Name: quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00
Duration: 7 min 40 s
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हम Rosa26-MycER ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के तरह उपहार के लिए ब्रूनो अमती शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को WWCR, AIRC, ईआरसी, और इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय से P.G.P. T.V. और X.A. से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था FIRC और एएस द्वारा एक FUV अनुदान द्वारा समर्थित थे ।

<ol>
	<li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell.">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>van Amerongen, R., Bowman, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).</li><li>Pece, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140 (1), 62-73 (2010).</li><li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem/progenitor+cell+properties.">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li><li>Santoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Loss+in+Breast+Cancer+Leads+to+Myc+Activation,+Increased+Cell+Plasticity,+and+Expression+of+a+Mitotic+Signature+with+Prognostic+Value.">p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value.</a> Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).</li><li>Reynolds, B. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Tracking+of+Breast+Cancer+Cells+Enables+Prediction+of+Sphere+Formation+from+Early+Cell+Divisions.">Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions.</a> iScience. 8, 29-39 (2018).</li><li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines.">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells:+a+mathematical+model+and+experiment.">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP/TAZ.">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यहां, हम विट्रो में MaSC विकास गुणों के मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य मूत्र मैट्रिक्स पर निम्न स्तर के संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण को विभिन्न संदर्भों पर समान रूप से लागू किया जा सकता है । मानव या मूत्र प्राथमिक कोशिकाओं, साथ ही स्थापित सेल लाइनों, मैमोस्फीयर संस्कृतियों है कि क्रमिक रूप से पारित किया जा सकता है स्थापित करने के लिए स्वतंत्र परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है । जीन अतिअभिव्यक्ति और आरएनए हस्तक्षेप आसानी से पहले मार्ग के अंत में एक वायरल ट्रांसड्यूक्शन कदम के अलावा (चरण ३.५ के बाद) के साथ प्रोटोकॉल में पेश किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को आसंजन में संक्रमित किया जा सकता है और फिर मैमोस्फीयर के रूप में चढ़ाया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत परख का एक महत्वपूर्ण पहलू सीडिंग सेल घनत्व है, जो16,17के परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप करने वाले समग्र ों की पीढ़ी से बचने के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए। इस अस्पष्टता को हल करने के लिए मैमोस्फीयर की आकृति विज्ञान जानकारीपूर्ण हो सकती है। प्रत्येक मार्ग के अंत में केवल कॉम्पैक्ट, गोल क्षेत्रों की गणना की जानी चाहिए। स्फेरॉइड और आकार दोनों की परिपत्रता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। डीआईए की स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग करके, यह कदम उचित थ्रेसहोल्ड के साथ एक उद्देश्य और पूर्ण तरीके से सुनिश्चित किया जाता है। अक्सर, जनक एसीनार संरचनाएं या कोशिकाओं के छोटे समूह बनाएंगे जिन्हें मैमोस्फीयर की गिनती से बाहर रखा जाना चाहिए। अंगूठे के नियम के रूप में, हम 100 माइक्रोन व्यास की सीमा का उपयोग करते हैं। अंत में, एक मार्ग से अगले तक अक्षुण्ण या गैर-पूरी तरह से विसोसिएट मैमोप्सेरे के हस्तांतरण से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। दूसरी ओर, अतिरिक्त पाइपिंग से सेल डेथ बढ़ जाएगी। इस प्रकार, यदि ऐसी कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, तो हम हल्के ट्राइप्सिनाइजेशन या एक्यूटेज उपचार का उपयोग करने और एकल-कोशिका निलंबन की पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए 40 माइक्रोन छलनी के माध्यम से विसोशिएट क्षेत्रों को पारित करने की सलाह देते हैं।
मैमोस्फीयर संस्कृतियों में एससी या सीएससी क्वांटेशन पूर्व वीवो के लिए सरोगेट के रूप में, क्षेत्र बनाने दक्षता (SFE) का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया गया है। SFE वास्तव में एक दिए गए सेल आबादी में स्टेम की तरह कोशिकाओं का एक उपाय है । हालांकि, यह एक कम कर्तव्यनिष्ठ दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह केवल अलग समय बिंदुओं पर जानकारी प्रदान करता है। संचयी क्षेत्र संख्या ओं की गणना और संचयी विकास घटता की पीढ़ी, इसके बजाय, प्रारंभिक सेल सीडिंग चरण से संस्कृति की विकास दर के अनुमान को सक्षम बनाती है जब तक कि संस्कृति निकास या अमर संस्कृतियों के मामले में, मार्ग की वांछित संख्या के लिए। विकास गुणों का मूल्यांकन गुणांक आर2 के माध्यम से घातीय वृद्धि से विचलन के मूल्यांकन की अनुमति देता है और, दूसरे चरण में, जीआर मूल्य का मूल्यांकन ही।
महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएससी स्तर6,11पर छोटे अणु अवरोधकों या अन्य कीमोथेरेपी दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि घटता का उपयोग किया जा सकता है। सामान्य प्राथमिक मैमोस्फीयर के विपरीत, जो कार्यात्मक रूप से 5-7 मार्ग में निकास करते हैं, ट्यूमर मैमोस्फीयर अनिश्चित काल तक विस्तार करते हैं। यह फीचर अनलिमिटेड सीएससी सेल्फ रिन्यूअल एबिलिटी से जुड़ा हुआ है। प्रसार और सीएससी आत्म नवीकरण पर प्रभाव क्रमशः ट्यूमर सेल और मैमोस्फीयर विकास घटता की पीढ़ी के माध्यम से अयुग्मित किया जा सकता है । सीएससी-विशिष्ट प्रभाव के परिणामस्वरूप संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि दर में कमी आने की संभावना है, जो संचयी कोशिका वृद्धि दर6,11पर प्रभाव के साथ या बिना प्रभाव के है ।
अंत में, ब्याज का एक और क्षेत्र वयस्क ऊतक अनुसूचित जाति पुनर्प्रोग्रामिंग में से एक है। पूरी तरह से विकसित मैमोस्फीयर में एक फेनोआमतौर पर विषम कोशिका आबादी होती है, जिसमें केवल एक छोटा सा अंश स्टेम जैसी विशेषताओं को बरकरार रखता है, जिसमें मैमोस्फीयर-शुरू करने की क्षमता और वीवो6,9,11,18,19में प्रत्यारोपण पर मैममैरी ग्रंथि उत्थान शामिल है। मैमेरी प्रोजेनिटर्स को स्थापित सतह मार्कर2,3का उपयोग करके या तो इन विट्रो लेबल-रिटेनिंग परख6,9,11 या, पूर्व वीवो का उपयोग करके अलग-थलग किया जा सकता है। विशेष रूप से, मैममैरी जनक एनोइकिस जीवित नहीं रहते हैं और मैमोस्फीयर बनाने में असमर्थ होते हैं। लागू Myc अभिव्यक्ति को PKHneg11के रूप में अलग मैममैरी जनक ों को मैमोस्फीयर दीक्षा क्षमता प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एक संस्कृति की पीढ़ी है जिसे अनिश्चित काल के लिए पारित किया जा सकता है। इसी तरह, एक ही परख का उपयोग करके शारीरिक पुनर्प्रोग्रामिंग के नकारात्मक नियामकों के हस्तक्षेप का परीक्षण किया जा सकता है। इस संदर्भ में, एक आम मुद्दा जो उत्पन्न हो सकता है वह है सेल इनपुट की सीमित संख्या। यदि सेल इनपुट 10,000 कोशिकाओं से कम है, तो हम 24-अच्छी प्लेटों (अधिकतम 5,000 व्यवहार्य कोशिकाओं/mL) में सीडिंग की सलाह देते हैं। फिर भी, एंकोरेज स्वतंत्र संस्कृति की स्थिति को पुनर्प्रोग्रामिंग स्कोरिंग के लिए बहुत कठोर साबित किया जा सकता है, खासकर उन मामलों में जहां रीप्रोग्रामिंग प्रभाव तत्काल नहीं है। ऐसे मामलों में, सहायक मैट्रिक्स और 3-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग20अधिक उपयुक्त हो सकता है।
कुल मिलाकर, मैमोस्फीयर परख एक लागत प्रभावी विकल्प है जिसे सामान्य और ट्यूमर एमईसी आबादी में स्टेम जैसे गुणों को स्कोरिंग के लिए आसानी से नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में लिया गया मात्रात्मक दृष्टिकोण विभिन्न परिस्थितियों में किए गए संस्कृतियों के बीच तुलना की सुविधा प्रदान करता है या विविध उत्तेजनाओं के संपर्क में आता है। जब कड़ाई से पीछा किया जाता है, तो यह एक अपेक्षाकृत सरल पूर्व वीवो मॉडल प्रणाली प्रदान करता है जो कई खिलाड़ियों को अनयुग्मन की अनुमति देता है जो वीवो में स्टेम गुणों को परिभाषित करते हैं, जो अधिक विस्तृत मशीनिस्ट अध्ययन की संभावना प्रदान करते हैं।

मैममैरी सेल जीव विज्ञान में उनके गुणों को समझने के लिए अलगाव और मैममैरी एपिथेलियल स्टेम और प्रोजेनिटर कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति आवश्यक हो गई है। सुरुचिपूर्ण वंश अनुरेखण और धारावाहिक प्रत्यारोपण परखों ने वीवो आला में उनके संदर्भ में स्टेम सेल (एससी) और अन्य ऊतक सबसेट के अध्ययन को सक्षम किया है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला है और इसके लिए रिपोर्टर माउस मॉडल1,2,3,4,5की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इसलिए, इन विट्रो संस्कृति और मैमेरी स्टेम सेल (MaSCs) के प्रचार, जबकि प्रमुख स्टेमनेस सुविधाओं, अर्थात् आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता बख्शते, क्षेत्र में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है । पिछले वर्षों में, मैमोस्फीयर परख का व्यापक रूप से सामान्य स्तन ऊतक और स्तन कैंसर के विकास को मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया है, सामान्य या कैंसर एससी (सीएससी) की मात्रा निर्धारित करने और वीवो संदर्भ6,7,8, 9,10,11में अपनी गतिविधि के सरोगेट रिपोर्टर के रूप में उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए।
मैमोस्फीयर परख एक कुशल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है, जिसमें हौसले से अलग-थलग मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) को गैर-अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, इस आधार के साथ कि केवल मैट्रिक्स जीवित रहेंगे और निलंबन में क्षेत्र बनाएंगे जबकि अन्य सभी सेल प्रकार एनोइकिस द्वारा मर जाएंगे। इसके अलावा, धारावाहिक गैर-अनुयायी मार्ग में मैमोस्फीयर की कई पीढ़ियों को बनाने की क्षमता एमएएससी6,9,11की आत्म-नवीकरण क्षमता से संबंधित है। यहां, हम एक मात्रात्मक मैमोस्फीयर परख के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसे शुरू में डोन्टू औरसहयोगियों द्वारा अग्रणी न्यूरोस्फीयर परख12के संशोधन के रूप में विकसित किया गया था, जो उचित विकास कारकों7,12के अलावा गैर-अनुयायी, सीरम-मुक्त स्थितियों में ख्यात अनुसूचित जाति के विकास को सक्षम करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 &#956;g. Stock solution 100 &#956;g/&#956;L in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>S17859L0615</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-Bio</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 &#956;g/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td>L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>PharmaTex</td>
			<td>34692032</td>
			<td>Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;g/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SAFCBiosciences</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary epithelial cell growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 &#181;g streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-HEMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 &#176;C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 &#956;m) before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures

स्तन ग्रंथि व्यापक उत्थान क्षमता की विशेषता है, क्योंकि यह एक महिला के जीवन चक्र में बड़े पैमाने पर हार्मोनल परिवर्तन के माध्यम से चला जाता है । स्तन स्टेम कोशिकाओं (MaSCs) की भूमिका व्यापक रूप से दोनों शारीरिक/विकासात्मक संदर्भ में और स्तन कैंसरजन्य के संबंध में अध्ययन किया जाता है । इस पहलू में, एमएएससी गुणों पर केंद्रित पूर्व वीवो अध्ययन अत्यधिक मांग के बाद किए जाते हैं। मैमोस्फीयर संस्कृतियां अंग गठन के किराए का प्रतिनिधित्व करती हैं और बुनियादी और अनुवाददोनों अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गई हैं। यहां, हम मूत्र प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की पीढ़ी और MaSC विकास गुणों की मात्रा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल में मैमेरी ग्रंथि संग्रह और पाचन, प्राथमिक मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) का अलगाव, प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की स्थापना, धारावाहिक पासिंग, मैमोस्फीयर विकास मापदंडों की मात्रा और परिणामों की व्याख्या शामिल है। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य एमसीसी पर निम्न स्तर की संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं जिससे आत्म-नवीकरण और प्रसार में वृद्धि होती है ।

सामान्य एमसीसी में Myc अतिअभिव्यक्ति, मैमोस्फीयर शुरू कोशिकाओं की आवृत्ति में वृद्धि की ओर जाता है। यह एक डबल तंत्र के माध्यम से प्राप्त किया जाता है: Myc MaSC सममित डिवीजनों की दर और नए MaSCs11में जनक पुनर्प्रोग्रामिंग की आवृत्ति बढ़ जाती है । कम संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने Rosa26-MycER ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग किया, जिसमें Myc गतिविधि को 4-हाइड्रोक्सीटैमोक्सिफेन (4-OHT)15द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। हमने पहले 4-OHT की अनुपस्थिति में फाइब्रोब्लास्ट को हटाने के लिए अल्ट्रा-कम आसंजन 6-अच्छी प्लेटों पर एमईसी चढ़ाया। पहले मार्ग के बाद, हम दो में संस्कृति विभाजित: दो कुओं अनुपचारित रखा गया (नियंत्रण) और दो कुओं २०० एनएम 4-OHT (MycER) के साथ इलाज किया गया । हमने तीन स्वतंत्र प्रयोगों(तालिका 1)के लिए लगातार 5 मार्गके क्षेत्र और सेल नंबरों की गणना की। प्रति मार्ग संचयी कोशिका और गोला की संख्या तालिका 2पर दिखाई जाती है । 4-OHT के साथ प्रेरण क्षेत्र और सेल वृद्धि दर में वृद्धि की ओर जाता है, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> चित्रा 1: प्रतिनिधि परिणाम। संचयी क्षेत्र(ए)और सेल(बी)नियंत्रण और MycER मैमोस्फीयर के विकास घटता है। 3 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब और मानक विचलन दिखाया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">पहली चढ़ाना</td>
			<td colspan="3">दूसरा चढ़ाना</td>
			<td colspan="3">तीसरी चढ़ाना</td>
			<td colspan="3">चौथी चढ़ाना</td>
			<td colspan="3">5वीं चढ़ाना</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>कोशिकाओं चढ़ाया</td>
			<td>सेल काउंट</td>
			<td>गोला गिनती</td>
			<td>कोशिकाओं चढ़ाया</td>
			<td>सेल काउंट</td>
			<td>गोला गिनती</td>
			<td>कोशिकाओं चढ़ाया</td>
			<td>सेल काउंट</td>
			<td>गोला गिनती</td>
			<td>कोशिकाओं चढ़ाया</td>
			<td>सेल काउंट</td>
			<td>गोला गिनती</td>
			<td>कोशिकाओं चढ़ाया</td>
			<td>सेल काउंट</td>
			<td>गोला गिनती</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1</td>
			<td rowspan="2">नियंत्रण</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2</td>
			<td rowspan="2">नियंत्रण</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3</td>
			<td rowspan="2">नियंत्रण</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1: प्रत्येक मार्ग पर गिने गए और गिने जाने वाले कोशिकाओं की संख्या और गणना किए गए क्षेत्रों की संख्या।
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> तालिका 2: चढ़ाया क्षेत्र संख्या और संचयी क्षेत्र और सेल संख्या की गणना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)</a>

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Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

यहां, हम एक इन विट्रो मैमोस्फीयर आत्म-नवीकरण मात्रात्मक परख के परिणामों के कार्यान्वयन और व्याख्या का वर्णन करते हैं।

मिमूत्र मैमोस्फीयर संस्कृतियों में आत्म-नवीकरण का परिमाणीकरण

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

तो मैमोस्फीयर संस्कृतियों का अध्ययन करने और कैंसर स्तन स्टेम सेल व्यवहार में सामांय के महत्वपूर्ण पहलुओं विच्छेदन करने के लिए एक आसानी से सुलभ मोटर प्रणाली प्रदान करते हैं, उनके आत्म नवीनीकृत करने के लिए और अंतर करने की क्षमता भी शामिल है । हमारे मात्रात्मक दृष्टिकोण का उद्देश्य एक उद्देश्य तरीके से मैमोस्फीयर संस्कृतियों की बढ़ती दर का मूल्यांकन करना है, जिससे विभिन्न सेल प्रकारों और शर्तों की सीधी तुलना की अनुमति दी जा सके । पहले परीक्षण के लिए, मैं पाचन पर से बचने के लिए और प्रत्येक चढ़ाना से पहले एक सटीक सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेशन समय पर एक तंग नियंत्रण रखने की सलाह होगी ।Charolaise बैल के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन Errico डी ' Elia, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा । 5 से 30, 8 से 10 सप्ताह पुरानी मादा चूहों से चार पेट और निचले छाती मैमोरी ग्रंथियों की कटाई के बाद, डीपीबीएस की न्यूनतम मात्रा में प्रति 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में 20 ग्रंथियों तक रखें। ऊतकों को छोटे टुकड़ों में कीमा बना लें और टुकड़ों में पाचन माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।ऊतक के टुकड़ों को 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करने और पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूब को सील करने के लिए 25 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। फिर 0.03 X G पर एक रोटेटर पर टुकड़ों को 37 डिग्री पर 2 1/2 घंटे और आर्द्रता के साथ 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, यदि सभी टुकड़ों को P1000 पिपेट टिप के माध्यम से पारित किया जा सकता है, तो अपकेंद्रित्र द्वारा ऊतक घोल को तलछट करें और सुपरनेट को सावधानीपूर्वक डिकंट करें।पीबीएस के 3 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और ट्यूब सामग्री को क्रमिक रूप से एक 100, 170, 140 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से एक नई शंकु नली में फ़िल्टर करें, प्रत्येक फिल्टर के बाद 2 मिलीलीटर ताजा डीपीबीएस के साथ प्रत्येक छलनी को धोएं। अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली दें और शेष डीपीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने वाले सुपरनैंट को डिकेंट करें। कोशिकाओं को अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम लाइसिस बफर की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं और लाल रक्त कोशिकाओं को बर्फ पर 5 मिनट तक के लिए लाइसे करें।इनक्यूबेशन के अंत में, लिसिस को डीपीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ गिरफ्तार करें और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करें। एक सफेद गोली की उपस्थिति की पुष्टि करें और गिनती के लिए मैमोस्फीयर माध्यम के 1 से 5 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% डाइऑक्साइड कार्बन पर 7 से 10 दिन इनक्यूबेशन के लिए मैमोस्फीयर मध्यम एकाग्रता के मिलीलीटर के लिए पांचवें व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए एक 2 x 10 पर अल्ट्रा कम आसंजन छह अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज गैर-ऊतक संस्कृति पर कोशिकाओं को प्लेट करें।7 से 10 दिन की संस्कृति के अंत में, सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं से प्राथमिक मैमोस्फीयर एकत्र करें और सेट्रिफ्यूगेशन द्वारा मैमोस्फीयर को तलछट करें। सुपरनैंट को डिकंट करने के बाद, लगभग 100 बार मैमोस्फीयर को पिपेट करने के लिए फ़िल्टर टिप के साथ एक P200 पिपेट का उपयोग करें। एकल कोशिकाओं के रोगियों की पीढ़ी नई लेबिलिटी के लिए मैमोस्फीयर सेल के सटीक मात्राकरण के लिए महत्वपूर्ण है।नेत्रहीन अलगाव की सीमा का निरीक्षण और यदि आवश्यक हो तो सेल छलनी का उपयोग करें। गिनती के लिए ताजा मैमोस्फीयर माध्यम के 1 से 5 मिलीलीटर के साथ असंबद्ध मैमोस्फीयर को फिर से निलंबित करें और प्लेट 2 X 10 पॉलीहेमा लेपित अल्ट्रा कम आसंजन छह अच्छी प्लेटों पर मिलीलीटर के लिए चौथे व्यवहार्य कोशिकाओं को एक 5 से 7 दिन की संस्कृति के लिए । फिर, 5 से 7 दिनों के बाद, प्रति अच्छी तरह से गोले की संख्या गिनें।प्रत्येक मार्ग के अंत में, क्षेत्रों की छवि के लिए सभी कुओं की पूरी सतह को स्कैन करने के लिए एक स्टीरियोस्कोप पर घुड़सवार एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करें। छवियों को सहेजने के बाद, tif फ़ाइलों के रूप में, इमेजजे में एक छवि अनुक्रम के रूप में स्टीरियोस्कोप छवियों का आयात करें और पैमाने और छवि के प्रकार को 8-बिट पर सेट करें। छवियों के ढेर को डुप्लिकेट करें और प्रोसेस टैब से घटाना पृष्ठभूमि चुनें।लाइट बैकग्राउंड और स्लाइडिंग पैराबोलॉयड विकल्पों की जांच करें और स्टैक की सभी छवियों को संसाधित करने के लिए ओके पर क्लिक करें। इमेज टैब से एडजस्ट और थ्रेसहोल्ड चुनें और क्लिक करें। एक पॉप अप विंडो दिखाई देगी।पृष्ठभूमि के रूप में विधि और प्रकाश के रूप में डिफ़ॉल्ट का चयन करें। प्रत्येक इमेज बॉक्स के लिए गणना सीमा देखें और ओके पर क्लिक करें। स्टैक में सभी छवियों को संसाधित करने के लिए, वाटरशेड का चयन करें और हां पर क्लिक करें। ओपन चुनें और हां क्लिक करें और इरोड का चयन करें और हां पर क्लिक करें।इसके बाद, विश्लेषण मेनू से कणों का विश्लेषण करें और न्यूनतम आकार सीमा 10, 000 माइक्रोमीटर चुकता और 0.50 और 1.00 के बीच परिपत्रता निर्धारित करें। शो ड्रॉप डाउन मेनू से विकल्प एलिप्सेस का चयन करें और सारांश की जांच करें, किनारों पर बाहर करें, और सीटू शो में। फिर स्टैक की सभी छवियों को संसाधित करने के लिए ओके पर क्लिक करें।प्रत्येक मार्ग के लिए संचयी विकास वक्र की गणना करने के लिए प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या और क्षेत्रों में कोशिकाओं की संख्या को अच्छी तरह से गिना जाता है और प्रत्येक मार्ग के अंत में क्षेत्र के आकार की गणना करता है। पिछले मार्ग के अंत में गणना किए गए क्षेत्र आकार द्वारा प्रत्येक मार्ग के लिए चढ़ाया जाने वाली कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके, चढ़ाया क्षेत्रों की संख्या का अनुमान लगाना। प्रत्येक मार्ग के प्रति अच्छी तरह से संचयी सेल संख्या और प्रत्येक मार्ग के लिए संचयी क्षेत्र संख्या की गणना करें और अर्ध-लॉगरिथम पैमाने पर डेटा अंकों को प्लॉट करें।फिर डेटा बिंदुओं के लिए एक घातीय प्रवृत्ति रेखा और फिट की अच्छाई को मापने के लिए दृढ़ संकल्प के गुणांक की गणना करें। फिर संस्कृति की विकास दर का अनुमान लगाने के लिए एक प्राकृतिक घातीय कार्य के रूप में प्रवृत्ति रेखा के समीकरण को चित्रित करें। इस प्रयोग में, तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए लगातार पांच मार्ग के क्षेत्र और सेल संख्या निर्धारित की गई थी ।यहां संचयी सेल और प्रति मार्ग क्षेत्र संख्या दिखाई जाती है। जैसा कि देखा गया Myc सक्रियण, क्षेत्र और सेल विकास दर में वृद्धि की ओर जाता है। कोशिका अंतर, प्रवासन और आक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए जैविक और प्रासंगिक समय बिंदुओं को सेल संग्रह के लिए या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण या अन्य कार्यात्मक परिसंपत्तियों के प्रदर्शन के लिए चुना जा सकता है।यह कई अनुप्रयोगों के साथ एक सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है। उदाहरण के लिए, यह कैंसर स्टेम सेल प्रसार और आत्म नवीकरण पर प्रभाव को मापने के लिए सीधी खोज में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए Organotypic स्लाइस संस्कृति

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

छत संस्कृतियों में परिपक्व एडिपोसाईट की Dedifferentiation के माध्यम से मानव वसा स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Hematopoietic सेल की स्वचालित मात्रा - Undecalcified अस्थि के histological छवियाँ में stromal सेल सहभागिता

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Colonic स्टेम सेल म्यूटेशन की मात्रा

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

चूहा Oligodendrocyte पूर्वज संस्कृति की तैयारी और Oligodendrogenesis की मात्रा दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग का उपयोग

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional विश्लेषण की नवजात आरएनए मछली द्वारा<em&gt; Vivo</em&gt; ट्रोफोब्लास्ट विशाल कोशिकाओं या<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Ectoplacental कोन Explants के लघु अवधि के संस्कृति

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की तीन आयामी Organotypic संस्कृतियों

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...