Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения США (R01DK096075, R01DK107875 и R01DK114506) и Министерства обороны США (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) является весьма признанным.

Первичные изоляции гепатоцитов для этого протокола были выполнены Cell Resource Core (CRC) в Массачусетской больнице общего профиля, Бостон, штат Массачусетс, США. Протокол о животных (#2011N000111) был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Массачусетской боль?...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Криоконсервация гепатоцитов путем медленного замораживания приводит к снижению жизнеспособности и метаболической функции. Витрификация предлагает перспективную альтернативу классической криоконсервации, так как замораживания травмы полностью избежать9. Тем не менее, ...

Потеря жизнеспособности клеток и метаболической функции после криоконсервации гепатоцитов по-прежнему является серьезной проблемой, которая ограничивает клинические применения1,2,3. Эталонным методом криоконсервации гепатоцитов является медленное замораживание, которое осуществляется путем предварительного инкубации гепатоцитов cpA (диметилсульфид (DMSO), глюкозы и альбумина) и последующего контролируемого замораживания скорости (приблизительно при температуре 1 кВ/мин) до криогенные температуры4,5. Несмотря на многие сообщения об оптимизации, токсичность CPA вместе с вредными осмотическими дисбалансами во время замораживания и механическим напряжением образования льда остаются фундаментальными недостатками медленного замораживания6,7.
Vitrification предлагает преимущество над медленным замораживанием в том ушибе из-за образования льда вполне во избежание сразу переходом участка воды в положение стекла6. Однако, чтобы достичь температуры перехода стекла чистой воды (-137 градусов по Цельсию), вода должна охлаждаться со скоростью порядка одного миллиона градусов по Цельсию в секунду (т.е. критическая скорость охлаждения), чтобы избежать образования льда над температурой перехода стекла8 . Добавление CPA может снизить критическую скорость охлаждения и увеличить температуру перехода стекла aqueous решений9. Однако, даже при высокой концентрации CPA (например, 40% v/v DMSO или выше) быстрые скорости охлаждения, тем не менее, необходимы для успешного витрификации8,9.
Требуемые темпы охлаждения и высокая концентрация CPA приводят к двум основным недостаткам витрификации. Во-первых, для обеспечения быстрого охлаждения образцы должны иметь низкую тепловую массу. Во-вторых, для достижения высоких концентраций CPA, избегая при этом осмотических травм, CPAs должны быть медленно введены и полностью уравновешивать между внутри- и внеклеточными отсеками6. Это увеличивает время воздействия клеток на токсичные CPAs. Вместе это делает витрификацию громоздким процессом, который ограничивается несколькими небольшими образцами (микролитрами) за один раз. Витрификация droplet была предложена в качестве потенциального решения этих ограничений. Путем подвергать подвергать действию миниатюрные клетк-нагруженные капли (нанолитры) к жидкому азоту скорость охлаждения значительно увеличена, которая следовательно позволяет значительно уменьшение в концентрации CPA10,11,12 ,13,14. Хотя несколько высокочастотных капель генерирующих сопла потенциально могут быть использованы одновременно, очень небольшой размер капли ограничивает пропускную мощность до микролитров в минуту10, что исключает эффективное стеклоизацию больших клеток объемы с величинами более высокие темпы обработки на порядок миллилитров в минуту.
Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения витрификации могут быть преодолены с помощью объемной витрификации капель15. Этот новый метод использует быстрое осмотическое обезвоживание, чтобы сконцентрировать внутриклеточную концентрацию CPA 7,5% v/v этиленгликоль и DMSO непосредственно предшествующие витрификации, устраняя необходимость полного равновесия токсичных концентраций CPA. Клеточное обезвоживание осуществляется в жидком устройстве путем краткого воздействия гепатоцитов на высокую внеклеточное концентрацию CPA. Хотя это воздействие вызывает быстрое осмотическое обезвоживание, это слишком короткий для высокой концентрации CPA, чтобы диффундировать в клетки. Сразу после обезвоживания клетки загружаются в капли, которые непосредственно витрифицированы в жидком азоте. Этот метод устраняет необходимость полного внутриклеточного поглощения высоких концентраций CPA, в то время как высокая внеклеточное концентрация CPA позволяет витрификации крупных размеров капель, в результате чего высокие объемы пропускной способностью с минимальной токсичностью CPA.
Капля витрификация улучшает прямую и долгосрочную жизнеспособность после сохранения, а также морфологию и метаболическую функцию первичных крысиных гепатоцитов по сравнению с классической криоконсервацией путем медленного замораживания15. Данная рукопись содержит методологические детали для оплошной витрификации первичных крысиных гепатоцитов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Витрификация является перспективной безледной альтернативой классической медленной заморозке (приблизительно при температуре 1 кв/мин) криоконсервации биологических образцов. Витрификация требует чрезвычайно быстрых скоростей охлаждения для достижения перехода воды в стеклянную фазу, избегая при этом вредного образования льда. Хотя прединкубация криопротекторными средствами (CPA) может снизить критическую скорость охлаждения биологических образцов, высокие концентрации, как правило, необходимы для обеспечения свободного ото льда криоконсервации путем витрификации. В результате, витрификация затрудняется токсичностью CPA и ограничивается небольшими образцами, которые могут быть охлаждены быстро. Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения могут быть преодолены путем витрификации капель. Используя этот новый метод, клетки сначала предварительно инкубируются с низкой внутриклеточной концентрацией CPA. Используя быстрое осмотическое осмотическое обезвоживание, внутриклеточная CPA концентрируется непосредственно перед витрификации, без необходимости полностью уравновесить токсичные концентрации CPA. Обезвоживание клеток осуществляется в жидком устройстве и интегрируется с непрерывным высоким генерикцией больших размеров капель, которые витрифицированы в жидком азоте. Этот метод криоконсервации без оледочного льда с минимальной токсичностью CPA подходит для больших количеств клеток и приводит к повышению жизнеспособности гепатоцитов и метаболической функции по сравнению с классической медленной замораживанием криоконсервации. В данной рукописи подробно описаны методы успешного витрификации капель.

Свежеизолированные первичные гепатоциты из пяти различных крысиных печени были использованы для прямого сравнения витрификации капель к классической криоконсервации с использованием выдающихся протоколов медленного замораживания, о которых сообщается в литературе4,<su...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Данная рукопись описывает метод криоконсервации для больших количеств крысиных гепатоцитов, при котором первичные клетки предварительно инкубируются криопротекторными агентами при низкой концентрации и отрифицируются в крупных каплях.

Массовая витрификация капель для первичного сохранения гепатоцитов

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Витрификация, как правило, обрабатываются токсичности криопротекторных агентов. И вновь вставляется в небольшие образцы, которые можно быстро охлаждать. Этот протокол позволяет витрификации больших количеств клеток при использовании низкой концентрации CPA во время предварительной инкубации.Используя быстрое осмотическое обезвоживание, низкий межпо погреб CPA концентрируется в жидкости устройства непосредственно перед витрификации. Это устраняет необходимость полного уравночения токсичных концентраций CPA. Массовая витрификация капель может обеспечить жизнеспособные и метаболически активные гепатоциты для использования трансплантации гепатоцитов и био-искусственных устройств печени, которым в настоящее время препятствуют неадекватные результаты после криоконсервации.Этот метод потенциально может быть адаптирован для витрификации других типов клеток, которые должны быть крио-сохранены в больших количествах; таких как продукты крови или стволовые клетки среди других. Для начала сделайте витрификационое решение 1, добавив 40 миллиграммов BSA к 17,0 миллилитров решения Университета Висконсина. Используйте фильтр 0,22 микрометра для стерильного фильтра раствора и хранения при четырех градусах Цельсия.Сделать витрификации Решение 2, как описано в протоколе. И стерильный фильтр его через фильтр 0,22 микрометра. Загрузите 3,5 миллилитров стерильного фильтрованного раствора V2 в трехми миллилитровый шприц и храните при четырех градусах Цельсия.Для подготовки навалом капельки витрификации аппарата, во-первых, вырезать вдоль одной стороны смешивания иглы наружного серого рукава. Согните рукав открытым, чтобы удалить его из смешивания иглы. Затем вырежьте смешивание иглы до длины 20 миллиметров и вставьте его выход отсечения в 20 калибровочных иглы инъекций.Сдвиньте две 25-миллиметровые секции кремниевых труб над входами смешивания иглы. И закрет их положение клеем. Стерилизовать эту сборку путем автоклавинга.Заполните стерильную колбу Dewar жидким азотом. И стерилизовать снаружи с изопропанолом, прежде чем поместить его в стерильный Laminer поток-клеток культуры капот. Убедитесь в том, чтобы носить соответствующие средства индивидуальной защиты, как жидкий азот может вызвать серьезные ожоги.Для создания устройства сбора капель вставьте воронку с тем же внешним диаметром, что и внутренний диаметр Дьюара, в коническую трубку диаметром 50 миллилитров. Используя большие типсы, медленно нажимайте устройство сбора капель вниз в жидком азоте в его окончательном вертикальном положении. Убедитесь, что коническая трубка лежит в вертикальном положении в нижней части двойки.А уровень жидкого азота на один сантиметр ниже края воронки. Чтобы смонтировать шприц-насос в вертикальном положении на стене капота клеточной культуры, свяжите веревку с ног шприц-насоса до винтов, выступающих от стенки капота клеточной культуры. Затем поместите жидкий азот Dewar с устройством сбора капель под вертикально установленный шприц насос.После получения свежеисключенные гепатоциты крысы, подсчитайте концентрацию запасов три-пан синий исключение. И перенесите 40 миллионов жизнеспособных гепатоцитов в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга гепатоцитов в 50 раз G в течение пяти минут без перерыва.Аспирировать супернатанта. Повторно приостанавливать гепатоциты в 3,4 миллилитров V1 Solution. И инкубировать на льду в течение трех минут.Затем добавьте 150 микролитров DMSO и 150 микролитров EG;смешайте аккуратно и снова инкубировать на льду в течение трех минут. Добавьте 150 микролитров DMSO и 150 микролитров EG в гепатоциты снова и аккуратно перемешайте. Загрузите 3,5 миллилитров этой смеси в трехми миллилитровый шприц.Вставьте шприц с предварительно инкубированными гепатоцитами и шприц с раствором V2 на адаптер насоса шприца. Прикрепите к шприцам два женских шланга Luer Lock- barb. И сдвиньте кремниевые трубки смешивания иглы сборки над колючкой фитинги.Поместите всю эту сборку в шприц-насос. Через три минуты после последнего выпуска DMSO и EG к гепатоцитам, запустите насос в два миллилитров в минуту. Ведь гепатоциты были добавлены в жидкий азот остановить насос.Используя 20 калибровочных игл, прокол 10 небольших отверстий в крышке 50 миллилитров конической трубки. И оберните внешнюю часть крышки гибкой пленкой, создавая клапан, который позволит избежать испарения осталась за жидким азотом. Чтобы собрать витрифицированные капли гепатоцитов, сначала удалите воронку из двойки жидким азотом.Затем, с длинными типсами, вывихите коническую трубку, которая содержит капли из жидкого азота, и медленно вылейте избыток жидкого азота из конической трубки. Закройте коническую трубку проколотой крышкой, а затем непосредственно поместите закрытую коническую трубку с витифицированными каплями гепатоцитов обратно в Дьюар с жидким азотом. Наконец, перенесите коническую трубку из жидкого азота в жидкий азот криотанк.После внесения повторного раствора с сахарозой и DMEM гепатоцитов культуры средств массовой информации, использовать 0,22 микрометровый фильтр для стерильного фильтра его. Затем разогреть до 37 градусов по Цельсию. Чтобы напомнить гепатоциты удалить коническую трубку с витифицированными гепатоцитами из криотанка и транспортировать его в жидком азоте Dewar в субкультуру капот.Слегка ослабьте крышку и поместите коническую трубку обратно в жидкий азот. Работая быстро, добавьте все vitrified капли гепатоцитов в пустой стакан, а затем быстро добавить 100 миллилитров 37 градусов по Цельсию теплого раствора разогрева при перемешивании в течение 10 секунд. Когда капли удаляются из жидкого азота внутриэфирной замораживания происходит в течение нескольких секунд, если капли не быстро rewarmed.Поэтому крайне важно напрямую добавить в капли разовящиеся средства массовой информации, помешивая. Разделите раствор с гепатоцитами на две 50 миллилитровые конические трубки. Центрифуга труб в течение двух минут при 100 раз G при четырех градусах цельсия без перерыва.Аспирировать supernatants оставить общий объем 12,5 миллилитров, используя выпускной знак трубки в качестве эталона. Для разбавления раствора rewarming до 50%добавляют 12,5 миллилитров ледяного DMEM на коническую трубку. Повторно приостанавливать и инкубировать на льду в течение трех минут.Для разбавления повторного раствора до 25%добавляют 25 миллилитров ледяного DMEM на коническую трубку. После центрифугирования в течение пяти минут при 50 градусах G при четырех градусах Цельсия без перерыва, аспирировать супернатант и повторно приостановить гепатоциты в двух миллилитров желаемой среды культуры. При измерении три-пан синий тестирования исключения, который определяет целостность мембраны, навалом витрификации капель привело к прямой пост-сохранения гепатоцитов жизнеспособности 79%Это было значительно выше, чем 68%жизнеспособности после классической оптимизированной криоконсервации.Доходность витрификации сыпучих капель составила 56%, что на 10% выше и последовательнее классического криоконсервации. Использование престо-клей метаболизации анализ в долгосрочном колледже и сэндвич культур, метаболическая активность в гепатоцитов было измерено, чтобы быть значительно выше после витрификации навалом капель, то после классического криоконсервации. Синтез альбумин, как наиболее широко используемый параметр синтетической функции гепатоцитов, был больше почти в два раза после массовой витрификации капель, затем после классического криоконсервации.Производство мочевины использовалось для измерения функции детоксикации гепатоцитов в недельной культуре. В навалом капли vitrified гепатоцитов, производство мочевины было значительно выше, чем в классических криопресервных гепатоцитов. Для последовательных результатов после массовой витрификации капель важно точно следить за сроками во время предварительной инкубации CPAs и rewarming как подробно описано в этом протоколе.После повторного развооружения vitrified капли гепатоцитов вы в конечном итоге с лучшей подвеской размеров, которые поэтому могут быть использованы во всех же способов, как если бы они были недавно изолированы. В качестве улучшенного метода сохранения, витрификация навалом капель может увеличить доступность pri-ma для исследований и клинического применения.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Микрожидком Flow камера Модель тромбоцитами трансфузиологии и гемостаза меры тромбоцитов Отложение и фибрина Формирование в режиме реального времени

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Морфометрические протокол для объективной оценки бластоциста поведения во время стеклования и потепления шаги

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Поиск микробных штаммов для биовосстановления и развития пробиотиков для исследования и сохранения метаорганизмов

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Высокая пропускная способность Дрожжи Штамм Фенотипирование с капли на основе РНК секвенирования

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...