Name: live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

DLM は NSF GRFP によってサポートされます。ALMは、生物医学研究の卓越性のためのスミス家族賞からの資金によってサポートされています。

1. RFP-ヒストン2B(RFP-H2B)およびα-チューブリン-EGFP(浴槽-EGFP)を安定して発現するhTERT-RPE-1細胞の生成
注:すべてのステップは無菌技術に従い、バイオセーフティレベルII+(BSL2+)安全キャビネットで行われます。
<ol><li>脂質ベースのトランスフェクション送達システムのメーカーの指示に従って、適切なレンチウイルスプラスミドを有する293T細胞のトランスフェクションによ?...

<ol>
	<li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage.">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li><li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis.">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491 (2016).</li><li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint.">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li><li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells.">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes &amp; Development. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer.">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li><li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies:+where+they+stand.">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).</li><li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+into+Focus:+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization.">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li><li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification.">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li><li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes,+chromosome+instability+(CIN)+and+aneuploidy.">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li><li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer.">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li><li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes.">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li><li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer.">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li><li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+centrosomal+kinase,+AIR-1,+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos.">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li><li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces.">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131 (2011).</li><li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers.">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li><li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+clustering+and+chromosomal+(in)stability:+a+matter+of+life+and+death.">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells.">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564 (2009).</li><li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+aberrations:+cause+or+consequence+of+cancer+progression?.">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?.</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li><li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering.">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li></ol>

タイムラプスイメージングによって提供される時間分解能は単一細胞内の連続した細胞事象の視覚化および評価を可能にする。細胞同期を利用したアプローチは、連続した時点での細胞の収集と固定に続くアプローチは、最終的に細胞の集団間で比較が行われるために制限される。摂動に対する細胞応答が不均一であるか、または視覚化されるプロセスが動的である状況では、生細胞のタイ?...

固定細胞の画像ベースの分析は、一般的に様々な摂動に応じて細胞集団レベルの変化を評価するために使用されます。細胞同期と組み合わせると、シリアルタイムポイントの収集とイメージングが続き、このようなアプローチを使用して、細胞配列のイベントを示唆することができます。それにもかかわらず、固定細胞イメージングは、時間的関係が集団に対して暗示され、個々の細胞のレベルで実証されないという限られたものである。このように、固定細胞イメージングと解析は、堅牢な型と定常状態の変化を観察するのに十分ですが、時間の経過に伴う一時的な変化や細胞の亜集団のみに影響を与える変化を検出する能力は不完全です。対照的に、ライブ細胞イメージングは、単一の細胞内の細胞および細胞集団内の細胞および細胞内のプロセスを、時間の経過とともに、それ自体が細胞行動に影響を与える可能性のある同期アプローチの助けを借りずに観察するために使用できる雄弁なツールです。1,2,3,4,5,6.
双極性人型のスピンドルの形成は、細胞分裂中の適切な染色体分離に不可欠であり、その結果、2つの遺伝的に同一の娘細胞が生じる。有人性スピンドル構造の欠陥は、有人性の進行を破壊し、染色体分離の忠実性を損なう可能性があり、壊滅的な細胞分裂と細胞生存率の低下をもたらす可能性があります。このため、スピンドル形成を変化させる有人毒は、癌細胞7、8、9の急速な増殖を制限する有望な治療法である。それにもかかわらず、有毒毒の添加後の紡錘構造の固定細胞分析は、スピンドル形成の動的過程を評価する能力に限られており、スピンドル構造の観察された変化が永続的であるか、またはあるかを示さないかもしれない代わりに一時的であり、成功した細胞分裂を可能にするために克服することができる。
このプロトコルでは、生細胞イメージングによるスピンドル摂動後のミトシスのダイナミクスを評価するアプローチについて述べた。RFPタグ付きヒストン2Bを発現するように設計されたhTERT不死化RPE-1細胞株を使用してクロマチンを可視化し、EGFPタグ付きαチューブリンと共に微小管、メタフェーズ染色体アライメントのタイミング、アナセ相発症、そして最終的には人体細胞の運命は、染色体の動き、圧縮、および核形態の視覚的手がかりを使用して評価される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>25-510</td>
			<td>A serine protease used to release adherent cells from culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml centrifuge tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Fluor objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For use in retroviral transfection; used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-tubulin-EGFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alisertib</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C02</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>For use in cell culture and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49005</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable glass Pastuer pipets, sterilized&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For use in aspirating cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>10438-026</td>
			<td>Cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and p3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi well Tissue Culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>various</td>
			<td>for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements HC&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.51</td>
			<td>Image acquisition and analysis software; used in sections 3 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotic used in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate bufferred saline (PBS)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBP06-10X1LT</td>
			<td>sterile saline solution for use with cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP- Histone 2B (H2B)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Max</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td>Human retinal pigment epithelial cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100x20mm</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353003</td>
			<td>for use in culturing adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations

ライブセルタイムラプスイメージングは、固定細胞分析によって見落とされたり、誤解されたり、誤解されたりする細胞プロセスに関する洞察を提供する細胞生物学における重要なツールです。固定細胞イメージングと解析は堅牢で、細胞の定常状態を観察するのに十分ですが、細胞レベルでイベントの時間的順序を定義する際に制限され、動的プロセスの一時的な性質を評価する能力が不十分です。水和性の進行。対照的に、ライブセルイメージングは、時間の経過とともに単一細胞レベルで細胞プロセスを観察するために使用できる雄弁なツールであり、固定細胞イメージングでは不十分に表現されるプロセスのダイナミクスをキャプチャする能力を有する。ここでは、クロマチンと微小管の蛍光標識マーカーを運ぶ細胞を生成するアプローチと、メタフェイズ染色体の整列と有形出口を監視するライブ細胞イメージングアプローチでの使用について説明する。人工的な様々な段階での細胞の同定、ミトシス欠陥の同定と追跡、紡錘のダイナミクスの解析など、スピンドル形成と人力の進行のダイナミクスを評価するイメージングベースの技術を説明し、人芽細胞の運命は、人工阻害剤による治療に続く。

紡錘摂動の存在下での水疱性進行の評価 スピンドル極集の調節は、適切な双極スピンドル形成に不可欠なステップです。タンパク質枯渇、薬物阻害、またはセントロソーム数の変化を介したこのプロセスにおける破壊は、紡錘構造を破壊し、有人進行を遅延または停止させる10、11、12、13。<sup class="x...

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Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

ここでは、スピンドル形成と人工的進行のダイナミクスを評価するプロトコルを提示する。当社のタイムラプスイメージングの応用により、ユーザーは、人芽細胞の様々な段階で細胞を同定し、人芽細胞の欠陥を追跡および同定し、抗マイト薬への曝露時にスピンドルダイナミクスと人工細胞の運命を分析することができます。

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

ライブセルイメージングにより、単一の細胞内での時間の経過に関する動的な細胞プロセスの観察が可能になります。これらのアプローチは、細胞分裂の動的プロセスに影響を与える条件を評価し、有糸分裂の欠陥が娘の細胞増殖および生存可能性に及ぼす影響を明らかにするのに強力である。イメージング中に光暴露から生じる光毒性は、このプロトコルに関連する重大な課題を表す。したがって、露光時間とイメージング間隔と持続時間を最適化する必要があります。無菌技術とバイオセーフティレベル2安全キャビネットを用いて、滅菌使い捨てガラスパスツールピペットを用いて、目的とする発現構成体を担う細胞株を含む培養板から培地を吸引する。渦巻きで10ミリリットルの無菌PBSで細胞を簡単に洗い、0.05%トリプシンの2ミリリットルで細胞を治療します。摂氏37度で2~5分後、新鮮な培地を8ミリリットルプレートに加えて反応を止め、切り離した細胞を穏やかなピペットで再中断します。細胞溶液を無菌15ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって細胞を採取する。10ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、細胞を再び遠心分離する。ペレットを計数用の培地10ミリリットルに再懸濁し、細胞培地濃度のミリリットル当たり5番目の細胞に1〜2倍に希釈する。次に、無菌12ウェルイメージング底板の各ウェルに500マイクロリットルの細胞をシードし、細胞培養インキュベーターにプレートを入れて、細胞がプレートの表面に付着できるようにします。イメージングの30分以上前に、1つ以上のウェルに有糸分裂性薬物の関連濃度を加え、コントロールと同じ数のウェルに同量の阻害剤希釈剤を加える。顕微鏡をイメージング用に準備するには、高解像度カメラ、摂氏37度に予熱した環境室、加湿5%の二酸化炭素の送達システムを備えた反転性蛍光顕微鏡のステージにプレートを置きます。0.5の数値開口で20倍の空気の目的を選択し、高コントラスト蛍光と位相コントラスト、または明視野イメージングを装備し、細胞を見てコースを調整し、焦点を合わせて細胞を焦点にします。明視野、GFP、および RFP 画像取得の最適な露光時間を設定するには、画像化されるフルオロフォアに対して適切な励起と放出を持つそれぞれのフィルタ キューブを選択し、[再生]をクリックします。信号が十分に強くない場合は、自動露出を調整し、各フルオロフォアチャンネルで[フォーマット]ドロップダウンメニューから適切なビンを選択します。メーカーの指示に従って顕微鏡のステージをマルチウェル皿に合わせて選択し、キャリブレーションし、画像取得ソフトウェアを使用して、画像化されるウェルをハイライトまたは選択します。生成されたポイントコントロールパネルを開き、[作業領域]で[制限]と[境界線]を選択して、座標選択領域を制限して、ウェルの境界を除外します。[エリア制限] ドロップダウン メニューで、[エリア全体] を選択し、ランダムなポイント配置を選択します。カウントを 6 に設定し、[ランダム化] をクリックして、それぞれウェルごとにキャプチャするポイントの数と分布を選択します。次にクリックし、時間シーケンスコントロールパネルに値を入力して、画像を収集する時間間隔と期間を選択して入力します。RFP-H2B標識クロマチンを可視化するには、RFPフィルターキューブで撮影した画像を所定の位置に選択し、初期クロマチン圧縮と核エンベロープ分解によって示されるように有糸分裂に入る細胞を特定し、個々の細胞におけるメタフェーズアライメントおよび解相発症の有糸間合動のタイミングを決定する。取得したムービーの連続したタイムポイントを通して対象のセルを追跡し、裂実エントリから、RFP-H2Bラベル付きクロマチンがメタフェーズ中に細胞赤道でのアライメントを完了するまでの時間ポイントまたは分数を決定します。有糸分裂のタイミング、有糸の忠実さ、および細胞の運命を監視するために、連続した時間ポイントを通して細胞を追跡し続け、解相染色体分離が明らかである時間座標および/またはクロマチン脱圧縮および核エンベロープの改変が起こった時を特定する。次に、RFP-H2Bを可視化して、アナフェーズ染色体分離中の遅れた染色体やクロマチン橋を含む、有糸分裂欠陥を示す各集団の細胞を同定する。αチューブリン-EGFPを可視化することにより、紡錘の破砕を経験した細胞は、スピンドルプルの焦点合わせが達成され、細胞分裂に備えてバイポーラ有糸状紡錘が形成されるとともに動的変化を起こすのが観察できる。スピンドルアセンブリと同時に、染色体の動きをRFP-H2Bで視覚化して、染色体のアライメントと分離の忠実度を評価することができます。これらの代表的な結果は、生細胞イメージングアプローチを用いて、正常なセントロソーム含有量を有する細胞が、30分以内に双極性分裂を達成するために、メタフェーズアライメントおよびアナフェーズ発症を通じて核エンベロープの分解から進むことができることを示している。余分なセントロソームの存在下では、細胞のほぼ50%が一過性多極有糸分裂スピンドルを克服し、完全な細胞分裂における双極性紡錘を形成することができる。残りの細胞は双極スピンドルを達成することができず、その結果、多極分裂を通して有糸分裂を抜ける。スピンドル双極性が達成されるかどうかにかかわらず、余分な中心性を有する細胞は、2つのセントロソームを有する細胞と比較して有糸分裂の有意に増加した持続時間を示す。有糸分裂性転帰の変化が明らかでない場合でも、有糸分裂性進行のダイナミクスが変化する可能性があることを示す。蛍光チャネルの露光時間を定義する場合は、光毒性を制限するために、露出時間を最適化します。また、カメラピクセルビンを選択して、より低い露光時間を使用できるようにすることもできます。この手順は、薬理学的スクリーニング、浸潤、および移行分析における適用を有する。これらのアプローチはまた、薬物治療の有効性または細胞運動のダイナミクスを調べるために使用することができる。

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