Name: bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK096075, R01DK107875 ve R01DK114506) ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) gelen finansman büyük ölçüde kabul edilmektedir.

Bu protokol için birincil hepatosit izolasyonları Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, ABD'deki Hücre Kaynak Çekirdeği (CRC) tarafından gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolü (#2011N000111) Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Dökme damlacık vitrifikasyon
<ol><li>Vitrifikasyon çözümlerini hazırlayın.
	<ol>
<li>Vitrifikasyon solüsyonu 1 (V1) yapmak için Wisconsi...

<ol>
	<li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+and+bioartificial+liver+devices:+present+and+future.">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li><li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+transplantation:+Hepatocyte+transplantation.">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li><li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation.">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li><li>St&#233;phenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+cryopreservation:+is+it+time+to+change+the+strategy.">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li><li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation.">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).</li><li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation:+An+emerging+paradigm+change.">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li><li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions.">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li><li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation.">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li><li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulating+droplet+vitrification.">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).</li><li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification.">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li><li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-&#956;l+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting.">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-&#956;l drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li><li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+banking+in+living+droplets.">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530 (2011).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing.">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li><li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Droplet+Vitrification:+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome.">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li><li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos.">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li><li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant+Toxicity:+Facts,+Issues,+and+Questions.">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li></ol>

Hepatositlerin yavaş donma sonucu ile kriyopreservation azaltılmış canlılık ve metabolik fonksiyon. Vitrifikasyon klasik kriyopreservation için umut verici bir alternatif sunuyor, dondurucu yaralanma tamamen kaçınılır gibi9. Ancak, kritik soğutma oranını düşürmekiçin EBM'ler ile kuluçka öncesi 8 gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon CpA toksisitesi17 tarafından engellenir ve küçük numune hacimleri ile sınırlıdır. Bu sı...

Hepatositkriyat kriyopreservation sonra hücre canlılığı ve metabolik fonksiyon kaybı hala klinik uygulamaları sınırlayan önemli bir konudur1,2,3. Hepatosit kriyopatinin kriter yöntemi, hepatositlerin EBM (dimetil sülfoksit [DMSO], glikoz ve albumin) ile önceden kuluçkaya yatırılarak ve daha sonra kontrollü oranda dondurularak (yaklaşık 1 °C/dk) yavaş donma yöntemidir. kriyojenik sıcaklıklar4,5. Birçok bildirilen optimizasyonlar rağmen, Buz oluşumunun donma ve mekanik stres sırasında zararlı ozmotik dengesizlikler ile birlikte EBM toksisitesi yavaş donma temel sakıncaları kalır6,7.
Vitrifikasyon, buz oluşumu nedeniyle oluşan bu yaralanmada yavaş donma üzerinde bir avantaj sağlar tamamen cam durumuna su doğrudan faz geçiş ile kaçınılır6. Ancak, saf suyun cam geçiş sıcaklığına (-137 °C) ulaşmak için, su cam geçiş sıcaklığının üzerinde buz oluşumunu önlemek için saniyede bir milyon santigrat derece (yani kritik soğutma hızı) sırasına göre soğutulmalıdır8 . EBM'lerin eklenmesi kritik soğutma hızını düşürebilir ve sulu çözeltilerin cam geçiş sıcaklığını artırabilir9. Ancak, yüksek EBM konsantrasyonları ile bile (örneğin, 40% v / v DMSO veya daha yüksek) hızlı soğutma oranları yine de başarılı vitrifikasyon için gereklidir8,9.
Gerekli soğutma hızları ve yüksek EBM konsantrasyonları vitrifikasyon un iki büyük dezavantajına neden olmaktadır. İlk olarak, hızlı soğutma sağlamak için, örnekler düşük bir termal kütleye sahip olmalıdır. İkinci olarak, ozmotik yaralanmayı önlerken yüksek EBM konsantrasyonlarına ulaşmak için, EBM'ler yavaş yavaş tanıtılmalı ve hücre içi ve hücre dışı bölmeler arasında tam olarak dengelenmelidir6. Bu toksik EBM'lere hücrelerin maruz kalma süresini artırır. Birlikte, bu vitrifikasyon bir seferde birkaç küçük boyutlu örnekleri (mikrolitre) ile sınırlı hantal bir süreç yapar. Damlacık vitrifikasyon bu kısıtlamalar için potansiyel bir çözüm olarak önerilmiştir. Küçük hücre yüklü damlacıkları (nanolitreler) sıvı nitrojene maruz bırakarak soğutma hızı önemli ölçüde artar, bu da sonuç olarak EBM konsantrasyonunda önemli bir azalma sağlar10,11,12 ,13,14. Birden fazla yüksek frekanslı damlacık üreten nozullar potansiyel olarak aynı anda kullanılabilir olsa da, son derece küçük damlacık boyutu dakikada mikrolitre10için üretim sınırlar , hangi büyük hücre verimli vitrifikasyon engelleyen dakikada mililitre sırasına göre büyüklükleri daha yüksek işleme oranları ile hacimleri.
Son zamanlarda vitrifikasyon bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon15ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem, tüp bebekleşmeden hemen önce %7,5 v/v etilen glikol ve DMSO hücre içi CpA konsantrasyonunu yoğunlaştırmak için hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanarak toksik EBM konsantrasyonlarının tam dengelenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücresel dehidratasyon, hepatositlerin yüksek hücre dışı CpA konsantrasyonuna kısa bir maruziyeti ile akışkan bir cihazda gerçekleştirilir. Bu maruz kalma hızlı ozmotik dehidratasyonneden olsa da, hücrelere yaymak için yüksek EBM konsantrasyonu için çok kısa. Dehidratasyondan hemen sonra hücreler sıvı nitrojenle doğrudan vitrifiye edilen damlacıklarla yüklenir. Bu yöntem yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonlarının tam hücre içi alım ihtiyacını ortadan kaldırırken, yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonu büyük boyutlu damlacıkların vitrifikasyonunu sağlar ve bu da minimum EBM toksisitesi ile yüksek üretim hacimleri sağlar.
Damlacık vitrifikasyon koruma dan sonra doğrudan ve uzun vadeli canlılık artırır, yanı sıra yavaş donma tarafından klasik kriyopreservation göre birincil sıçan hepatositlerin morfolojisi ve metabolik fonksiyonu15. Bu el yazması, birincil sıçan hepatositlerinin toplu damlacık vitrifikasyonu için metodolojik ayrıntıları sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belzer UW Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>BUW-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Female Luer to 1/16&#34; low-profile semi-rigid tubing barb, PP</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogentic stroage tank / Cryotank</td>
			<td>Chart Industries</td>
			<td>MVE 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107-21-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing line</td>
			<td>Stren</td>
			<td>SOFS4-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>7727-37-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix Tips, For Use With 3HPW1</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3WRL7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Powder Funnel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4252-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 ga</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - Flexible film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06369-18</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip sterile filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation

Vitrifikasyon, biyolojik numunelerin klasik yavaş donma (yaklaşık 1 °C/dk) kriyopreservation için umut verici bir buzsuz alternatiftir. Vitrifikasyon, zararlı buz oluşumunu önlerken suyun cam faza geçişini sağlamak için son derece hızlı soğutma hızları gerektirir. Kriyoprotektif ajanlar (CPA) ile pre-inkübasyon biyolojik numunelerin kritik soğutma hızını azaltabilir rağmen, yüksek konsantrasyonlarda genellikle vitrifikasyon ile buzsuz kriyopreservation sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon EBM toksisitesi tarafından engellenir ve hızlı soğutulabilen küçük numuneler ile sınırlıdır. Son zamanlarda bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem kullanılarak, hücreler ilk olarak düşük hücre içi EBM konsantrasyonu ile ön kuluçkaya yatırılır. Hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanan hücre içi EBM, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengelemeye gerek kalmadan vitrifikasyonun hemen öncesinde yoğunlaşmıştır. Hücresel dehidratasyon akışkan bir cihazda gerçekleştirilir ve sıvı nitrojen vitrifiye büyük boyutlu damlacıkların sürekli yüksek iş üretimi ile entegre. Minimum EBM toksisitesi ile bu buzsuz kriyopreservation yöntemi büyük hücre miktarları için uygundur ve klasik yavaş dondurucu kriyopreservation ile karşılaştırıldığında artmış hepatosit canlılık ve metabolik fonksiyon sonuçları. Bu el yazması, başarılı toplu damlacık vitrifikasyon yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Beş farklı sıçan karaciğerinden taze izole primer hepatositler, literatürde bildirilen üstün yavaş dondurma protokolleri kullanılarak toplu damlacık vitrifikasyonunun klasik kriyopreservation ile doğrudan karşılaştırılması için kullanılmıştır4, 5. Kısacası, hepatositler UW'de BSA (2.2 mg/mL), glikoz (333 mM) ve DMSO (%10 v/v) ile takviye edildi ve kontrollü bir dondurucu kullanılarak donduruldu. -196 °C'de muhafaza edildikten sonra nu...

Watch this Scientific Journal Video about Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation at JoVE.com

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Bu el yazması, büyük miktarlarda sıçan hepatositleri için buzsuz kriyopreservation yöntemini açıklar ve böylece birincil hücreler düşük konsantrasyonda kriyoprotektif ajanlarla önceden kuluçkaya yatırılır ve büyük damlacıklarda vitrifiye edilir.

Primer Hepatosit Korunması için Dökme Damlacık Vitrifikasyon

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrifikasyon genellikle kriyoprotektif ajanların toksisitesi ile işlenir. Ve hızlı soğutulabilen küçük numunelere tekrar yerleştirilir. Bu protokol, kuluçka öncesi dönemde düşük EBM konsantrasyonu kullanırken büyük hücre limiktarlarının vitrifikasyonunu sağlar.Hızlı ozmotik dehidratasyon kullanılarak, düşük mahzenler arası CPA vitrifikasyon öncesinde sıvı cihazda yoğunlaşmıştır. Bu, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengeleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Toplu damlacık vitrifikasyon, kriyopreservation sonrası yetersiz sonuçlar la engellenen hepatosit transplantasyonu ve biyo-yapay karaciğer cihazlarının kullanımı için uygun ve metabolik olarak aktif hepatositler sağlayabilir.Bu yöntem potansiyel olarak büyük miktarlarda kriyo-korunması gereken diğer hücre tiplerinin vitrifikasyonu için uyarlanabilir;örneğin kan ürünleri veya kök hücreler gibi. Başlamak için, Wisconsin Üniversitesi Çözüm Üniversitesi 17.0 mililitre BSA 40 miligram ekleyerek vitrifikasyon Çözüm 1 olun. Çözeltiyi steril filtrelemek ve dört santigrat derecede depolamak için 0,22 mikrometre filtre kullanın.Protokolde açıklandığı gibi vitrifikasyon Çözüm 2 yapın. Ve steril filtre 0.22 mikrometre filtre ile. Üç mililitrelik şırıngada 3,5 mililitre steril filtrelenmiş V2 Solüsyonu yükleyin ve dört santigrat derecede saklayın.Toplu damlacık vitrifikasyon aparatını hazırlamak için, ilk olarak, karıştırma iğneleri dış gri kollu bir tarafı boyunca kesilmiş. Karıştırma iğnesinden çıkarmak için kılıfı açık bükün. Daha sonra, karıştırma iğnesini 20 milimetre uzunluğunda kesin ve kesme çıkışını 20 gauge enjeksiyon iğnesine takın.Karıştırma iğnesinin girişlerinin üzerine iki 25 milimetrelik silikon boru kesitlerini kaydırın. Ve pozisyonlarını tutkalla sabitleyin. Otoklavlayarak bu montajı sterilize edin.Steril bir Dewar şişeyi sıvı nitrojenle doldurun. Ve steril bir Laminer akış hücre kültürü başlık yerleştirmeden önce izopropanol ile dış sterilize. Sıvı nitrojen ciddi yanıklara neden olabilir gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun.Damlacık toplama cihazı oluşturmak için 50 mililitre konik tüp içine, Dewar iç çapı ile aynı dış çapı ile bir huni ekleyin. Büyük forceps kullanarak, damlacık toplama cihazını son dikey pozisyonunda sıvı nitrojenle yavaşça aşağı doğru bastırın. Konik tüpün Dewar'ın alt kısmında dikey konumda olduğundan emin olun.Ve sıvı nitrojen seviyesi huninin kenarından bir santimetre daha düşüktür. Hücre kültürü başlık duvarında dikey bir pozisyonda bir şırınga pompası monte etmek için, hücre kültürü başlık duvardan çıkıntılı vidalar için şırınga pompası ayaklarından bir dize kravat. Daha sonra, dikey monte şırınga pompası altında damlacık toplama cihazı ile sıvı nitrojen Dewar yerleştirin.Taze izole sıçan hepatositler elde ettikten sonra, tri-pan mavi dışlama ile stok konsantrasyonu saymak. Ve 40 milyon canlı hepatositi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hepatositleri 50 kez G'de beş dakika ara vermeden santrifüj edin.Süpernatant aspire. V1 Solution'ın 3,4 mililitresinde hepatositleri yeniden askıya alın. Ve üç dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.Daha sonra, 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin;hafifçe karıştırın ve üç dakika boyunca tekrar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hepatositlere 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin ve hafifçe karıştırın. Üç mililitrelik şırınga bu karışımın 3,5 mililitre yükleyin.Şırıngayı önceden kuluçkaya yatan hepatositlerle ve V2 Solüsyonu ile şırınga pompa adaptörüne yerleştirin. Şırıngalara iki Dişi Luer Lock hortum-barb adaptörü takın. Ve karıştırma iğne montaj silikon boru diken parçaları üzerinde kaydırın.Tüm bu montajı şırınga pompasına yerleştirin. DMSO ve EG'nin hepatositlere son baskısından üç dakika sonra, pompayı dakikada iki mililitreden başlatın. Tüm hepatositler sıvı nitrojen pompa durdurmak eklenmiştir sonra.20 gauge iğne kullanarak, 50 mililitrelik konik bir tüpün kapağında 10 küçük delik açın. Ve esnek bir film ile kapağın dışında sarın, sol sıvı azot buharlaşma kaçış sağlayacak bir vana oluşturarak. Vitrifiye hepatosit damlacıkları toplamak için, ilk sıvı nitrojen ile Dewar hunisi çıkarın.Daha sonra, uzun forceps ile, sıvı nitrojen damlacıkları içeren konik tüp çıkarmak ve yavaş yavaş konik tüp aşırı sıvı nitrojen dökün. Konik tüpü delinmiş kapakla kapatın ve kapalı konik tüpü doğrudan sıvı nitrojenle Dewar'a vitrifiye hepatosit damlacıklarıyla yerleştirin. Son olarak, konik tüpü sıvı nitrojenden sıvı nitrojen kriyotanka aktarın.Sakaroz ve DMEM hepatosit kültür ortamı ile yeniden Isınma çözeltisi yaptıktan sonra steril filtre için 0,22 mikrometre filtre kullanın. Sonra 37 santigrat dereceye ısıtın. Hepatositleri yeniden ısıtmak için konik tüpü vitrifiye hepatositlerle kriyoktan çıkarın ve sıvı nitrojen Dewar ile alt kültür başlığına taşıyın.Kapağı hafifçe gevşetin ve konik tüpü sıvı nitrojene geri yerleştirin. Hızlı çalışma, boş bir kabın tüm vitrifiye hepatosit damlacıkları ekleyin, sonra hızlı bir şekilde 10 saniye karıştırarak 37 derece Santigrat sıcak ısınma çözeltisi 100 mililitre ekleyin. Damlacıklar sıvı nitrojenden çıkarıldığında en derin dondurucu soğuklar saniyeler içinde gerçekleşir, eğer damlacıklar hızla ısınmazsa.Bu nedenle, karıştırma sırasında damlacıklara yeniden ısınma ortamını doğrudan eklemek çok önemlidir. Hepatositlerle yeniden Isınma çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere bölün. Tüpleri 100 kez G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin.Referans olarak tüpün mezuniyet işaretini kullanarak toplam 12,5 mililitre hacim bırakmak için süpernatants aspire. Isınma çözeltisini %50'ye seyreltmek için konik tüp başına 12,5 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Yeniden askıya alın ve üç dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yat.Isınma çözeltisini %25'e seyreltmek için konik tüp başına 25 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Mola vermeden 4 derece 50 kez G beş dakika santrifüj sonra, supernatant aspire ve istenilen kültür ortamının iki mililitre hepatosit yeniden askıya. Membran bütünlüğünü belirleyen üçlü mavi dışlama testi ile ölçüldüğünde, toplu damlacık vitrifikasyonu doğrudan koruma sonrası hepatosit canlılığı %79 sonuçlandı bu klasik optimize kriyopreservation sonrası %68'lik canlılıktan önemli ölçüde daha yüksekti.Toplu damlacık vitrifikasyon verimi% 56 olan% 10 daha yüksek ve klasik kriyopreservation daha tutarlı idi. Uzun süreli üniversite ve sandviç kültürlerinde presto-tutkal metabolizasyon teşheciliği kullanılarak, hepatositlerde metabolik aktivite, klasik kriyopreservation sonra toplu damlacık vitrifikasyon sonra önemli ölçüde daha yüksek olarak ölçüldü. Albumin sentezi, hepatositlerin sentetik fonksiyonunun en yaygın kullanılan parametresi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon sonra yaklaşık iki kat daha büyük oldu, sonra klasik kriyopreservation sonra.Üre üretimi bir haftalık kültürde hepatosit detoksifikasyon fonksiyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Dökme damlacık vitrifiye hepatositlerde üre üretimi klasik kriyotosit hepatositlerden önemli ölçüde daha yüksekti. Toplu damlacık vitrifikasyonundan sonra tutarlı sonuçlar elde etmek için, EBM'lerin kuluçka öncesi dönemdeki zamanlamanın ve bu protokolde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde yeniden ısınmanın tam olarak takip edilmesi önemlidir.Vitrifiye hepatosit damlacıkları yeniden ısıttıktan sonra, daha iyi bir boyutlandırma süspansiyonu ile sona erecek ve bu da sanki taze izole edilmiş gibi aynı şekilde kullanılabilir. Geliştirilmiş bir koruma yöntemi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon araştırma ve klinik uygulamalar için kullanılabilirlik pri-ma artırabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

Blastosist davranış objektif değerlendirme Vitrifiye ve ısınma adımları sırasında için xarakteristikaları Protokolü

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Metaorganizma Araştırma ve Koruma için Biyoremediasyon ve Probiyotikler Gelişimi için Mikrobiyal Suşların Prospektileri

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...