Name: quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures at JoVE.com

Nous remercions Bruno Amati pour le don aimable du modèle de souris transgénique Rosa26-MycER. Ces travaux ont été financés par des subventions de la WWCR, de l'AIRC, de l'ERC et du Ministère italien de la Santé à P.G.P. T.V. et X.A. ont été soutenus par la FIRC et A.S. par une subvention de la FUV.

Les procédures in vivo ont été effectuées conformément à la directive de l'UE 2010/63 et après approbation de notre comité d'éthique institutionnel (Organisme pour le bien-être animal-OPBA) et du ministère italien de la Santé (numéros 762/2015 et 537/2017 de l'IACUC).
1. Collection et digestion de gland sorane de Murine
<ol><li>Pour une expérience typique, sacrifiez des souris femelles vierges de 8 à 10 semaines par inhalation de CO2. Selon les objectifs de l'expérience, utiliser 5-30 souris. Placez les souris sur des panneaux de dissection sous une hotte. Utilisez des aiguilles pour étirer les membres antérieurs et laver la fourrure de l'animal avec de l'éthanol.</li>
	<li>Soulevez la peau avec des forceps et effectuez une incision verticale à partir du niveau de la région pelvienne et se déplaçant tout le chemin vers le col de l'utérus, laissant le péritoine intact. Pour éviter de rompre la peau ou le péritoine, utilisez des ciseaux à bords ronds.</li>
	<li>Détachez soigneusement la peau du corps avec des mouvements doux des ciseaux à travers l'axe latéral du corps.</li>
	<li>Une fois que la peau est complètement détachée de la région thoracique et abdominale, effectuer quatre incisions à travers les quatre membres de l'animal et épingler la peau avec des aiguilles. Utilisez les ciseaux et les forceps pour détacher complètement le corps de l'animal de la peau étendue.</li>
	<li>Utilisez les forceps pour soulever délicatement les coussinets graisseux mammaires qui sont maintenant entièrement exposés et les détacher soigneusement de la peau à l'aide des ciseaux. Recueillir les glandes mammaires thoraciques et abdominales inférieures de chaque souris et les immerger dans la saline tamponnée de phosphate de Dulbecco (DPBS), dans un tube conique de 50 ml. Recueillir jusqu'à 20 glandes par tube. Gardez les tissus sur la glace. REMARQUE: Si nécessaire, les glandes peuvent rester sur la glace pendant la nuit. C'est un point d'arrêt sûr. Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.</li>
	<li>Préparer et filtrer le milieu de digestion : le milieu d'aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco, complété par 2 mM de glutamine, 100 u/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 200 collagène U/mL et 100 mg/mL d'hyaluronidase (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Transférer jusqu'à 20 glandes dans un plat Petri de 100 mm et émincer le tissu à l'aide d'un scalpel ou de ciseaux incurvés. Évitez de transférer de grands volumes de DPBS dans le plat.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de milieu de digestion à chaque plat Petri et transférer le tissu haché dans un tube conique de 50 ml, à l'aide d'une pipette sérologique de 25 ml.</li>
	<li>Scellez les tubes avec du parafilm et placez-les sur un rotateur. Définir le rotateur à basse vitesse (0,03 x g)et couver pendant 2,5 h à 37 oC dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2.</li>
	<li>Inspectez visuellement la suspension avant de passer aux étapes suivantes. Si de gros morceaux de tissu ne sont pas digérés, prolonger l'incubation à 37 oC pendant 30 minutes de plus. REMARQUE: Comme alternative, la digestion peut être effectuée pendant la nuit à 37 oC, 5% CO2, en utilisant un mélange doux d'enzymes de collagène/hyaluronidase13.</li>
</ol>2. Isolement des MEC Murine primaire
<ol><li>Arrêtez le rotateur et retirez les tubes de l'incubateur. Ajuster une pointe P1000 à l'ouverture d'une pipette sérologique de 5 ml. Si la suspension passe par la pointe P1000, passez aux étapes suivantes. Dans le cas contraire, prolonger l'incubation à 37 oC pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifugeuse à 100 x g, pendant 5 min à 4 oC. Décant soigneusement le supernatant et resuspendre le granule de chaque tube en 3 ml de DPBS. REMARQUE: La faible vitesse de centrifugation permet l'ablation des lymphocytes et des cellules adipeuses. Une manipulation douce est nécessaire pour éviter de déloger la pastille à cette étape.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire dans chaque tube séparément, à l'aide de 100, 70 et 40 passoires cellulaires. À chaque étape de filtrage, lavez les passoires avec 2 ml de DPBS avant de recueillir la passe à travers. REMARQUE: À partir de ce moment, les suspensions cellulaires peuvent être mises en commun et traitées ensemble.</li>
	<li>Centrifugeuse à 300 x g, pendant 5 min à 4 oC. Décant soigneusement le supernatant et resuspend les cellules dans le volume restant de DPBS.</li>
	<li>Procédez à la lyse des globules rouges (RBC) en ajoutant un volume égal de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) (voir Tableau des matériaux). Mélanger par pipetting et incuber sur la glace jusqu'à 5 min.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de DPBS et centrifugeuse à 300 x g,pendant 5 min à 4 oC. Décant, décantant soigneusement le supernatant et inspectez visuellement la pastille. Si la pastille est blanche, passez à l'étape suivante. Sinon, répétez l'étape de lyse RBC (étape 2.5).</li>
	<li>Resuspendre la pastille cellulaire dans 1-5 ml de milieu xmétasphère : milieu basal de croissance épithéliale mammaire (MEBM), complété par 2 mM de glutamine, 100 u/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 5 x g/mL d'insuline, 0,5 g/mL d'hydrocortisone, 2 % de B27, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 20 ng/mL facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF) et 0,4 IU/mL heparin (Tableau des matériaux).</li>
</ol>3. Mammosphere en série Re-plaquage
<ol><li>Pour l'établissement de cultures de mammosphère, plaquez les cellules sur la culture non tissulaire traitée (ultra-faible adhérence) 6-puits plaques à une densité de 200.000 cellules viables / mL dans le milieu de la mammosphère. Incuber les cellules pendant 7-10 jours à 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Préparer et filtrer 1% de solution poly-HEMA dans 95% d'éthanol (voir Tableau des matériaux). Enrober les plaques d'adhérence ultra-faibles de 6 puits pour les passages suivants, en ajoutant 400 L de 1 % de solution poly-HEMA par puits et en permettant à l'éthanol de sécher complètement. Pour de meilleurs résultats, répétez le revêtement deux fois. REMARQUE: L'utilisation de plaques non enduites lors du premier passage permet l'élimination sélective des fibroblastes de la culture.</li>
	<li>À la fin de la culture de 7-10 jours, recueillir les mammosphères primaires de tous les puits et centrifugeuses à 300 x g, pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Décant soigneusement le supernatant et procéder à la dissociation mécanique des mammosphères à l'aide d'une pipette P200 avec des pointes filtrées. Pipette pendant environ 100 fois et inspecter visuellement la suspension pour la présence de grands sphéroïdes. REMARQUE: Une courte incubation (2-5 min) de la granule de sphère dans un faible volume (0,2-0,5 ml) de trypsine ou d'Accutase à 37 oC, 5 % CO2,peut être utilisée pour faciliter la dissociation mécanique. Préparer le milieu de la mammosphère fraîche (étape 2.7) pour le placage de chaque passage.</li>
	<li>Resuspendre dans 1-5 ml de milieu de la mammosphère fraîche et compter les cellules viables. Le cas échéant, divisez les cellules en groupes de traitement ou en culture.</li>
	<li>Plaque 20 000 cellules viables/mL sur des plaques d'adhérence ultra-faible enduites poly-HEMA 6-puits et incuber à 37 oC, 5 % CO2. REMARQUE: Les mammosphères atteignent leur taille maximale dans les 5-7 jours suivant le placage cellulaire. Dans la mesure du possible, distribuez les cellules de chaque échantillon ou condition à plusieurs puits pour obtenir des répliques techniques. La densité de placage doit être maintenue faible pour éviter l'agrégation cellulaire. Un maximum de 20 000 cellules/mL est recommandé pour les plaques de 6 puits et de 5 000 cellules/mL pour les plaques de 24 puits.</li>
	<li>Après 5-7 jours, comptez le nombre de sphères par puits. Cela peut être fait soit manuellement, à l'aide d'un microscope équipé d'une lentille de grossissement 10x, ou en utilisant l'analyse d'image numérique (voir l'étape 4).</li>
	<li>Recueillir les mammosphères de chaque puits séparément et la centrifugeuse à 300 x g,pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Décant soigneusement le supernatant et procéder à la dissociation mécanique des mammosphères à l'aide d'une pipette P200 avec des pointes filtrées. Pipette pendant environ 100 fois et inspecter visuellement la suspension pour la présence de grands sphéroïdes.</li>
	<li>Resuspendre dans 1 ml de milieu de mammosphère fraîche et compter les cellules viables. Regroupez les cellules de chaque échantillon ou condition et répétez les étapes 3.6-3.10. Enregistrez le nombre de cellules plaquées et le nombre de sphères et de cellules comptées par puits pour chaque passage. Passez à l'étape 5 pour le calcul cumulatif de la croissance.</li>
</ol>4. Énumération de sphère utilisant l'analyse numérique d'image (DIA)
<ol><li>À la fin de chaque passage, numériser toute la surface de tous les puits et acquérir des images des sphères à l'aide d'un appareil photo numérique monté sur un stéréoscope. Enregistrer les images comme fichiers .tif.</li>
	<li>Importer les images stéréoscope comme une séquence d'image en utilisant ImageJ14. Définir l'échelle et le type d'image à 8 bits.</li>
	<li>Duplicate la pile d'images et sélectionnez Soustraction de l'arrière-plan de l'onglet Process sur la barre de menu. Vérifiez les options Fond léger et paraboloïde de glissement et cliquez sur le bouton OK. Traiter toutes les images de la pile.</li>
	<li>Sélectionnez Ajuster puis Seuil à partir de l'onglet Image de la barre de menu. En cliquant sur Apply, une fenêtre de dialogue intitulée Convert Stack to Binary apparaîtra. Sélectionnez Par défaut comme méthode et Lumière comme arrière-plan. Cochez la case Calculer le seuil pour chaque image et cliquez sur le bouton OK.</li>
	<li>Sélectionnez séquentiellement les commandes Watershed, Open et Erode de la liste binaire sous le processus d'onglet de la barre de menu. Traiter toutes les images de la pile en cliquant sur le bouton Oui de la boîte de dialogue qui apparaît. REMARQUE: Ces processus permettent la segmentation visuelle des objets qui touchent, lissent l'objet et suppriment les pixels du bord des objets.</li>
	<li>Sélectionnez la fonction Analyser les particules du menu Analyser. Fixez le seuil de taille minimale à 10 000 m2 et la circularité entre 0,50 et 1,00. Sélectionnez l'option Ellipses dans le menu Afficher. Vérifiez résumé, Exclure sur les bords et In situ Afficher et cliquez sur le bouton OK. Traiter toutes les images de la pile.</li>
	<li>Inspectez visuellement la correspondance des ellipses avec des sphères et, si nécessaire, corrigez le nombre de particules en conséquence. Sommez les comptes de tous les cadres de chaque puits pour obtenir le nombre total de mammosphères par puits.</li>
</ol>5. Calcul cumulatif de la courbe de croissance
REMARQUE: Le nombre de mammosphères comptées dans chaque puits à la fin de chaque passage (PN) reflète le nombre de cellules initiatrices de la mammosphère ensemiées au début de PN.
<ol><li>Pour chaque passage (PN),enregistrez le nombre de cellules plaquées et le nombre de cellules et de sphères comptées par puits. Calculez la taille de la sphère à la fin de chaque passage : taille de la sphère PN (cellules / sphère) - cellules comptées PN / sphères comptées PN REMARQUE: La taille de la sphère à PN est une mesure du potentiel proliférant de chaque cellule initiatrice de la mammosphère ensemiée à PN.</li>
	<li>Inférer le nombre de sphères plaquées en divisant le nombre de cellules plaquées pour PN par la taille de la sphère calculée à la fin du passage précédent (PN-1): sphères plaquées PN et cellules plaquées PN / taille de sphère PN-1 REMARQUE: Par convention, la taille de la sphère est supposée stable lors du premier passage de la culture (c.-à-d., taille de sphère P0 - taille de sphère P1). Si plusieurs puits sont utilisés comme répliques techniques, utilisez la taille moyenne de la sphère à PN-1 comme dénominateur.</li>
	<li>Calculer le nombre cumulatif de cellules et de sphères pour chaque puits par passage : nombre cumulatif PN (compte PN / plaqué PN) X nombre cumulatif PN-1. REMARQUE: Par convention, nombre cumulatif P0 et P1. Si plusieurs puits sont utilisés comme répliques techniques, calculez le nombre cumulatif moyen par échantillon ou condition pour chaque passage.</li>
	<li>Tracez les points de données sur une échelle semi-logarithmique. Afficher le numéro de passage (P0 à PN) sur l'axe x (échelle linéaire) et le nombre cumulatif de cellules ou de sphères sur l'axe y (échelle logarithmique).</li>
	<li>Adaptez une ligne de tendance exponentielle aux points de données et calculez le coefficient de détermination (R2) pour mesurer la bonté de l'ajustement. REMARQUE: La ligne de tendance adaptée aux points de données devrait se rapprocher d'une courbe exponentielle, comme prévu pour une population cellulaire qui croît ou meurt avec un taux constant. R2 prend des valeurs entre 0 et 1, avec des valeurs les plus proches de 1 indiquant un meilleur ajustement.</li>
	<li>Représenter l'équation de la ligne de tendance comme une fonction exponentielle naturelle pour déduire le taux de croissance (GR) de la culture : y y0 e(GR)x, où y0 est la valeur de y quand x 0.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell.">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>van Amerongen, R., Bowman, A. 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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, nous décrivons un protocole pour la description quantitative des propriétés de croissance de MaSC in vitro. Par exemple, nous présentons l'effet de l'expression de Myc constitutive de bas niveau sur les MaSC murines normaux. Cette approche, cependant, peut être appliquée également à divers contextes. Les cellules primaires humaines ou maurines, ainsi que les lignées cellulaires établies, peuvent être cultivées dans des conditions indépendantes d'ancrage pour établir des cultures de mammosphère qui peuvent être traduites en série. La surexpression génétique et l'interférence de l'ARN peuvent être facilement introduites dans le protocole avec l'ajout d'une étape de transduction virale à la fin du premier passage (après l'étape 3.5). Alternativement, les cellules peuvent être infectées par l'adhérence, puis plaquées comme des mammographies.
Un aspect critique de l'essai présenté ici est la densité des cellules d'ensemencement, qui devrait être assez faible pour éviter la génération d'agrégats interférer avec l'interprétation des résultats16,17. La morphologie des mammosphères peut être instructive pour résoudre cette ambiguïté. Seules les sphères compactes et rondes doivent être énumérées à la fin de chaque passage. La circularité des sphéroïdes et la taille doivent être prises en considération. En utilisant le processus automatisé du DIA, cette étape est assurée avec les seuils appropriés d'une manière objective et absolue. Souvent, les progéniteurs formeront des structures acinar ou de plus petits amas de cellules qui devraient être exclus des comptes de mammosphère. En règle générale, nous utilisons un seuil de 100 m de diamètre. Enfin, il faut prendre soin d'éviter le transfert de mammopsheres intacts ou non dissociés d'un passage à l'autre. D'autre part, l'excès de pipetting conduira à une augmentation de la mort cellulaire. Ainsi, si de telles difficultés sont rencontrées, nous recommandons d'utiliser la trypsinisation douce ou le traitement d'Accutase et de passer les sphères dissociées par une passoire de 40 m pour assurer la génération des suspensions unicellulaires.
L'efficacité de formation de sphère (SFE) a été employée alternativement, comme substitut pour SC ou CSC quantitation ex vivo dans les cultures de mammosphere. Le SFE est en effet une mesure des cellules souches d'une population cellulaire donnée. Toutefois, il s'agit d'une approche moins consciencieuse puisqu'elle ne fournit de l'information qu'à des moments distincts. Le calcul des nombres cumulatifs de sphères et de la génération des courbes de croissance cumulatives permet au contraire d'inférer le taux de croissance de la culture de l'étape initiale d'ensemencement des cellules jusqu'à l'épuisement de la culture ou, dans le cas des cultures immortalisées, pour le nombre souhaité de passages. L'évaluation des propriétés de croissance permet d'évaluer l'écart par rapport à la croissance exponentielle par le coefficient R2 et, à une deuxième étape, l'évaluation de la valeur GR elle-même.
Fait important, les courbes cumulatives de croissance de la mammosphère peuvent être utilisées pour évaluer l'effet des inhibiteurs de petites molécules ou d'autres médicaments chimiothérapeutiques de façon sélective au niveauCSC 6,11. Contrairement aux mammosphères primaires normales, qui s'épuisent fonctionnellement dans 5-7 passages, les mammosphères de tumeur tendent à se développer indéfiniment. Cette fonctionnalité est liée à la capacité illimitée d'auto-renouvellement du SCC. Les effets sur la prolifération et l'auto-renouvellement de CSC peuvent être découplés par la génération des courbes de croissance de cellules de tumeur et de mammosphere, respectivement. On s'attend à ce qu'un effet spécifique au SCC entraîne une diminution du taux de croissance cumulatif de la mammosphère, avec ou sans effet sur le taux de croissance cumulatif des cellules6,11.
Enfin, un autre domaine d'intérêt est celui de la reprogrammation des tissus adultes SC. Les mammosphères entièrement cultivées se composent d'une population de cellules phénotypiquement hétérogènes, dans laquelle seule une fraction mineure conserve des caractéristiques semblables à des tiges, y compris la capacité d'initiation de la mammosphère et la régénération des glandes mammaires lors de la transplantation in vivo6,9,11,18,19. Les progéniteurs mammaires peuvent ainsi être isolés soit à l'aide d'essais in vitro de rétention d'étiquettes6,9,11 ou, ex vivo, à l'aide de marqueurs de surface établis2,3. Notamment, les progéniteurs mammaires ne survivent pas aux anoikis et sont incapables de former des mammosphères. L'expression forcée de Myc a été montrée pour conférer le potentiel d'initiation de mammosphere aux progéniteurs mammaires isolés comme PKHneg11,ayant pour résultat la génération d'une culture qui peut être passée indéfiniment. De même, l'interférence des régulateurs négatifs de la reprogrammation physiologique peut être testée en utilisant le même essai. Dans ce contexte, une question commune qui peut se poser est le nombre limité d'entrées cellulaires. Si l'entrée cellulaire est inférieure à 10 000 cellules, nous recommandons l'ensemencement dans des plaques de 24 puits (maximum 5 000 cellules viables/mL). Néanmoins, les conditions de culture indépendante d'ancrage peuvent s'avérer trop dures pour la reprogrammation de notation, particulièrement dans les cas où l'effet de reprogrammation n'est pas immédiat. Dans de tels cas, l'utilisation d'une matrice de soutien et des cultures organoïdes tridimensionnelles pourrait être plus appropriée20.
Dans l'ensemble, l'analyse de la mammosphère est une option rentable qui peut être facilement utilisée pour marquer des propriétés semblables à des tiges dans les populations normales et tumorales mec. L'approche quantitative adoptée dans ce protocole facilite les comparaisons entre les cultures réalisées dans des conditions différentes ou exposées à divers stimuli. Lorsqu'il est suivi rigoureusement, il fournit un système de modèle ex vivo relativement simple qui permet le découplage des multiples joueurs qui définissent les propriétés des tiges in vivo, offrant la possibilité d'études mécanistes plus détaillées.

L'isolement et la culture in vitro des cellules épithéliales et progénitrices mammaires sont devenus essentiels pour comprendre leurs propriétés en biologie des cellules mammaires. Des tests élégants de traçage de lignée et de transplantation en série ont permis l'étude des cellules souches (SC) et d'autres sous-ensembles de tissus dans le contexte de leur niche in vivo. Cependant, cette approche prend du temps et nécessite la génération de modèles de souris reporter1,2,3,4,5. Par conséquent, la culture in vitro et la propagation des cellules souches mammaires (MaSC) tout en épargnant les caractéristiques clés de la tige, à savoir l'auto-renouvellement et la capacité de différenciation, est l'un des plus grands défis dans le domaine. Au cours des dernières années, l'analyse de la mammosphère a été largement utilisée pour modéliser à la fois les tissus mammaires normaux et la croissance du cancer du sein, pour quantifier les SC normaux ou cancéreux (SCS) et évaluer leur capacité d'auto-renouvellement en tant que journaliste de substitution de leur activité dans leur contexte in vivo respectif6,7,8,9,10,11.
L'analyse de la mammosphère est une approche efficace et rentable, dans laquelle les cellules épithéliales mammaires fraîchement isolées (MEC) sont cultivées dans des conditions non adhérentes, avec la prémisse que seuls les MaSC survivront et formeront des sphères en suspension tandis que tous les autres types de cellules mourront par anoikis. En outre, la capacité de former plusieurs générations de mammosphères dans des passages en série non adhérents est liée à la capacité d'auto-renouvellement des MaSCs6,9,11. Ici, nous décrivons un protocole détaillé d'un essai quantitatif de mammosphère, qui a été initialement développé par Dontu et collègues7 comme modification de l'essai pionnier de neurosphère12, permettant la croissance des SC putatifs dans des conditions non-adhérentes et sans sérum avec l'addition des facteurs de croissance appropriés7,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 &#956;g. Stock solution 100 &#956;g/&#956;L in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>S17859L0615</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-Bio</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 &#956;g/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td>L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>PharmaTex</td>
			<td>34692032</td>
			<td>Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;g/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SAFCBiosciences</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary epithelial cell growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 &#181;g streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-HEMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 &#176;C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 &#956;m) before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures

La glande mammaire est caractérisée par une capacité de régénération étendue, car il passe par des changements hormonaux massifs tout au long du cycle de vie d'une femelle. Le rôle des cellules souches mammaires (MaSC) est largement étudié à la fois dans le contexte physiologique/développemental et en ce qui concerne la carcinogenèse mammaire. Dans cet aspect, les études ex vivo axées sur les propriétés MaSC sont très recherchées. Les cultures de la mammosphère représentent un substitut de la formation d'organes et sont devenues un outil précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la génération des cultures primaires de mammosphère de murine et la quantitation des propriétés de croissance de MaSC. Le protocole comprend la collecte et la digestion des glandes mammaires, l'isolement des cellules épithéliales mammaires primaires (MEC), l'établissement des cultures de la mammosphère primaire, le passage en série, la quantitation des paramètres de croissance de la mammosphère et l'interprétation des résultats. À titre d'exemple, nous présentons l'effet de l'expression de Myc constitutive de bas niveau sur les MEC normaux menant à l'auto-renouvellement et à la prolifération accrus.

La surexpression de Myc dans les MEC normaux, mène à une fréquence accrue des cellules d'initiation de mammosphere. Ceci est réalisé par un double mécanisme: Myc augmente le taux de divisions symétriques MaSC et la fréquence de la reprogrammation progéniteur dans de nouveaux MaSCs11. Pour tester l'effet de l'expression Myc faible constitutive, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique Rosa26-MycER, dans lequel l'activité Myc peut être induite par 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)15. Nous avons d'abord plaqué les MEC sur des plaques ultra-faibles d'adhérence 6-puits pour enlever les fibroblastes, en l'absence de 4-OHT. Après le premier passage, nous avons divisé la culture en deux : deux puits n'ont pas été traités (contrôle) et deux puits ont été traités avec 200 nM 4-OHT (MycER). Nous avons compté les nombres de sphères et de cellules de 5 passages consécutifs pour trois expériences indépendantes (tableau 1). Les nombres cumulatifs de cellules et de sphères par passage sont indiqués sur le tableau 2. L'induction avec 4-OHT conduit à une augmentation des taux de croissance des sphères et des cellules, comme le montre la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> Figure 1 : Résultats représentatifs. Sphère cumulative (A) et cellules (B) courbes de croissance de contrôle et mammosphères MycER. L'écart moyen et standard de 3 expériences indépendantes sont montrés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1er placage</td>
			<td colspan="3">2ème placage</td>
			<td colspan="3">3ème placage</td>
			<td colspan="3">4ème placage</td>
			<td colspan="3">5ème placage</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Cellules plaquées</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de sphères</td>
			<td>Cellules plaquées</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de sphères</td>
			<td>Cellules plaquées</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de sphères</td>
			<td>Cellules plaquées</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de sphères</td>
			<td>Cellules plaquées</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de sphères</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1 (Exp1)</td>
			<td rowspan="2">Contrôle</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER (En)</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2 (Exp2)</td>
			<td rowspan="2">Contrôle</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER (En)</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3 (Exp3)</td>
			<td rowspan="2">Contrôle</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER (En)</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Nombres de sphères comptées et nombres de cellules plaquées et comptées à chaque passage.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> Tableau 2 : Calcul des nombres de sphères plaquées et des nombres cumulatifs de sphères et de cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. (Clic droit pour télécharger.)</a>

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Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Ici, nous décrivons la mise en œuvre et l'interprétation des résultats d'un essai quantitatif d'auto-renouvellement de la mammosphère in vitro.

Quantification de l'auto-renouvellement dans les cultures de la mammosphère murine

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Ainsi, les cultures de mammosphère fournissent un système moteur facilement accessible pour étudier et disséquer des aspects importants de la normale dans les comportements des cellules souches du sein cancéreuses, y compris leur capacité à se renouveler et à se différencier. Notre approche quantitative vise à évaluer le taux de croissance des cultures de mammosphère d’une manière objective, permettant une comparaison directe des différents types et conditions cellulaires. Pour le premier essai, je conseillerais de garder un contrôle serré sur les temps d’incubation pour éviter une digestion plus et d’assurer un nombre précis de cellules avant chaque placage.Errico D’Elia, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec Charolaise Bull. Après avoir récolté les quatre glandes mammaires abdominales et thoraciques inférieures de 5 à 30, souris femelles âgées de 8 à 10 semaines, placez jusqu’à 20 glandes par boîte de Pétri de 100 millimètres dans un volume minimal de DPBS. Hacher les tissus en petits morceaux et ajouter 10 millilitres de milieu digestif aux fragments.Utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres et sceller le tube avec du film de paraffine. Puis incuber les fragments sur un rotateur à 0,03 X G pendant 2 1/2 heures à 37 degrés et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. À la fin de l’incubation, si tous les fragments peuvent être passés à travers la pointe de pipette P1000, sédimenter la boue tissulaire par centrifugation et décanter soigneusement le surnatant.Suspendez la pastille en 3 millilitres de PBS et filtrez le contenu du tube séquentiellement à travers une passoire cellulaire de 100, 170, 140 micromètres dans un nouveau tube conique, lavant chaque passoire avec 2 millilitres de DPBS frais après chaque filtre. Pelleter les cellules par centrifugation et décanter le supernatant de suspendre les cellules dans le DPBS restant. Mélanger les cellules avec un volume égal de tampon de lyse de potassium chlorure d’ammonium et lyser les globules rouges sur la glace jusqu’à 5 minutes.À la fin de l’incubation, arrêter la lyse avec 10 millilitres de DPBS et recueillir les cellules par centrifugation. Confirmer la présence d’une pastille blanche et suspendre à nouveau la pastille en 1 à 5 millilitres de milieu de mammosphère pour le comptage. Ensuite, plaquez les cellules sur des plaques de puits ultra basses traitées par culture non tissulaire six plaques de puits à une concentration moyenne de 2 x 10 à la cinquième cellules viables par millilitre de concentration moyenne de mammosphère pendant une incubation de 7 à 10 jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.À la fin de la culture de 7 à 10 jours, recueillir les mammosphères primaires de chaque puits de la plaque de culture cellulaire et sédimenter les mammosphères par cérifugation. Après avoir décanté le surnatant, utilisez une pipette P200 avec une pointe filtrée pour pipette les mammosphères environ 100 fois. La génération de patients de cellules simples est essentielle pour la quantification précise de la cellule de mammosphère pour une nouvelle labilité.Inspectez visuellement l’étendue de la ségrégation et utilisez la passoire cellulaire si nécessaire. Suspendre à nouveau les mammosphères dissociées avec 1 à 5 millilitres de milieu de mammosphère fraîche pour compter et plaque 2 X 10 aux quatrièmes cellules viables par millilitre sur l’adhérence ultra faible enrobée de polyhème six plaques de puits pour une culture de 5 à 7 jours. Ensuite, après 5 à 7 jours, compter le nombre de sphères par puits.À la fin de chaque passage, utilisez un appareil photo numérique monté sur un stéréoscope pour scanner toute la surface de tous les puits pour imager les sphères. Après avoir sauvé les images, sous forme de fichiers tif, importez les images stéréoscope comme séquence d’image dans ImageJ et réglez l’échelle et le type d’image en 8 bits. Dupliquez la pile d’images et sélectionnez L’arrière-plan soustraire de l’onglet Processus.Vérifiez l’arrière-plan light et les options paraboloïdes coulissantes et cliquez sur OK pour traiter toutes les images de la pile. Sélectionnez Ajuster et seuilr à partir de l’onglet Image et cliquez sur appliquer. Une fenêtre pop up apparaîtra.Sélectionnez Par défaut comme méthode et lumière comme arrière-plan. Cochez le seuil calculer pour chaque boîte d’images et cliquez sur OK. Pour traiter toutes les images de la pile, sélectionnez Watershed et cliquez sur Oui. Sélectionnez Ouvrir et cliquez sur Oui et sélectionnez Erode et cliquez sur Oui.Ensuite, sélectionnez Analyser les particules du menu Analyser et définissez le seuil de taille minimum à 10 000 micromètres au carré et la circularité entre 0,50 et 1,00. Sélectionnez l’option Ellipses dans le menu Afficher déposer et vérifier Résumer, Exclure sur les bords, et In situ Afficher. Cliquez ensuite sur OK pour traiter toutes les images de la pile.Pour calculer la courbe de croissance cumulative pour chaque passage, enregistrez le nombre de cellules plaquées et le nombre de cellules dans les sphères comptées par puits et calculez la taille de la sphère à la fin de chaque passage. Inférer le nombre de sphères plaquées, en divisant le nombre de cellules plaquées pour chaque passage par la taille de la sphère calculée à la fin du passage précédent. Calculer le nombre cumulatif de cellules pour chaque puits par passage et le nombre cumulatif de sphères pour chaque puits par passage et tracer les points de données sur une échelle semi-logarithmique.Puis une ligne de tendance exponentielle vers les points de données et calculer le coefficient de détermination pour mesurer la bonté de l’ajustement. Ensuite, dépeindre l’équation de la ligne de tendance comme une fonction exponentielle naturelle pour déduire le taux de croissance de la culture. Dans cette expérience, la sphère et le nombre de cellules de cinq passages consécutifs, pour trois expériences indépendantes ont été déterminés.Ici, à la cellule cumulative et numéros de sphère par passage sont affichés. Comme l’a observé l’activation myc, conduit à une augmentation des taux de croissance de la sphère et des cellules. Les points de temps biologiques et pertinents peuvent être sélectionnés pour la collecte cellulaire ou pour effectuer une analyse de l’expression génétique ou d’autres actifs fonctionnels afin d’évaluer la différenciation cellulaire, la migration et l’invasion.Il s’agit d’une approche simple et rentable avec de multiples applications. Par exemple, il peut être utilisé dans la découverte directe pour mesurer les effets sur la prolifération des cellules souches cancéreuses et l’auto-renouvellement.

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Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence