Name: live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

DLM understøttes af en NSF GRFP. ALM understøttes af finansiering fra Smith-familie prisen for topkvalitet inden for biomedicinsk forskning.

1. generering af hTERT-rpe-1-celler, som stabilt udtrykker RFP-Histon 2b (RFP-H2B) og α-Tubulin-egfp (tub-egfp)
Bemærk: alle trin følger aseptiske teknikker og finder sted i et sikkerhedskabinet til biosikkerhedsniveau II + (BSL2 +).
<ol><li>Generere retrovirus transporterer gener af interesse (α-Tubulin-egfp og RFP-H2B) ved transfektering af 293t celler med de relevante lentiviral plasmider i henhold til producentens anvisninger af lipid-baserede transfektering delivery system.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage.">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li><li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis.">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491 (2016).</li><li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint.">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li><li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells.">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes &amp; Development. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer.">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li><li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies:+where+they+stand.">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).</li><li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+into+Focus:+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization.">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li><li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification.">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li><li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes,+chromosome+instability+(CIN)+and+aneuploidy.">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li><li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer.">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li><li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes.">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li><li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer.">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li><li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+centrosomal+kinase,+AIR-1,+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos.">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li><li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces.">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131 (2011).</li><li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers.">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li><li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+clustering+and+chromosomal+(in)stability:+a+matter+of+life+and+death.">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells.">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564 (2009).</li><li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+aberrations:+cause+or+consequence+of+cancer+progression?.">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?.</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li><li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering.">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li></ol>

Den tidsmæssige opløsning, der leveres af time-lapse Imaging giver mulighed for visualisering og vurdering af sekventielle cellulære begivenheder inden for enkeltceller. Tilgange, der gør brug af cellulære synkronisering efterfulgt af indsamling og fiksering af celler i sekventielle tidspunkter er begrænset i, at sammenligninger er i sidste ende foretaget mellem populationer af celler. I sammenhænge, hvor cellulær respons på forstyrrelser kan være ikke-ensartet, eller hvor den proces, der visualiseres, er dynam...

Billedbaseret analyse af faste celler bruges almindeligvis til at vurdere celle populationsniveau ændringer som reaktion på forskellige perturbationer. Når det kombineres med celle synkronisering, efterfulgt af indsamling og billeddannelse af serielle tidspunkter, kan sådanne tilgange bruges til at foreslå en cellulær sekvens af begivenheder. Ikke desto mindre er faste celle billeder begrænset i, at tidsmæssige forhold er underforstået for en population og ikke påvist på niveauet af individuelle celler. På denne måde, mens fast celle billeddannelse og analyse er tilstrækkelig til at observere robuste fænotyper og Steady-State ændringer, evnen til at detektere forbigående ændringer over tid og ændringer, der påvirker kun en delpopulation af cellerne er ufuldkomment. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære og subcellulære processer i en enkelt celle, eller cellulære befolkning, over tid og uden hjælp af synkronisering tilgange, der kan selv påvirke cellulære adfærd 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Dannelsen af en bipolær mitotisk spindel er afgørende for den korrekte kromosom adskillelse under celledelingen, hvilket resulterer i to genetisk identiske datter celler. Defekter i mitotisk spindel struktur, der korrupte mitotiske progression og kompromittere trofasthed af kromosom segregation kan resultere i katastrofale celle divisioner og reduceret cellelevedygtighed. Af denne grund, mitotiske giftstoffer, der ændrer spindel dannelse er lovende Therapeutics at begrænse den hurtige spredning af kræftceller7,8,9. Ikke desto mindre er en fast celle analyse af spindel strukturen efter tilsætning af mitotiske gifte begrænset i dens evne til at vurdere den dynamiske proces med spindel dannelse og kan ikke indikere, om observerede ændringer i spindel strukturen er permanente eller i stedet forbigående og kan overvindes for at tillade succesfuld celledeling.
I denne protokol beskriver vi en tilgang til at vurdere dynamikken i mitose efter spindel forstyrrelser ved Live Cell Imaging. Ved hjælp af hTERT udødeliggjort rpe-1 cellelinje konstrueret til at udtrykke en RFP-Tagged histone 2b at visualisere kromatin, sammen med en egfp-Tagged α-Tubulin at visualisere microtubuler, timingen af Metaponto kromosom justering, anafylanindebut, og i sidste ende mitotiske celle skæbne vurderes ved hjælp af visuelle signaler af kromosom bevægelse, komprimering og nuklear morfologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>25-510</td>
			<td>A serine protease used to release adherent cells from culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml centrifuge tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Fluor objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For use in retroviral transfection; used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-tubulin-EGFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alisertib</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C02</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>For use in cell culture and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49005</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable glass Pastuer pipets, sterilized&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For use in aspirating cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>10438-026</td>
			<td>Cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and p3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi well Tissue Culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>various</td>
			<td>for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements HC&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.51</td>
			<td>Image acquisition and analysis software; used in sections 3 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotic used in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate bufferred saline (PBS)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBP06-10X1LT</td>
			<td>sterile saline solution for use with cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP- Histone 2B (H2B)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Max</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td>Human retinal pigment epithelial cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100x20mm</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353003</td>
			<td>for use in culturing adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations

Live Cell time-lapse Imaging er et vigtigt værktøj i cellebiologi, der giver indsigt i cellulære processer, der ellers kunne blive overset, misforstået, eller misfortolket af den faste celle analyse. Mens den faste celle afbildning og-analyse er robust og tilstrækkelig til at observere cellulær Steady-State, kan den begrænses ved at definere en tidsmæssig rækkefølge af hændelser på cellulært niveau og er dårligt rustet til at vurdere de dynamiske processers forbigående karakter, herunder mitotisk progression. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære processer på enkelt celleniveau over tid og har kapacitet til at fange dynamikken i processer, der ellers ville være dårligt repræsenteret i faste celle billeder. Her beskriver vi en tilgang til at generere celler transporterer fluorescently mærkede markører af kromatin og microtubuler og deres anvendelse i levende celle Imaging tilgange til at overvåge Metaponto kromosom justering og mitotisk udgang. Vi beskriver Imaging-baserede teknikker til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression, herunder identifikation af celler på forskellige stadier i mitose, identifikation og sporing af mitotiske defekter, og analyse af spindel dynamik og mitotiske celle skæbne efter behandling med mitotiske hæmmere.

Vurdering af mitotisk progression ved tilstedeværelse af spindel forstyrrelser Reguleringen af spindel pole fokusering er et vigtigt skridt i korrekt bipolar spindel dannelse. Afbrydelse i denne proces gennem protein depletions, Drug hæmning, eller ændringer i centrosome nummer korrupte spindel struktur og forsinke eller standse mitotiske progression10,11,12,<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Her præsenterer vi en protokol til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression. Vores anvendelse af time-lapse Imaging gør det muligt for brugeren at identificere celler på forskellige stadier af mitose, spore og identificere mitotiske defekter, og analysere spindel dynamik og mitotiske celle skæbne ved udsættelse for anti-mitotiske lægemidler.

Live Cell Imaging til at vurdere dynamikken i metafase timing og celle skæbne efter mitotiske spindel forstyrrelser

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Live cellebilleddannelse muliggør observation af dynamiske cellulære processer over tid i en enkelt celle. Disse tilgange er stærke til at vurdere de forhold, der påvirker den dynamiske proces med celledeling og afslører de virkninger, som defekter i mitose har på dattercellespredning og levedygtighed. Fototoksicitet, der skyldes lyseksponering under billeddannelse, udgør en betydelig udfordring forbundet med denne protokol.Eksponeringstider og billedinterval og varighed bør derfor optimeres. Ved hjælp af aseptisk teknik og et biosikkerhedsniveau niveau to sikkerhedsskab, skal du bruge en steril engangsglas Pasteur pipette til at aspirere mediet fra kulturpladen, der indeholder cellelinjen, der bærer udtrykskonstruktionen af interesse. Cellerne vaskes kort med 10 milliliter steril PBS med hvirvlende og behandles cellerne med to milliliter 0,05% trypsin.Efter to til fem minutter ved 37 grader Celsius, tilsæt otte milliliter frisk medium til pladen for at stoppe reaktionen og resuspend de fritliggende celler med blid pipettering. Celleropløsningen overføres til et sterilt 15 milliliterrør, og cellerne opsamres ved centrifugering. Pelletsuspendrer pelletet i 10 milliliter PBS og centrifuger cellerne igen.Pelletsuspendrer pelletet op igen i 10 milliliter medium til optælling og fortynd cellerne til en en til to gange 10 til de 5. Derefter frø 500 mikroliter af celler i hver brønd af en steril 12-brønd imaging bundplade og placere pladen i cellen kultur inkubator at tillade cellerne at holde sig til pladens overflade. Ikke mere end 30 minutter før billeddannelse, tilføje en relevant koncentration af et mitotisk lægemiddel til en eller flere af brøndene og tilføje en lige volumen af inhibitor fortyndingsmiddel til det samme antal brønde som kontrollerne.For at forberede mikroskopet til billeddannelse skal pladen placeres på scenen af et omvendt epifluorescensmikroskop udstyret med et højopløsningskamera, et miljøkammer forvarmet til 37 grader Celsius og et fremføringssystem til befugtet 5 % kuldioxid. Vælg en 20 gange luft mål med en numerisk blænde på 0,5 og udstyret til den høje kontrast fluorescens og fase kontrast, eller lyse felt billeddannelse og se cellerne til at justere kurset og finde fokus for at bringe celler i fokus. Hvis du vil angive de optimale eksponeringstider for lys køb af billeder i marken, GFP og RFP-billed, skal du vælge de respektive filterkuber med den relevante excitation og emission for de fluorophores, der afbildes, og klikke på Afspil.Hvis signalet ikke er tilstrækkeligt intenst, skal du justere den automatiske eksponering, og vælg den relevante placering i rullemenuen Formatér i hver fluorophorekanal i hver fluorophorekanal. Vælg og kalibrer mikroskopstadiet til flerblyskålen i henhold til producentens anvisninger, og brug billedopkøbssoftwaren til at fremhæve eller på anden måde vælge de brønde, der skal afbildes. Åbn kontrolpanelet for genererede punkter, og vælg Begrænset område og Kant under Arbejdsområde for at begrænse koordinatmarkeringsområdet for at udelade brøndens grænser.Vælg Hele område i rullemenuen Områdebegrænsning, og vælg en tilfældig punktplacering. Indstil optællingen til seks, og klik på Randomiser for at vælge antallet og fordelingen af de punkter, der skal hentes pr. brønd, hhv. Klik derefter på og indtast værdierne i tidssekvensens kontrolpanel for at vælge og indtaste tidsintervallet og varigheden af indsamlingen af billederne.For at visualisere RFP-H2B mærket kromatin skal du markere de billeder, der er taget med RFP-filterkuben, på plads, og identificere en celle, der kommer ind i mitose som angivet i den indledende kromatinkomprimering og opdeling af den nukleare konvolut for at bestemme den mitotiske timing af metafasejusteringen og anaphase-indstøningen i de enkelte celler. Spor den celle af interesse gennem på hinanden følgende tidspunkter i den erhvervede film til at bestemme antallet af tidspunkter eller minutter fra mitotisk indrejse indtil RFP-H2B mærket chromatin fuldender justeringen på cellen ækvator under metafase. For at overvåge den mitotiske timing, mitotisk troskab og celle skæbne, fortsætte med at spore cellen gennem på hinanden følgende tidspunkter for at identificere den tid koordinere, hvor anaphase kromosom adskillelse er synlige og / eller når kromatin decompaction og nukleare kuvert reformation har fundet sted.Visualiser derefter RFP-H2B for at identificere celler i hver population, der udviser mitotiske defekter, herunder haltende kromosomer og kromatinbroer under anaphasekromosomadskillelse. Ved at visualisere alpha tubulin-EGFP, kan det bemærkes, at celler, der oplever spindel forstyrrelser gennemgå dynamiske ændringer som spindel træk fokus opnås, og en bipolar mitotisk spindel dannes som forberedelse til celledeling. Sideløbende med spindelsamling kan kromosombevægelse visualiseres med RFP-H2B for at vurdere kromosomjusteringen og adskillelsesglæden.Ved hjælp af levende cellebilleddannelse tilgange, disse repræsentative resultater viser, at celler med en normal centrosome indhold er i stand til at gå fra nukleare kuvert opdeling gennem metafase justering og anaphase debut for at opnå en bipolar division på under 30 minutter. I nærvær af ekstra centrosomer, næsten 50% af cellerne er i stand til at overvinde en forbigående multipolær mitotisk spindel og til at danne en bipolar spindel i komplet celledeling. De resterende celler er ude af stand til at opnå en bipolar spindel og som et resultat, afslutte mitose gennem en multipolær division.Uanset om spindelpol bipolaritet opnås, celler med ekstra centrosomer udviser en signifikant øget varighed af mitose sammenlignet med celler med to centrosomer. Indikerer, at dynamikken i mitotisk progression kan ændres, selv når ændringer i mitotisk resultat ikke er synlige. Når eksponeringstider for lysstofrør defineres, skal eksponeringstiderne optimeres for at begrænse fototoksiciteten.Også kamera pixel binning kan vælges for at tillade lavere eksponering gange, der skal anvendes. Denne procedure har anvendelser i farmakologiske screeninger, invasion, og migration analyse. Disse tilgange kan også anvendes til at undersøge effekten af narkotika behandlinger eller dynamikken i cellulære motilitet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantater at teste for Cell Fate Commitment under fosterudviklingen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levende Cell Imaging af Early Autophagy begivenheder: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live-Cell Imaging Primary Rat Neonatal cardiomyocytes Efter Adenoviral og Lentiviral Transduktion Brug Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Undersøgelse af Protein Kvalitetskontrol System af<em&gt; D. discoideum</em&gt; Brug Temperatur-kontrollerede Live-Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøgelse af mitotisk og meiotisk fission gær nuklear dynamik ved fluorescens levende celle mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Dynamisk cellebilledbehandling i superopløsning af undercellulære strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...