Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

מימון ממוסדות הבריאות הלאומיים של ארה ב (R01DK096075, R01DK107875, R01DK114506) ומשרד ההגנה של ארה ב (משרד הבטחון RTRP W81XWH-17-1-0680) מודה מאוד.

החרופציט העיקרי עבור פרוטוקול זה בוצעו על-ידי ליבת משאבי התא (CRC) בבית החולים הכללי של מסצ, בוסטון, מסצ, ארה ב. פרוטוקול החיות (#2011N000111) אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ.
1. droplet גורפת ויטריפיקציה
<ol><li>הכינו את הפתרונות הויטריפיקציה...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

הקפאת ההזמנה של hepatocytes על ידי הקפאה איטית תוצאות הכדאיות מופחתת פונקציה מטבולית. ויטריפיקציה מציעה חלופה מבטיחה לקריוגנית קלאסית, כאשר הפציעה הקפואה נמנעת לחלוטין9. עם זאת, טרום דגירה עם CPAs נדרש כדי להקטין את קצב הקירור הקריטי8. כתוצאה מכך, הויטריפיקציה מהרעילות ש...

הפסד של הכדאיות התאית ותפקוד מטבולית לאחר קריוגנית של hepatocytes עדיין בעיה מרכזית המגבילה יישומים קליניים1,2,3. שיטת בחינת הסדר של ההיפציט הקריוגנית היא איטית-הקפאה, אשר מבוצעת על ידי הפרה מראש של hepatocyte עם CPA (diמתיל סולפוקסיד [dmso], גלוקוז, ו-אלבומין, הקפאת קצב מבוקרת (בקירוב 1 ° c/min) כדי ל טמפרטורות קריוגניים4,5. למרות מיטובי הדיווחים רבים, הרעלת רואי חשבון ביחד עם חוסר איזון אוסמוטי מזיק במהלך הקפאת הלחץ מכני של היווצרות קרח להישאר החסרונות הבסיסיים של קיפאון איטי6,7.
ויטריפיקציה מציע יתרון על הקפאה איטית בפציעה זו בשל היווצרות קרח הוא נמנע לחלוטין על ידי מעבר שלב ישיר של מים למצב זכוכית6. עם זאת, כדי להגיע לטמפרטורת המעבר זכוכית של מים טהורים (-137 ° c), המים חייבים להיות מקורר במחירים בסדר של 1,000,000 מעלות צלזיוס לשנייה (כלומר, שיעור צינון קריטי) כדי למנוע היווצרות קרח מעל טמפרטורת המעבר זכוכית8 . תוספת של CPAs יכול להקטין את שיעור הקירור הקריטי ולהגדיל את טמפרטורת המעבר זכוכית של פתרונות מימית9. עם זאת, גם עם ריכוזי CPA גבוהה (למשל, 40% v/v dmso או גבוה יותר) שיעורי צינון מהיר בכל זאתנדרשים עבור ויטריפיקציהמוצלחת 8,9.
תעריפי הצינון הנדרשים וריכוזי רואי חשבון גבוהים גורמים לשני החסרונות העיקריים של ויטריפיקציה. ראשית, כדי לאפשר קירור מהיר, הדגימות חייב להיות מסה תרמית נמוכה. שנית, כדי להגיע לריכוזי רואי חשבון גבוהים תוך הימנעות מפציעה אוסמוטי, CPAs חייב להיות לאט הציג ומוקצב מלא בין התאים הפנים והחילוץ6. זה מגביר את זמן החשיפה של תאים CPAs רעילים. יחד, הדבר גורם לויטריפיקציה תהליך מסורבל המוגבל למספר דוגמאות קטנות (מיקרוליטר) בכל פעם. מויטריפיקציה Droplet הוצע כפתרון פוטנציאלי להגבלות אלה. על-ידי חשיפת מזערית התאים טיפות (nanoliters) כדי חנקן נוזלי שיעור הקירור הוא גדל באופן משמעותי, אשר כתוצאה מכך מאפשר הפחתה ניכרת בריכוז רואי החשבון10,11,12 ,13,14. למרות שניתן להשתמש בו זמנית במספר רב של החרירים בתדר גבוה, גודל ה-droplet הקטן ביותר מגביל את התפוקה למיקרו-ליטר לדקה10, המונע הויטריפיקציה יעילה של תא גדול אמצעי אחסון עם קצבי עיבוד גניטודות גבוהים יותר לפי סדר מיליליטר לדקה.
לאחרונה הוכח כי אלה מגבלות הטבועה של ויטריפיקציה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה15בצובר. זו שיטה הרומן ממנף התייבשות אוסמוטי מהירה כדי לרכז את הריכוז של רואי חשבון תאיים של 7.5% v/v אתילן גליקול ו DMSO מיד לפני ויטריפיקציה, ביטול הצורך של היכולת המלאה של ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות תאית מבוצעת במכשיר פלואידיג באמצעות חשיפה קצרה של hepatocytes לריכוז הרואי חשבון גבוהה. למרות חשיפה זו גורמת התייבשות אוסמוטי מהירה, זה קצר מדי עבור ריכוז CPA גבוה כדי לפזר לתוך התאים. מיד לאחר התייבשות, התאים נטענים טיפות כי הם באופן ישיר בחנקן נוזלי. שיטה זו מבטלת את הצורך של ספיגת מלאה תאיים של ריכוזי CPA גבוהים בעוד ריכוז רואי חשבון גבוהה מאפשר ויטריפיקציה של טיפות בגודל גדול, וכתוצאה מכך נפח תפוקה גבוהה עם רעילות CPA מינימלית.
מויטריפיקציה Droplet משפרת את הכדאיות הישירה והארוכת-טווח לאחר שימור, כמו גם מורפולוגיה ותפקוד מטבולי של החולדה הראשית לעומת הקריוגנית קלאסית בהקפאה איטית15. כתב יד זה מספק את הפרטים מתודולוגיים עבור droplet גורפת ויטריפיקציה של החולדה הראשית העכבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

ויטריפיקציה היא חלופה מבטיחה ללא קרח להקפאה קלאסית (בקירוב 1 ° c/דקות) הקפאה של דגימות ביולוגיות. ויטריפיקציה דורש שיעורי צינון מהיר במיוחד כדי להשיג מעבר של מים לשלב הזכוכית תוך הימנעות היווצרות קרח מזיק. למרות שטרום הדגירה עם סוכנים ביולוגיים (CPA) יכול להפחית את שיעור הצינון הקריטי של דגימות ביולוגיות, ריכוזים גבוהים בדרך כלל נדרשים כדי לאפשר הקפאת קרח חינם על ידי ויטריפיקציה. כתוצאה מכך, ויטריפיקציה מושפע מרעילות CPA ומוגבלת לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. לאחרונה הפגינו כי אלה מגבלות הטבועה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה בצובר. באמצעות שיטה זו הרומן, התאים הם הראשונים לקדם מחדש עם ריכוז הרואה חשבון נמוך תאיים. מינוף התייבשות אוסמוטי מהירה, ה-CPA תאיים מרוכז ישירות לקראת ויטריפיקציה, ללא צורך באופן מלא ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות הסלולר מבוצעת במכשיר פלואידיג ומשולב עם הדור תפוקה גבוהה רציפה של טיפות בגודל גדול כי הם התמסדים בחנקן נוזלי. שיטת הקפאת הקרח ללא הקפאה עם רעילות CPA מינימלית מתאימה לכמויות התאים הגדולות והתוצאות בכדאיות המוגברת של המעי האטי ובתפקוד המטבולית לעומת הקריוגנית איטית ומקפיאה. כתב יד זה מתאר את השיטות עבור droplet בצובר מוצלחת ויטריפיקציה בפירוט.

בידוד הראשי הראשוני מבודדים מחמישה כבדי חולדה שונים שימשו להשוואת השוואה ישירה של droplet בצובר ויטריפיקציה כדי הקפאה קלאסית באמצעות פרוטוקולי ההקפאה הראשונה שדווחו בספרות4, 5. בקיצור, hepatocytes הושעו ב UW שיושלם עם BSA (2.2 mg/mL), גלוקוז (333 mM), ו DMSO (10% v/v) קפוא באמצעות מקפ...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

כתב יד זה מתאר שיטת הקפאה נטולת קרח עבור כמויות גדולות של החולדות החצציטים לפיה התאים הראשוניים הם טרום מודבטים עם סוכנים הקפאה בריכוז נמוך והוא מוקשה בטיפות גדולות.

בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrification מטופל בדרך כלל על ידי רעילות של סוכני cryoprotective. והוכנס מחדש לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. פרוטוקול זה מאפשר ויטרציה של כמויות תאים גדולות תוך שימוש בריכוז ת"א נמוך במהלך הדגירה מראש.באמצעות התייבשות אוסמוטית מהירה, רו"ח בין מרתפים נמוך מרוכז בהתקן הנוזלים ישירות לפני vitrification. זה מבטל את הצורך של שקיבוע מלא ריכוזי רו"ח רעילים. סגול טיפה בתפזורת עשוי לספק hepatocytes קיימא ופעילים מטבולית לשימוש השתלת hepatocytes והתקני כבד ביו מלאכותי אשר שלנו כרגע הפריע על ידי תוצאות לקויות לאחר cryopreservation.שיטה זו עשויה להיות מותאמת vitrification של סוגי תאים אחרים כי צריך להיות cryo נשמר בכמויות גדולות;כגון מוצרי דם או תאי גזע בין היתר. כדי להתחיל, להפוך את פתרון vitrification 1 על ידי הוספת 40 מיליגרם של BSA ל 17.0 מיליליטר של פתרון אוניברסיטת ויסקונסין. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.הפוך את פתרון vitrification 2 כמתואר בפרוטוקול. וסטרילי לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. לטעון 3.5 מיליליטר של פתרון V2 מסונן סטרילי במזרק שלושה מיליליטר ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.כדי להכין את מנגנון vitrification טיפה בתפזורת, הראשון, לחתוך לאורך צד אחד של המחטים ערבוב שרוול אפור החיצוני. לכופף את השרוול פתוח כדי להסיר אותו מן המחט ערבוב. לאחר מכן, לחתוך את המחט ערבוב לאורך של 20 מילימטרים ולהכניס את שקע החיתוך שלה לתוך מחט הזרקת מד 20.החלק שני מקטעי צינורות סיליקון 25 מילימטר מעל הבקתות של מחט הערבוב. ולהבטיח את עמדתם עם דבק. סטריליזציה של הרכבה זו על-ידי הפעלה אוטומטית.ממלאים בקבוק דיואר סטרילי בחנקן נוזלי. ולעקר את החוץ עם isopropanol לפני הצבתו במכסה המנוע סטרילי לתרבות תא זרימה למינר. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כמו חנקן נוזלי יכול לגרום לכוויות חמורות.כדי ליצור את התקן איסוף טיפה להכניס משפך עם קוטר חיצוני זהה לקוטר הפנימי של דיואר, לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. באמצעות מטחות גדולות, לחץ לאט על התקן איסוף טיפות למטה בחנקן הנוזלי במצבו האנכי הסופי. ודא כי הצינור חרוט נשען במיקום אנכי בחלק התחתון של דיואר.ומפלס החנקן הנוזלי נמוך בסנטימטר אחד מקצה המשפך. כדי להרכיב משאבת מזרק במיקום אנכי על הקיר של מכסה המנוע של תרבות התא, לקשור חוט מכפות הרגליים של משאבת המזרק לברגים בולטים מקיר מכסה המנוע של תרבות התא. לאחר מכן, מניחים את החנקן הנוזלי Dewar עם מכשיר איסוף טיפות מתחת למשאבת המזרק המותקנת אנכית.לאחר קבלת hepatocytes עכברוש מבודד טרי, לספור את ריכוז המניות על ידי הדרה כחולה תלת פאן. ולהעביר 40 מיליון hepatocytes קיימא לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה hepatocytes ב 50 פעמים G במשך חמש דקות ללא הפסקה.שאף את העל-טבעי. להשעות מחדש את hepatocytes ב 3.4 מיליליטר של פתרון V1. ותידגר על קרח במשך שלוש דקות.לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG;ערבבו בעדינות ודגירה על הקרח שוב במשך שלוש דקות. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG להפטוציטים שוב והתערבבו בעדינות. לטעון 3.5 מיליליטר של תערובת זו במזרק שלושה מיליליטר.הכנס את המזרק עם hepatocytes דגירה מראש ואת המזרק עם פתרון V2 על מתאם משאבת המזרק. חבר שני מתאמי צינור-ברב לולר לוק נקבה למזרקים. ולהחליק את צינורות הסיליקון של מכלול מחט הערבוב מעל אביזרי העקיצה.שים את כל ההרכבה הזאת במשאבת המזרק. שלוש דקות לאחר המהדורה האחרונה של DMSO ו- EG להפטוציטים, התחל את המשאבה בשני מיליליטר לדקה. אחרי כל hepatocytes נוספו חנקן נוזלי לעצור את המשאבה.באמצעות מחט 20 מד, לנקב 10 חורים קטנים במכסה של צינור חרוט 50 מיליליטר. ולעטוף את החלק החיצוני של המכסה עם סרט גמיש, יצירת שסתום שיאפשר את הבריחה של אידוי חנקן נוזלי שמאלי. כדי לאסוף את טיפות hepatocyte vitrified, תחילה להסיר את המשפך מן דיואר עם חנקן נוזלי.לאחר מכן, עם מטחנות ארוכות, להוציא את הצינור חרוט המכיל את טיפות מן החנקן הנוזלי, ולאט לאט לשפוך את החנקן הנוזלי עודף מן הצינור חרוט. סגור את הצינור החרוטי עם המכסה המנוקב ולאחר מכן למקם ישירות את הצינור חרוט סגור עם טיפות hepatocyte סגול בחזרה Dewar עם חנקן נוזלי. לבסוף, להעביר את הצינור חרוט מן החנקן הנוזלי לתוך cryotank חנקן נוזלי.לאחר יצירת פתרון המלחמה מחדש עם מדיה תרבות סוכרוז ו- DMEM hepatocyte, השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן אותו סטרילי. ואז לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס. כדי לחזור hepatocytes להסיר את הצינור חרוט עם hepatocytes vitrified מן cryotank ולהעביר אותו חנקן נוזלי Dewar למכסה המנוע תת תרבות.משחררים קלות את הכובע ומ מניחים את הצינור הקדום בחזרה בחנקן הנוזלי. עובדים במהירות, מוסיפים את כל טיפות hepatocyte סגולים לתוך מקור ריק, ולאחר מכן להוסיף במהירות 100 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס חם חיסון פתרון תוך ערבוב במשך 10 שניות. כאשר טיפות מוסרים הקפאה תוך-est חנקן נוזלי מתרחשת בתוך שניות אם טיפות לא מחדש במהירות.לכן, זה קריטי להוסיף ישירות את התקשורת המלחמה מחדש טיפות תוך ערבוב. חלק את פתרון המלחמה מחדש עם hepatocytes לשני צינורות חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות במשך שתי דקות ב 100 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.שאף את העל-טבעיים להשאיר נפח כולל של 12.5 מיליליטר באמצעות סימן סיום הלימודים של הצינור כהפניה. כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל 50%להוסיף 12.5 מיליליטר של קרח קר DMEM לכל צינור חרוט. להשעות מחדש ותידגר על קרח למשך שלוש דקות.כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל-25%להוסיף 25 מיליליטר של DMEM קר כקרח לכל צינור חרוט. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 50 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה, שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את ההפטוציטים בשני מיליליטר של מדיום התרבות הרצוי. כאשר נמדד על ידי בדיקות אי הכללה כחולות תלת פאן, אשר קובע שלמות הממברנה, סגולות טיפה בתפזורת הביא הכדאיות hepatocyte לאחר שימור ישיר של 79%זה היה גבוה באופן משמעותי מאשר 68%הכדאיות לאחר cryopreservation אופטימיזציה קלאסית.התשואה של ויטריפיקציה טיפה בתפזורת היה 56%אשר היה 10% גבוה יותר ועקבי יותר מאשר cryopreservation קלאסי. באמצעות מטבוליזם presto-דבק assay במכללה לטווח ארוך ותרבויות כריך, פעילות מטבולית ב hepatocytes נמדד להיות גבוה באופן משמעותי לאחר סגול טיפה בתפזורת אז לאחר cryopreservation קלאסי. סינתזת אלבומין, כמו הפרמטר הנפוץ ביותר של פונקציה סינתטית של hepatocytes, היה גדול כמעט פי שניים לאחר סגול טיפה בתפזורת, ולאחר מכן לאחר cryopreservation קלאסי.ייצור אוריאה שימש למדידת פונקציית ניקוי רעלים hepatocyte בתרבות שבוע אחד. ב hepatocytes טיפה בתפזורת סגולה, ייצור אוריאה היה גבוה משמעותית מזה ב hepatocytes cryopreserve קלאסי. לקבלת תוצאות עקביות לאחר vitrification טיפה בתפזורת חשוב בדיוק לעקוב אחר התזמון במהלך הדגירה מראש של רואי ה-IP ו לחנוך מחדש כמפורט בפרוטוקול זה.לאחר המלחמה מחדש טיפות hepatocyte סגול אתה תהיה בסופו של דבר עם השעיה גודל טוב יותר אשר ולכן ניתן להשתמש בכל אותן דרכים כאילו הם היו מבודדים טריים. כשיטה משופרת לשימור, סגול טיפה בתפזורת עשוי להגדיל את הזמינות pri-ma למחקר ויישומים קליניים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

פרוטוקול Morphometric להערכה אובייקטיבית של הבלסטוציסט התנהגות במהלך ויטריפיקציה והשלבים התחממות כדור הארץ

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

החיפוש אחר זנים מחיידקים לפיתוח בימתן ומוצרי פרוביוטיקה עבור המחקר והשימור של מטאפיאורגניזם

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...