Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875, og R01DK114506) og det amerikanske Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er sterkt anerkjent.

Den primære hepatocytter isolasjoner for denne protokollen ble utført av Cell Resource Core (CRC) ved Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Dyret protokollen (#2011N000111) ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Massachusetts General Hospital.
1. bulk dråpe vitrifikasjon
<ol><li>Klargjør vitrifikasjon løsninger.
	<ol>
<li>Tilsett 40 mg av storfe serum albumin (BSA) til 17,0 mL av University of Wisconsin løsning (UW...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Kryonisk bevaring av hepatocytter ved langsom frysing resulterer i redusert levedyktighet og metabolsk funksjon. Vitrifikasjon tilbyr et lovende alternativ for klassisk kryonisk bevaring, som frysing skade er helt unngått9. Men, pre-inkubasjons med CPAs er nødvendig for å senke den kritiske kjøle hastighet8. Følgelig blir vitrifikasjon hemmet av CPA-toksisitet17 og begrenset til små prøve volumer. I arbeidet med å overkomme disse begrensninge...

Tap av celle levedyktighet og metabolsk funksjon etter kryonisk bevaring av hepatocytter er fortsatt et stort problem som begrenser kliniske anvendelser1,2,3. Den benchmark metoden for hepatocytter kryonisk bevaring er langsom frysing, som er utført av pre-incubating hepatocytter med CPA (dimethyl sulfoxide [DMSO], glukose, og albumin) og påfølgende kontrollert hastighet frysing (ved ca 1 ° c/min) til kryogene temperaturer4,5. Til tross for mange rapporterte optimaliseringer, CPA toksisitet sammen med skadelig osmotisk ubalanser under frysing og mekanisk stress av isen formasjon fortsatt grunnleggende ulempene ved langsom frysing6,7.
Vitrifikasjon tilbyr en fordel over langsom frysing i at skaden på grunn av isdannelse er helt unngås ved en direkte faseovergang av vann i glass staten6. Men for å nå glasset overgangen temperatur på rent vann (-137 ° c), må vannet avkjøles ved hastigheter i den rekkefølgen av 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. kritisk kjøle hastighet) for å unngå isdannelse over glasset overgangen temperatur8 . Tilsetting av CPAs kan senke den kritiske kjøle hastigheten og øke glass overgangen temperatur på vandige løsninger9. Men selv med høye CPA konsentrasjoner (f. eks, 40% v/v DMSO eller høyere) rask kjøling priser er likevel nødvendig for vellykket vitrifikasjon8,9.
De nødvendige avkjølings ratene og høye CPA-konsentrasjonene resulterer i to store ulemper ved vitrifikasjon. Først, for å muliggjøre rask kjøling, må prøvene ha en lav termisk masse. For det andre, å nå høye CPA konsentrasjoner samtidig unngå osmotisk Kader, CPAs må langsomt innføres og fullt equilibrated mellom intra-og ekstracellulære rom6. Dette øker eksponeringstiden av celler til giftig CPAs. Sammen gjør dette vitrifikasjon en tungvint prosess som er begrenset til noen små store prøver (mikroliter) om gangen. Dråpe vitrifikasjon har blitt foreslått som en potensiell løsning på disse restriksjonene. Ved å utsette minimale celle-Laden dråper (nanoliters) til flytende nitrogen kjøle hastigheten er betydelig økt, noe som følgelig gir en betydelig reduksjon i CPA-konsentrasjonen 10,11,12 ,13,14. Selv om flere avanserte dyser for høyfrekvent dråpe generering potensielt kan brukes samtidig, begrenser den ekstremt lille dråpestørrelsen gjennomstrømningen til mikroliter per minutt10, noe som utelukker effektiv vitrifikasjon av stor celle volumer med magnitudes høyere prosesserings rater på rekkefølgen av milliliter per minutt.
Nylig ble det demonstrert at disse iboende begrensninger av vitrifikasjon kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon15. Denne romanen metoden utnytter rask osmotisk dehydrering å konsentrere en intracellulære CPA konsentrasjon av 7,5% v/v etylen glykol og DMSO umiddelbart foregående vitrifikasjon, eliminerer behovet for full likevekts av giftige CPA konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering utføres i en fluidic enhet ved en kort eksponering av hepatocytter til en høy ekstracellulære CPA-konsentrasjon. Selv om denne eksponeringen forårsaker rask osmotisk dehydrering, er det for kort for den høye CPA-konsentrasjonen å spre inn i cellene. Umiddelbart etter dehydrering, er cellene lastet i dråper som er direkte vitrified i flytende nitrogen. Denne metoden eliminerer behovet for full intracellulære opptak av høye CPA-konsentrasjoner, mens den høye ekstracellulære-CPA-konsentrasjonen gjør det mulig å vitrifikasjon store størrelse dråper, noe som resulterer i høy gjennomstrømning volumer med minimal CPA toksisitet.
Dråpe vitrifikasjon forbedrer direkte og langsiktig levedyktighet etter bevaring, samt morfologi og metabolsk funksjon av primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk kryonisk bevaring ved langsom frysing15. Dette manuskriptet gir metodisk detaljer for bulk dråpe vitrifikasjon av primær rotte hepatocytter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Vitrifikasjon er et lovende isfritt alternativ for klassisk langsom frysing (ved ca. 1 ° c/min) kryonisk bevaring av biologiske prøver. Vitrifikasjon krever ekstremt raske kjølehastigheter for å oppnå overgangen av vann inn i glass fasen og samtidig unngå skadelig isdannelse. Selv om pre-inkubasjons med cryoprotective agenter (CPA) kan redusere den kritiske kjøle hastigheten av biologiske prøver, høye konsentrasjoner er vanligvis nødvendig for å aktivere isfri kryonisk bevaring ved vitrifikasjon. Som et resultat, vitrifikasjon er hemmet av CPA toksisitet og begrenset til små prøver som kan kjøles raskt. Det ble nylig demonstrert at disse iboende begrensningene kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon. Ved hjelp av denne romanen metoden, celler er første pre-inkubert med en lav intracellulære CPA konsentrasjon. Ved å utnytte hurtig osmotisk dehydrering, er intracellulære-CPA konsentrert rett foran vitrifikasjon, uten å måtte fullt likevekt giftige CPA-konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering er utført i en fluidic enhet og integrert med kontinuerlig høy gjennomstrømning generasjon av store størrelser dråper som er vitrified i flytende nitrogen. Denne isen-fri kryonisk bevaring metoden med minimal CPA toksisitet er egnet for store celle mengder og resulterer i økt hepatocytter levedyktighet og metabolsk funksjon i forhold til klassisk langsom frysing kryonisk bevaring. Dette manuskriptet beskriver metodene for vellykket bulk dråpe vitrifikasjon i detalj.

Frisk isolere primære hepatocytter fra fem annerledes rotten lever var anvendt for en direkte sammenligningen av bulk dråpe vitrifikasjon å klassisk kryonisk bevaring benytter det fremragende langsom-fryser protokoller rapportere inne litteraturen4, 5. kort sagt, ble hepatocytter suspendert i UW supplert med BSA (2,2 mg/ml), glukose (333 mm), og DMSO (10% v/v) og frosset med en kontrollert hastighet fryser. Etter lagring ved-196 ° c, ble prøvene tint i et v...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Dette manuskriptet beskriver en isfri kryonisk bevaring metode for store mengder rotte hepatocytter der primære celler er pre-inkubert med cryoprotective agenter på en lav konsentrasjon og vitrified i store dråper.

Bulk dråpe vitrifikasjon for primær hepatocytter bevaring

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrifisering håndteres vanligvis av toksisitet av kryobeskyttende midler. Og satt inn igjen til små prøver som kan avkjøles raskt. Denne protokollen muliggjør vitrifisering av store cellemengder mens du bruker en lav CPA-konsentrasjon under forhåndsinkubasjon.Ved hjelp av rask osmotisk dehydrering er den lave interkjeller-CPA konsentrert i væskeenheten rett før vitrifisering. Dette eliminerer behovet for fullt likevektssysiske CPA-konsentrasjoner. Bulk dråpe vitrification kan gi levedyktige og metabolsk aktive hepatocytter for bruk av hepatocytter transplantasjon og bio-kunstige lever enheter som vår for tiden hindret av utilstrekkelige resultater etter kryopreservation.Denne metoden kan potensielt tilpasses for vitrifisering av andre celletyper som må kryo-bevares i store mengder;som blodprodukter eller stamceller blant andre. For å begynne, gjør vitrification Solution 1 ved å legge til 40 milligram BSA til 17,0 milliliter ved University of Wisconsin Solution. Bruk et 0,22 mikrometerfilter for å sterilisere løsningen og oppbevares ved fire grader Celsius.Lag vitrification Solution 2 som beskrevet i protokollen. Og sterilt filter det gjennom et 0,22 mikrometerfilter. Legg 3,5 milliliter sterilt filtrert V2-oppløsning i en tre milliliter sprøyte og oppbevar ved fire grader Celsius.For å forberede bulkdråpefitrifiseringsapparatet, kutt først langs den ene siden av blandenålene ytre grå hylse. Bøy ermet åpent for å fjerne den fra blandenålen. Deretter kutter du blandenålen til en lengde på 20 millimeter og setter avskjæringsuttaket inn i en 20-gauge injeksjonsnål.Skyv to 25 millimeter silisiumrørseksjoner over viker på blandenålen. Og sikre sin posisjon med lim. Steriliser denne forsamlingen ved autoklav.Fyll en steril Dewar kolbe med flytende nitrogen. Og steriliser utsiden med isopropanol før du plasserer den i en steril Laminer flow-cell kultur hette. Pass på å bruke egnet personlig verneutstyr som flytende nitrogen kan forårsake alvorlige brannskader.For å lage dråpeoppsamlingsenheten, sett inn en trakt med samme ytre diameter som dewarens indre diameter, inn i et konisk rør på 50 milliliter. Bruk store tang, trykk langsomt dråpeoppsamlingsenheten ned i flytende nitrogen i sin endelige vertikale posisjon. Pass på at det koniske røret hviler i vertikal posisjon nederst i Dewar.Og det flytende nitrogennivået er en centimeter lavere enn kanten av trakten. For å montere en sprøytepumpe i vertikal posisjon på veggen av cellekulturhetten, bind en streng fra sprøytepumpens føtter til skruer som stikker ut fra cellekulturhetten veggen. Plasser deretter flytende nitrogen Dewar med dråpeoppsamlingsenheten under den vertikalt monterte sprøytepumpen.Etter å ha fått nyisolerte rottehpatocytter, telle lagerkonsentrasjonen ved tri-pan blå utelukkelse. Og overføre 40 millioner levedyktige hepatocytter til et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger hepatocytter på 50 ganger G i fem minutter uten pause.Aspirer det overnaturante. Re-suspendere hepatocytter i 3,4 milliliter V1 løsning. Og inkuber på is i tre minutter.Deretter legger du til 150 mikroliter DMSO og 150 mikroliter EG; bland forsiktig og inkuber på is igjen i tre minutter. Tilsett 150 mikroliter DMSO og 150 mikroliter eg til hepatocytter igjen og bland forsiktig. Legg 3,5 milliliter av denne blandingen i en tre milliliter sprøyte.Sett sprøyten med ferdig inkuberte hepatocytter og sprøyten med V2 Solution på sprøytepumpeadapteren. Fest to kvinnelige Luer Lock slange-barb adaptere til sprøytene. Og skyv silisiumslangen på blandenåleenheten over barbbeslagene.Plasser hele enheten i sprøytepumpen. Tre minutter etter den siste utgaven av DMSO og EG til hepatocytter, start pumpen på to milliliter per minutt. Etter at alle hepatocytter er lagt til flytende nitrogen stoppe pumpen.Bruk en 20 gauge nål, punkter 10 små hull i lokket på en 50 milliliter konisk rør. Og pakk utsiden av lokket med en fleksibel film, og skaper en ventil som gjør det mulig å unnslippe fordampe overflødig flytende nitrogen. For å samle de vitrifiserte hepatocyttdråpene, fjern først trakten fra Dewar med flytende nitrogen.Deretter, med lange tang, ta ut det koniske røret som inneholder dråpene fra det flytende nitrogenet, og hell sakte ut overflødig flytende nitrogen fra det koniske røret. Lukk det koniske røret med det punkterte lokket og plasser deretter det lukkede koniske røret direkte med vitrifiserte hepatocyttdråper tilbake i Dewar med flytende nitrogen. Til slutt overfører du det koniske røret fra det flytende nitrogenet til en flytende nitrogen kryotank.Etter å ha laget oppvarmende løsning med sukrose og DMEM hepatocyte kulturmedier, bruk et 0,22 mikrometerfilter for å steril filtrere det. Varm den deretter til 37 grader Celsius. For å varme opp hepatocytter fjerne koniske rør med vitrified hepatocytter fra kryotanken og transportere den i en flytende nitrogen Dewar til subkultur hette.Løsne hetten lett og plasser det koniske røret tilbake i det flytende nitrogenet. Arbeide raskt, legge til alle vitrified hepatocyte dråper til et tomt beger, deretter raskt legge til 100 milliliter av 37 grader Celsius varm oppvarming løsning under omrøring i 10 sekunder. Når dråpene fjernes fra flytende nitrogen intra-est frysing oppstår i løpet av sekunder hvis dråpene ikke er raskt rewarmed.Derfor er det viktig å direkte legge til devarmende mediene til dråpene under omrøring. Del oppvarmende oppløsning med hepatocytter i to 50 milliliter koniske rør. Sentrifuger rørene i to minutter ved 100 ganger G ved fire grader Celsius uten pause.Aspirer supernativa å forlate et totalt volum på 12,5 milliliter ved hjelp av rørets konfirmasjonsmerke som referanse. For å fortynne varmeoppløsningen til 50% tilsett 12,5 milliliter iskald DMEM per konisk rør. Re-suspendere og inkubere på is i tre minutter.For å fortynne varmeoppløsningen til 25% tilsett 25 milliliter iskald DMEM per konisk rør. Etter sentrifugering i fem minutter ved 50 ganger G ved fire grader Celsius uten pause, aspirerer de overnaturante og re-suspendere hepatocytter i to milliliter av ønsket kultur medium. Målt ved tri-pan blå eksklusjon testing, som bestemmer membran integritet, bulk dråpe vitrification resulterte i en direkte post-bevaring hepatocyte levedyktighet på 79%Dette var betydelig høyere enn 68% levedyktighet etter klassisk optimalisert kryopreservation.Utbyttet av bulk dråpe vitrification var 56%Som var 10% høyere og mer konsekvent enn klassisk kryopreservation. Ved hjelp av presto-lim metabolisering analyse i langsiktige college og sandwich kulturer, metabolsk aktivitet på hepatocytter ble målt til å være betydelig høyere etter bulk dråpe vitrification deretter etter klassisk kryopreservation. Albuminsyntese, som den mest brukte parameteren for syntetisk funksjon av hepatocytter, var større med nesten to ganger etter bulk dråpe vitrifisering, deretter etter klassisk kryopreservation.Urea produksjon ble brukt til å måle hepatocyte avgiftning funksjon i en uke kultur. I bulk dråpe vitrified hepatocytes, urea produksjonen var betydelig høyere enn i klassiske kryopreserve hepatocytter. For konsistente resultater etter bulk dråpe vitrification er det viktig å nøyaktig følge timing under pre-inkubasjon av CPAer og rewarming som beskrevet i denne protokollen.Etter å ha rewarming vitrified hepatocyte dråper vil du ende opp med en bedre størrelse suspensjon som derfor kan brukes på alle samme måter som om de var nyisolert. Som en forbedret bevaring metode, bulk dråpe vitrification kan øke tilgjengeligheten pri-ma for forskning og kliniske anvendelser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens deteksjon metoder for microfluidic dråpe plattformer

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Sirkulasjons mikroRNA Kvantifisering Bruke DNA-bindende Dye kjemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikrofluid Flow Chamber Modell for platetransfusjon og Hemostase Måler blodplateavleiring og fibrindannelse i sanntid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En dråpe Microfluidic tilnærming og Microsphere PCR forsterkning for Single-strandet DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Morphometric protokollen for objektiv vurdering av blastocysten oppførsel under vitrifikasjon og oppvarming skritt

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobiell stammer for Bioremediering og probiotika utvikling for Metaorganism forskning og bevaring

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Høy gjennomstrømning gjær stamme fenotyping med dråpebasert RNA sekvensering

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær avklaring av CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjelp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...