Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
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米国国立衛生研究所(R01DK096075、R01DK107875、R01DK114506)および米国国防総省(DoD RTRP W81XWH-17-1-0680)からの資金提供は大いに認めされています。

このプロトコルの主要な肝細胞分離は、米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院の細胞資源コア(CRC)によって行われた。動物プロトコル(#2011N000111)は、マサチューセッツ総合病院の動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. バルク液滴ガラス化
<ol><li>ガラス化ソリューションを準備します。
	<ol>
<li>ウィスコンシン大学溶...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. 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凍結が遅い肝細胞の凍結保存は、生存率および代謝機能の低下をもたらす。凍結傷害は完全に避けられているので、ガラス化は、古典的な凍結保存のための有望な代替手段を提供しています9.しかしながら、CPAによる事前インキュベーションは、臨界冷却速度8を下げる必要がある。その結果、ガラス化はCPA毒性17によって妨げられ、少量?...

肝細胞の凍結保存後の細胞生存率および代謝機能の喪失は、臨床応用を制限する大きな問題であり、1、2、3である。肝細胞凍結保存のベンチマーク法は、CPA(ジメチルスルホキシド[DMSO]、グルコース、アルブミン)およびその後の制御速度凍結(約1°/分)を用いて肝細胞を事前にインキュベートすることによって行われる、ゆっくりと凍結する。極低温4,5.多くの報告された最適化にもかかわらず、氷形成の凍結および機械的ストレス中の有害な浸透性不均衡と共にCPA毒性は、低速凍結6、7の根本的な欠点のままである。
ガラス化は、氷形成による傷害がガラス状態6への水の直接相転移によって完全に回避されるという点で、凍結が遅いよりも優位性を提供する。しかし、純水のガラス転移温度(-137°C)に達するには、水が毎秒100万°C(すなわち、臨界冷却速度)の速度で冷却され、ガラス転移温度を超える氷の形成を避ける必要があります。.CPAを添加すると、臨界冷却速度を低下させ、水溶液9のガラス転移温度を上昇させることができる。しかし、CPA濃度が高い場合でも(例えば、40%v/v DMSO以上)高速冷却速度は、それにもかかわらず、ガラス化を成功させるために必要とされる8、9である。
必要な冷却速度と高いCPA濃度は、ガラス化の2つの主要な欠点をもたらす。まず、高速冷却を可能にするには、サンプルの熱質量が低い必要があります。第二に、浸透圧損傷を回避しながら高いCPA濃度に達するためには、CPAをゆっくりと導入し、細胞外コンパートメント6の間で完全に平衡化しなければならない。これにより、細胞の有毒なCPAへの暴露時間が増加します。この結果、ガラス化は、一度に少数の小さなサイズのサンプル(マイクロリットル)に限定される面倒なプロセスになります。液滴ガラス化は、これらの制限に対する潜在的な解決策として提案されている。微小細胞を含む液滴(ナノリットル)を液体窒素に曝露することにより、冷却速度が著しく増加し、その結果、CPA濃度10、11、12の大幅な低下が可能になる。、13、14.複数の高周波液滴発生ノズルを同時に使用する可能性がありますが、非常に小さな液滴サイズは、10分あたりのマイクロリットルにスループットを制限し、大きなセルの効率的なガラス化を妨げます。毎分ミリリットルの順序で処理速度が大きい容積。
近年、これらの固有のガラス化の限界はバルク液滴ガラス化15によって克服できることが実証された。この新しい方法は、急速な浸透圧脱水を利用して、ガラス化直前の7.5%v/v/vエチレングリコールおよびDMSOの細胞内CPA濃度を濃縮し、有毒CPA濃度の完全な平衡化の必要性を排除する。細胞脱水は、高い細胞外CPA濃度に肝細胞を短時間曝露することによって流体装置で行われる。この暴露は急速な浸透脱水を引き起こすが、高いCPA濃度が細胞に拡散するには短すぎる。脱水直後、細胞は液体窒素中で直接ガラス化された液滴にロードされる。この方法は、高い細胞外CPA濃度が大きなサイズの液滴のガラス化を可能にし、最小限のCPA毒性で高スループットボリュームをもたらす一方で、高いCPA濃度の完全な細胞内取り込みの必要性を排除します。
液滴ガラス化は、保存後の直接的および長期的な生存率を改善するだけでなく、遅凍結15による古典的凍結保存と比較して原発性ラット肝細胞の形態および代謝機能を改善する。この原稿は、原発性ラット肝細胞のバルク液滴ガラス化のための方法論的詳細を提供する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

ガラス化は、生物学的試料の古典的な低速凍結(約1°C/分)凍結のための有望な氷のない代替手段です。ガラス化は、有害な氷の形成を避けながら、ガラス相への水の移行を達成するために非常に高速な冷却速度を必要とします。凍結保護剤(CPA)によるプレインキュベーションは、生体試料の臨界冷却速度を低下させることができるが、ガラス化による氷のない凍結保存を可能にするためには、一般に高濃度が必要である。その結果、ガラス化はCPA毒性によって妨げられ、速く冷却することができる小さなサンプルに制限される。最近、これらの固有の制限はバルク液滴ガラス化によって克服できることが実証された。この新規な方法を用いて、細胞はまず低い細胞内CPA濃度でプレインキュベートされる。急速な浸透圧脱水を利用して、細胞内CPAは、完全に有毒なCPA濃度を平衡化する必要なしに、ガラス化の直接前に集中する。細胞脱水は流動装置で行われ、液体窒素中でガラス化される大きいサイズの液滴の連続的な高スループット生成と統合される。CPA毒性を最小限に抑えたこの氷のない凍結保存法は、大量の細胞に適しており、古典的な低速凍結凍結凍結保存と比較して肝細胞の生存率と代謝機能の増加をもたらす。この原稿は、バルク液滴ガラス化を成功させるための方法を詳細に説明する。

5つの異なるラット肝臓から単に単離された一次肝細胞は、文献4で報告された優れた低速凍結プロトコルを用いた古典的な凍結保存に対するバルク液滴ガラス化の直接比較に使用された。 要するに、肝細胞をBSA(2.2mg/mL)、グルコース(333mM)、およびDMSO(10%v/v)を補充したUWに懸濁し、制御レート冷凍庫を用いて凍結した。-196°で保存した後、試料を温水?...

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Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

この原稿は、一次細胞を低濃度で凍結保護剤で予インし、大きな液滴でガラス化するラット肝細胞を大量に採取する氷のない凍結保存法について説明する。

原発性肝細胞保存のためのバルク液滴ガラス化

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

ガラス化は、典型的には、凍結保護剤の毒性によって処理される。そして、速く冷却することができる小さなサンプルに再挿入。このプロトコルは、プレインキュベーション中に低CPA濃度を使用しながら、大量の細胞のガラス化を可能にします。急速な浸透性脱水を使用して、低セラーCPAは、ガラス化の真前に流体装置に集中する。これにより、有毒なCPA濃度を完全に平衡化する必要がなくなります。バルク液滴ガラス化は、凍結保存後の不十分な結果によって現在妨げとなっている肝細胞移植およびバイオ人工肝装置を使用するための生存可能かつ代謝的に活性な肝細胞を提供する可能性がある。この方法は、血液製剤や幹細胞など、大量に凍結保存する必要がある他の細胞タイプのガラス化に適応する可能性があります。まず、ウィスコンシン大学ソリューションの17.0ミリリットルにBSAの40ミリグラムを追加することにより、ガラス化ソリューション1を作ります。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して溶液を無菌でろ過し、摂氏4度で保存します。プロトコルに記載されているように、ガラス化ソリューション2を作成する。そして、無菌は0.22マイクロメートルのフィルターを通してそれをフィルターします。3ミリリットルのシリンジに3.5ミリリットルの無菌濾過V2溶液をロードし、摂氏4度で保管します。バルク液滴ガラス化装置を調製するために、まず、混合針の外側グレースリーブの片面に沿って切断する。袖を開けて、ミキシング針から取り除きます。その後、混合針を20ミリメートルの長さにカットし、そのカットオフ出口を20ゲージ注射針に挿入します。25ミリメートルシリコンチューブセクションを混合針の入口の上にスライドさせます。そして、接着剤で自分の位置を確保します。オートクレーブ処理により、このアセンブリを殺菌します。無菌のデュワーフラスコに液体窒素を充填します。そして、滅菌ラミナーフロー細胞培養フードに入れる前にイソプロパノールで外側を殺菌する。液体窒素は深刻な火傷を引き起こす可能性がありますので、適切な個人的な保護具を着用してください。液滴回収装置を作成するには、50ミリリットル円錐形のチューブに、デュワーの内径と同じ外径の漏斗を挿入します。大きな鉗子を使用して、液滴回収装置を最後の垂直位置の液体窒素でゆっくりと押し下げます。円錐形のチューブがデュワーの底部の垂直位置に置かっていることを確認します。そして、液体窒素レベルは漏斗の端よりも1センチメートル低いです。細胞培養フードの壁の垂直位置にシリンジポンプを取り付けるには、シリンジポンプの足から細胞培養フードの壁から突き出たネジにひもを結びます。次に、液体窒素デュワーを液滴回収装置とともに垂直に取り付けられたシリンジポンプの下に置きます。分離したばかりのラット肝細胞を得た後、トリパンブルー排除によりストック濃度をカウントする。そして、50ミリリットル円錐形のチューブに4000万の実行可能な肝細胞を移す。50回Gで肝細胞を5分間休憩せずに遠心分離する。上清を吸引する。V1溶液の3.4ミリリットルで肝細胞を再中断します。そして、3分間氷の上でインキュベートします。その後、150マイクロリットルのDMSOと150マイクロリットルのEGを加え、穏やかに混ぜて氷の上で3分間インキュベートします。再び肝細胞に150マイクロリットルのDMSOと150マイクロリットルのEGを加え、穏やかに混ぜます。この混合物の3.5ミリリットルを3ミリリットルのシリンジに入れます。事前インキュベート肝細胞とシリンジを挿入し、V2溶液を使用してシリンジをシリンジポンプアダプターに挿入します。2 つの女性ルアー ロック ホース バーブ アダプターを注射器に取り付けます。そして、バーブの付属品の上に混合針アセンブリのケイ素管をスライドさせます。このアセンブリ全体をシリンジポンプに入れ最後の版のDMSOとEGから肝細胞までの3分後、毎分2ミリリットルでポンプを始動する。すべての肝細胞が液体窒素に添加された後、ポンプを停止します。20ゲージ針を使用して、50ミリリットルの円錐管の蓋に10個の小さな穴を穿刺する。そして、柔軟なフィルムで蓋の外側を包み、残りの液体窒素を蒸発させる脱出を可能にするバルブを作成します。ガラス化肝細胞液滴を採取するには、まず液体窒素でデュワーから漏斗を取り除きます。次に、長い鉗子で、液体窒素から液滴を含む円錐管を取り出し、円錐管から余分な液体窒素をゆっくりと注ぎ出す。穿刺された蓋で円錐管を閉じ、ガラス化肝細胞液滴を含む閉じた円錐管を液体窒素でデュワーに戻します。最後に、円錐管を液体窒素から液体窒素の凍結槽に移します。ショ糖およびDMEM肝細胞培養培地で再温暖化液を作った後、0.22マイクロメートルのフィルターを使用して滅菌フィルターを使用する。その後、摂氏37度に温めます。肝細胞を再温するには、凍結タンクからガラス化肝細胞で円錐状のチューブを取り除き、液体窒素デュワーでサブカルチャーフードに輸送します。キャップを軽く緩め、円錐管を液体窒素に戻します。迅速に作業し、空のビーカーにすべてのガラス化肝細胞液滴を追加し、10秒間攪拌しながら37°Cの暖かい再温暖化溶液の100ミリリットルを迅速に追加します。液滴が液体窒素から除去されると、液滴が急速に再温されない場合、エスト内凍結が数秒以内に起こる。したがって、攪拌しながら液滴に再温暖化媒体を直接添加することが重要です。肝細胞で再温暖化液を2つの50ミリリットル円錐形チューブに分けます。チューブを100倍Gで2分間、4°Cで断気します。上清を吸引し、チューブの卒業マークを基準として12.5ミリリットルの総体積を残す。再温暖化液を50%に希釈するには、円錐管あたり12.5ミリリットルの氷冷DMEMを加える。氷の上で3分間再中断してインキュベートします。再温暖化溶液を25%に希釈するには、円錐管あたり25ミリリットルの氷冷DMEMを加える。50倍Gで5分間、4度のGで5分間、ブレークせずに、上清を吸引し、所望の培養培地の2ミリリットルで肝細胞を再懸濁する。膜の完全性を決定するトライパンブルー排除試験で測定した場合、バルク液滴ガラス化は直接保存後肝細胞生存率79%をもたらした。バルク液滴ガラス化の収率は56%であり、これは古典的な凍結保存よりも10%高く、より一貫していた。長期の大学およびサンドイッチ培養におけるプレスト・グルー代謝アッセイを用いて、肝細胞における代謝活性は、バルク液滴ガラス化後、古典的凍結保存後に有意に高くなるように測定された。アルブミン合成は、肝細胞の合成機能の最も広く使用されているパラメータとして、バルク液滴ガラス化後、そして古典的な凍結保存後にほぼ2倍大きかった。尿素生産は、1週間培養で肝細胞の解毒機能を測定するために使用された。バルク液滴のガラス化肝細胞では、尿素産生は古典的な凍結保存肝細胞のそれよりも有意に高かった。バルク液滴ガラス化後の一貫した結果を得るためには、CPAの事前インキュベーション中に正確にタイミングを追いかけ、このプロトコルで詳述されているように再温暖化することが重要です。ガラス化肝細胞液滴を再温暖化した後、あなたはそれゆえに、彼らが新鮮に単離されたかのようにすべての同じ方法で使用することができるより良いサイジングサスペンションで終わるでしょう。改善された保存方法として、バルク液滴ガラス化は、研究および臨床応用のための利用可能性pri-maを増加させる可能性がある。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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