CPA pendant la pré-incubation.Utilisant la déshydratation osmotique rapide, le CPA inter-cave bas est concentré dans le dispositif fluide directement avant la vitrification. Cela élimine la nécessité d’équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La vitrification de gouttelette en vrac peut fournir des hépatocytes viables et métaboliquement actifs pour l’utilisation de la transplantation d’hépatocytes et des dispositifs bio-artificiels de foie que notre actuellement entravé par des résultats inadéquats après cryopréservation.Cette méthode peut potentiellement être adaptée à la vitrification d’autres types de cellules qui doivent être cryo-conservés en grandes quantités; tels que les produits sanguins ou les cellules souches, entre autres. Pour commencer, faire la solution de vitrification 1 en ajoutant 40 milligrammes de BSA à 17,0 millilitres de l’Université du Wisconsin Solution. Utilisez un filtre de 0,22 micromètre pour filtrer stérilement la solution et la conserver à quatre degrés Celsius.Faire vitrification Solution 2 tel que décrit dans le protocole. Et filtre stérile à travers un filtre de 0,22 micromètre. Chargez 3,5 millilitres de solution V2 filtrée stérilement dans une seringue de trois millilitres et stockez-les à quatre degrés Celsius.Pour préparer l’appareil de vitrification de gouttelette en vrac, d’abord, couper le long d’un côté de la manche grise extérieure des aiguilles de mélange. Pliez la manche ouverte pour l’enlever de l’aiguille à mélanger. Ensuite, coupez l’aiguille de mélange à une longueur de 20 millimètres et insérez sa prise de coupure dans une aiguille d’injection de calibre 20.Glissez deux sections de tubes en silicium de 25 millimètres sur les entrées de l’aiguille de mélange. Et fixez leur position avec de la colle. Stériliser cet assemblage en autoclavant.Remplir un flacon stérile de Dewar d’azote liquide. Et stériliser l’extérieur avec de l’isopropanol avant de le placer dans une hotte stérile de culture laminer flow-cell. Assurez-vous de porter l’équipement de protection individuelle approprié car l’azote liquide peut causer de graves brûlures.Pour créer le dispositif de collecte des gouttelettes insérer un entonnoir avec le même diamètre extérieur que le diamètre intérieur de la Dewar, dans un tube conique de 50 millilitres. À l’aide de gros forceps, appuyez lentement sur le dispositif de collecte des gouttelettes dans l’azote liquide dans sa position verticale finale. Assurez-vous que le tube conique repose en position verticale au fond de la Dewar.Et le niveau d’azote liquide est inférieur d’un centimètre au bord de l’entonnoir. Pour monter une pompe de seringue à une position verticale sur le mur du capot de culture cellulaire, attachez une corde des pieds de la pompe de seringue aux vis qui dépassent du mur de capot de culture cellulaire. Ensuite, placez l’azote liquide Dewar avec le dispositif de collecte des gouttelettes sous la pompe à seringues montée verticalement.Après avoir obtenu des hépatocytes de rat fraîchement isolés, comptez la concentration de stock par exclusion bleue de tri-casserole. Et transférer 40 millions d’hépatocytes viables dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger les hépatocytes à 50 fois G pendant cinq minutes sans pause.Aspirez le surnatant. Suspendre à nouveau les hépatocytes en 3,4 millilitres de solution V1. Et incuber sur la glace pendant trois minutes.Ajouter ensuite 150 microlitres de DMSO et 150 microlitres d’EG; mélanger doucement et incuber à nouveau sur la glace pendant trois minutes. Ajouter 150 microlitres de DMSO et 150 microlitres d’EG aux hépatocytes à nouveau et mélanger délicatement. Charger 3,5 millilitres de ce mélange dans une seringue de trois millilitres.Insérez la seringue avec des hépatocytes pré-incubés et la seringue avec solution V2 sur l’adaptateur de la pompe à seringues. Attachez deux adaptateurs femelles luer lock hose-barb aux seringues. Et faites glisser le tube de silicium de l’assemblage de l’aiguille de mélange sur les raccords de barbe.Placez tout cet assemblage dans la pompe à seringues. Trois minutes après la dernière édition de DMSO et EG aux hépatocytes, démarrez la pompe à deux millilitres par minute. Après que tous les hépatocytes ont été ajoutés à l’azote liquide arrêter la pompe.À l’aide d’une aiguille de calibre 20, percer 10 petits trous dans le couvercle d’un tube conique de 50 millilitres. Et envelopper l’extérieur du couvercle avec un film flexible, créant une valve qui permettra d’échapper à l’évaporation de l’azote liquide laissé sur. Pour recueillir les gouttelettes vitrifiées d’hépatocyte, retirez d’abord l’entonnoir du Dewar avec de l’azote liquide.Ensuite, avec de longues forceps, sortez le tube conique qui contient les gouttelettes de l’azote liquide, et versez lentement l’excès d’azote liquide du tube conique. Fermez le tube conique avec le couvercle perforé, puis placez directement le tube conique fermé avec des gouttelettes d’hépatocyte vitrifiées dans le Dewar avec de l’azote liquide. Enfin, transférer le tube conique de l’azote liquide dans un cryotank d’azote liquide.Après avoir fait la solution de réchauffage avec le saccharose et les supports de culture d’hépatocytes DMEM, utilisez un filtre de 0,22 micromètre pour le filtrer stérilement. Ensuite, réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Pour réchaheurer les hépatocytes enlever le tube conique avec des hépatocytes vitrifiés du cryotank et le transporter dans un dewar d’azote liquide à la hotte de sous-culture.Relâchez légèrement le bouchon et placez le tube conique dans l’azote liquide. En travaillant rapidement, ajoutez toutes les gouttelettes vitrifiées d’hépatocyte à un bécher vide, puis ajoutez rapidement 100 millilitres de solution de réchauffage chaud de 37 degrés Celsius tout en remuant pendant 10 secondes. Lorsque les gouttelettes sont retirées de l’azote liquide intra-est congélation se produit en quelques secondes si les gouttelettes ne sont pas rapidement réchaurées.Par conséquent, il est essentiel d’ajouter directement le média réchaurant aux gouttelettes tout en remuant. Divisez la solution de réchamation avec des hépatocytes en deux tubes coniques de 50 millilitres. Centrifuger les tubes pendant deux minutes à 100 fois G à quatre degrés Celsius sans pause.Aspirez les supernatants à laisser un volume total de 12,5 millilitres en utilisant la marque de graduation du tube comme référence. Pour diluer la solution de réchauration à 50%, ajoutez 12,5 millilitres de DMEM glacé par tube conique. Suspendre et incuber sur la glace pendant trois minutes.Pour diluer la solution de réchauration à 25%, ajoutez 25 millilitres de DMEM glacé par tube conique. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes à 50 fois G à quatre degrés Celsius sans pause, aspirer le supernatant et suspendre à nouveau les hépatocytes en deux millilitres du milieu de culture désiré. Lorsqu’elle est mesurée par des tests d’exclusion bleu tri-pan, qui détermine l’intégrité de la membrane, la vitrification des gouttelettes en vrac a entraîné une viabilité directe des hépatocytes post-préservation de 79 %, ce qui était significativement plus élevé que la viabilité de 68 % après cryopréservation optimisée classique.Le rendement de la vitrification des gouttelettes en vrac était de 56 %, ce qui était 10 % plus élevé et plus constant que la cryopréservation classique. Utilisant l’essai de métabolisation de presto-colle dans les cultures à long terme d’université et de sandwich, l’activité métabolique aux hépatocytes a été mesurée pour être sensiblement plus élevée après vitrification de gouttelette en vrac puis après cryopreservation classique. La synthèse d’albumine, comme paramètre le plus largement employé de la fonction synthétique des hépatocytes, était plus grande par presque deux fois après vitrification de gouttelette en vrac, puis après cryopreservation classique.La production d’urée a été utilisée pour mesurer la fonction de désintoxication des hépatocytes dans une culture d’une semaine. Chez les hépatocytes vitrifiés de gouttelettes en vrac, la production d’urée était significativement plus élevée que celle des hépatocytes cryopréservés classiques. Pour obtenir des résultats cohérents après la vitrification des gouttelettes en vrac, il est important de suivre exactement le moment pendant la pré-incubation des APC et le réamaigrissement tel que décrit dans ce protocole.Après avoir réchauré les gouttelettes d’hépatocyte vitrifié, vous vous retrouverez avec une meilleure suspension de dimensionnement qui peut donc être utilisé de la même manière que si elles étaient fraîchement isolées. Comme méthode améliorée de conservation, la vitrification de gouttelette en vrac peut augmenter la disponibilité pri-ma pour la recherche et les applications cliniques.

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Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Morphométrique protocole pour l’évaluation Objective du comportement de blastocyste pendant la Vitrification et étapes de réchauffement de la planète

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospection de souches microbiennes pour le développement de bioremédiation et de probiotiques pour la recherche et la préservation des méta-organismes

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...