Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Finansiering från US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 och R01DK114506) och US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) är mycket erkänt.

De primära hepatocyteisolationerna för detta protokoll utfördes av cell Resource Core (CRC) vid Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Animal Protocol (#2011N000111) godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) i Massachusetts General Hospital.
1. förglasning av bulkdroppar
<ol><li>Förbered förglasnings lösningarna.
	<ol>
<li>Tillsätt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) till 17,0 mL av University of Wisconsin Soluti...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Kryopreservation av hepatocyter genom långsam frysning resulterar i minskad lönsamhet och metabolisk funktion. Vitrification erbjuder ett lovande alternativ för Classic cryopreservation, som frysning skada är helt undvikas9. Före inkubering med CPAs krävs dock för att sänka den kritiska kylningshastigheten8. Följaktligen hindras förglasning av CPA-toxicitet17 och begränsad till små provvolymer. I arbetet med att övervinna dessa begränsn...

Förlust av cellernas lönsamhet och metabolisk funktion efter kryopreservation av hepatocyter är fortfarande en viktig fråga som begränsar kliniska tillämpningar1,2,3. Benchmark-metoden för hepatocyte frysförvaring är långsam frysning, som utförs genom förinkuberande hepatocyterna med CPA (dimetylsulfoxid [DMSO], glukos och albumin) och efterföljande kontrollerad hastighet frysning (vid ca 1 ° c/min) till kryogena temperaturer4,5. Trots många rapporterade optimeringar, CPA toxicitet tillsammans med skadliga osmotiska obalanser under frysning och mekanisk stress av isbildning förbli grundläggande nackdelar med långsam frysning6,7.
Förglasning erbjuder en fördel över långsam frysning i att skada på grund av isbildning är helt undvikas genom en direkt fasövergång av vatten i glaset tillstånd6. Men för att nå glaset övergångstemperatur av rent vatten (-137 ° c), måste vattnet kylas med hastigheter i storleksordningen 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. den kritiska kylningen) för att undvika isbildning över glaset övergångstemperatur8 . Tillägg av CPAs kan sänka den kritiska kylningshastigheten och öka glas övergångstemperaturen för vattenlösningar9. Men även med höga CPA koncentrationer (t. ex. 40% v/v DMSO eller högre) snabb kylning är ändå krävs för framgångsrik förglasning8,9.
De erforderliga kylnings-och höga CPA-koncentrationerna leder till två stora nackdelar med förglasning. Först, för att möjliggöra snabb kylning, proverna måste ha en låg termisk massa. För det andra, för att nå höga CPA-koncentrationer samtidigt som man undviker osmotisk skada, måste CPAs långsamt införas och helt jämställas mellan de intra-och extracellulära fack6. Detta ökar exponeringstiden för celler till giftiga CPAs. Tillsammans gör detta förglasning en besvärlig process som är begränsad till några små stora prover (mikroliter) i taget. Förglasning av DROPP har föreslagits som en potentiell lösning på dessa restriktioner. Genom att exponera miniscule cell-Laden droppar (nanoliters) till flytande kväve kylningen är betydligt högre, vilket följaktligen möjliggör en avsevärd minskning av CPA koncentrationen10,11,12 ,13,14. Även om flera munstycken som genererar högfrekventa droppar potentiellt kan användas samtidigt, begränsar den extremt lilla droppstorleken dataflödet till mikroliter per minut10, vilket utesluter effektiv förglasning av stora cell volymer med magnitud högre bearbetningshastigheter i storleksordningen milliliter per minut.
Nyligen visades att dessa inneboende begränsningar av förglasning kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering15. Denna nya metod utnyttjar snabb osmotisk uttorkning för att koncentrera en intracellulär CPA koncentration av 7,5% v/v etylenglykol och DMSO omedelbart före förglasning, vilket eliminerar behovet av full jämvikt av giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet genom en kort exponering av hepatocyterna till en hög extracellulär CPA koncentration. Även om denna exponering orsakar snabb osmotisk uttorkning, det är för kort för den höga CPA koncentrationen att sprida sig in i cellerna. Omedelbart efter uttorkning, cellerna lastas i droppar som är direkt förglasad i flytande kväve. Denna metod eliminerar behovet av fullt intracellulärt upptag av höga CPA koncentrationer medan den höga extracellulära CPA koncentrationen möjliggör vitrifiering av stora stora droppar, vilket resulterar i hög genomströmning volymer med minimal CPA toxicitet.
DROPP vitrifiering förbättrar direkt och långsiktig lönsamhet efter konservering, samt morfologi och metabolisk funktion av primära råtta hepatocyter jämfört med klassisk kryopreservation av långsam frysning15. Detta manuskript ger metodologiska Detaljer för bulk dropp vitrifiering av primära råtta hepatocyter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Förglasning är ett lovande isfritt alternativ för klassisk långsam frysning (vid ca 1 ° c/min) kryopreservation av biologiska prover. Förglasning kräver extremt snabba kylningshastigheter för att uppnå en övergång av vatten till glas fasen och samtidigt undvika skadlig isbildning. Även om pre-inkubering med kryoprotektiva medel (CPA) kan minska den kritiska kylningen av biologiska prover, är höga koncentrationer i allmänhet behövs för att möjliggöra isfri kryopreservation genom förglasning. Som ett resultat hämmas vitrifiering av CPA toxicitet och begränsas till små prover som kan kylas snabbt. Det var nyligen visat att dessa inneboende begränsningar kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering. Med denna nya metod, celler är först förinkuberas med en låg intracellulär CPA koncentration. Hävstångseffekt snabb osmotisk uttorkning, den intracellulära CPA är koncentrerad direkt före förglasning, utan behov av att helt jämvikt giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet och integreras med kontinuerlig hög genomströmning generation av stora stora droppar som förglasat i flytande kväve. Denna ice-free frysförvaring metod med minimal CPA toxicitet är lämplig för stora cell mängder och resulterar i ökad hepatocyte lönsamhet och metabolisk funktion jämfört med klassisk långsam frysning frysförvaring. Detta manuskript beskriver metoderna för lyckad bulk dropp vitrifiering i detalj.

Nyligen isolerade primära hepatocyter från fem olika råtta lever användes för en direkt jämförelse av bulk dropp förglasning till klassiska frysförvaring med hjälp av de framstående långsam frysning protokoll som rapporteras i litteraturen4, 5. i korthet, de hepatocyter avbröts i UW kompletteras med BSA (2,2 mg/ml), glukos (333 mm), och DMSO (10% v/v) och frysta med hjälp av en kontrollerad hastighet frys. Efter förvaring vid-196 ° c upptinades p...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Detta manuskript beskriver en isfri cryopreservations metod för stora mängder råtta hepatocyter där primära celler är förinkuberas med kryoprotektiva medel vid en låg koncentration och förglasat i stora droppar.

Förglasning i bulk för primär Hepatocytekonservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Förglasning hanteras vanligtvis av toxicitet av kryoskyddande medel. Och åter införas till små prover som kan kylas snabbt. Detta protokoll möjliggör förglasning av stora cellmängder medan du använder en låg CPA-koncentration under preinkubation.Med hjälp av snabb osmotisk uttorkning är den låga inter-cellar CPA koncentrerad till vätskeanordningen direkt före förglasning. Detta eliminerar behovet av helt ekvillibrerade toxiska CPA-koncentrationer. Bulk droplet förglasning kan ge livskraftiga och metaboliskt aktiva hepatocyter för att använda hepatocyter transplantation och bio-konstgjorda lever enheter som våra för närvarande hindras av otillräckliga resultat efter cryopreservation.Denna metod kan potentiellt vara anpassad för förglasning av andra celltyper som behöver kryobevaras i stora mängder;såsom blodprodukter eller stamceller bland andra. Till att börja, göra förglasning Lösning 1 genom att lägga till 40 milligram BSA till 17,0 milliliter av University of Wisconsin Solution. Använd ett 0,22 mikrometerfilter för att sterilisera filtret lösningen och förvara vid fyra grader Celsius.Gör förglasning Lösning 2 som beskrivs i protokollet. Och sterila filtrera den genom en 0,22 mikrometer filter. Ladda 3,5 milliliter sterilfilterad V2-lösning i en tre milliliter spruta och förvara vid fyra grader Celsius.För att förbereda bulkdropp förglasning apparaten, först, skär längs ena sidan av blandning nålar yttre grå hylsa. Böj hylsan öppen för att ta bort den från blandningsnålen. Sedan skär blandningsnålen till en längd av 20 millimeter och sätt in dess cutoff utlopp i en 20 gauge injektion nål.Skjut två 25 millimeters kiselrör sektioner över inloppen av blandningsnålen. Och säkra deras position med lim. Sterilisera denna montering genom autoklavering.Fyll en steril Dewarkolv med flytande kväve. Och sterilisera utsidan med isopropanol innan du placerar den i en steril Laminer flöde-cell kultur huva. Se till att bära lämplig personlig skyddsutrustning eftersom flytande kväve kan orsaka allvarliga brännskador.För att skapa droplet samlingsanordningen infoga en tratt med samma yttre diameter som innerdiametern av Dewar, i en 50 milliliter koniska röret. Med hjälp av stora tång trycker du långsamt ner droppuppsamlingsanordningen i det flytande kvävet i sitt slutliga vertikala läge. Se till att det koniska röret vilar i vertikalt läge i botten av Dewar.Och den flytande kvävenivån är en centimeter lägre än kanten på tratten. För att montera en spruta pump på en vertikal position på väggen i cellen kultur huva, knyta en sträng från sprutan pumpens fötter till skruvar utskjutande från cellkultur huva väggen. Placera sedan det flytande kvävet Dewar med droppuppsamlingsanordningen under den vertikalt monterade sprutpumpen.Efter att ha erhållit nyligen isolerade råtthepatocyter, räkna beståndet koncentration genom tri-pan blå uteslutning. Och överföra 40 miljoner livskraftiga hepatocyter i ett koniskt rör på 50 milliliter. Centrifugera hepatocyterna vid 50 gånger G i fem minuter utan paus.Aspirera supernatanten. Åter upphäva hepatocyterna i 3,4 milliliter V1 Solution. Och ruvar på is i tre minuter.Tillsätt sedan 150 mikroliter av DMSO och 150 mikroliter AV EG;blanda försiktigt och inkubera på is igen i tre minuter. Tillsätt 150 mikroliter av DMSO och 150 mikroliter av EG till hepatocyterna igen och blanda försiktigt. Ladda 3,5 milliliter av denna blandning i en tre milliliter spruta.Sätt in sprutan med förinkuberade hepatocyter och sprutan med V2 Solution på sprutans pumpadapter. Fäst två Female Luer Lock slang-barb adaptrar till sprutorna. Och skjut silikonrör av blandning nålen montering över barb beslag.Placera hela denna montering i sprutan pumpen. Tre minuter efter den sista upplagan av DMSO och EG till hepatocyterna, starta pumpen på två milliliter per minut. Efter alla hepatocyter har tillsatts till den flytande kväve stoppa pumpen.Med hjälp av en 20 gauge nål, punktering 10 små hål i locket på en 50 milliliter koniska röret. Och linda utsidan av locket med en flexibel film, skapa en ventil som gör det möjligt att fly avdunstning överbkant flytande kväve. För att samla de förglasade hepatocytedropparna, ta först bort tratten från Dewar med flytande kväve.Därefter, med långa tångar, ta ut det koniska röret som innehåller dropparna från det flytande kvävet, och häll långsamt ut det överflödiga flytande kvävet från koniska röret. Stäng koniska röret med punkterat lock och placera sedan direkt det slutna koniska röret med förglasade hepatocytedroppar tillbaka i Dewar med flytande kväve. Slutligen, överföra koniska röret från den flytande kväve till en flytande kväve cryotank.Efter att ha gjort rewarming lösningen med sackaros och DMEM hepatocyte kultur media, använd en 0,22 mikrometer filter för att sterilisera filtrera den. Värm sedan den till 37 grader Celsius. För att rewarm hepatocyterna ta bort koniska röret med förglasade hepatocyter från kryotanken och transportera den i ett flytande kväve Dewar till subkultur huven.Lossa lätt på locket och placera tillbaka det koniska röret i det flytande kvävet. Arbeta snabbt, tillsätt alla förglasade hepatocyte droppar till en tom bägare, sedan snabbt lägga till 100 milliliter av 37 grader Celsius varm rewarming lösning under omrörning i 10 sekunder. När dropparna avlägsnas från flytande kväve intra-est frysning sker inom några sekunder om dropparna inte snabbt rewarmed.Därför är det avgörande att direkt lägga till rewarming media till dropparna under omrörning. Dela upp rewarming-lösningen med hepatocyter i två 50 milliliter koniska rör. Centrifugera rören i två minuter vid 100 gånger G vid fyra grader Celsius utan paus.Aspirera supernatanterna att lämna en total volym på 12,5 milliliter med hjälp av rörets graderingsmärke som referens. För att späda den rewarming lösningen till 50%lägga till 12,5 milliliter iskall DMEM per koniskt rör. Häng igen och inkubera på is i tre minuter.För att späda rewarming lösningen till 25%lägga till 25 milliliter iskall DMEM per koniskt rör. Efter centrifugering i fem minuter vid 50 gånger G vid fyra grader Celsius utan paus, aspirera supernatanten och åter upphäva hepatocyterna i två milliliter av det önskade odlingsmediet. När det mäts genom tri-pan blå uteslutning testning, som bestämmer membran integritet, bulk droppen förglasning resulterade i en direkt efter bevarande hepatocyt livskraft på 79%Detta var betydligt högre än de 68%livskraft efter klassiska optimerad cryopreservation.Avkastningen av bulk droppen förglasning var 56%Vilket var 10%högre och mer konsekvent än klassisk cryopreservation. Använda presto-lim metabolisering assay i långsiktiga college och sandwich kulturer, metabolisk aktivitet vid hepatocyterna mättes för att vara betydligt högre efter bulk droplet förglasning sedan efter klassisk cryopreservation. Albumin syntes, som den mest använda parametern av syntetisk funktion av hepatocyter, var större med nästan tvåfaldigt efter bulk droplet förglasning, sedan efter klassisk cryopreservation.Urea produktion användes för att mäta hepatocyte avgiftning funktion i en vecka kultur. I bulkdropp förglasade hepatocyter var ureaproduktionen betydligt högre än i klassiska cryopreserve hepatocyter. För konsekvent resultat efter bulk droplet förglasning är det viktigt att exakt följa timing under pre-inkubation av CPAs och rewarming som beskrivs i detta protokoll.Efter rewarming den förglasade hepatocyte droppar du kommer att sluta med en bättre dimensionering suspension som därför kan användas på alla samma sätt som om de var nyligen isolerade. Som en förbättrad bevarande metod, bulk droplet förglasning kan öka tillgängligheten pri-ma för forskning och kliniska tillämpningar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens detektionsmetoder för mikroflödessystem droppe plattformar

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Cirkulerande MicroRNA Kvantifiering Använda DNA-bindande Dye kemi och Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En Droplet-baserade mikroflödessystem strategi och Microsphere-PCR-amplifiering för enkelsträngat DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Morfometriska protokoll för objektiva bedömning av blastocysten beteende vid förglasning och värmande steg

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobiella stammar för bioremediering och probiotika utveckling för Metaorganismforskning och bevarande

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Hög genomströmning jäst stam fenotypning med droplet-baserade RNA sekvensering

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärt förtydligande av CHO skördad cellodlingsvätska med hjälp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...