Name: quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures at JoVE.com

Ringraziamo Bruno Amati per il gentile regalo del modello murino transgenico Rosa26-MycER. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni di WWCR, AIRC, CER, e il Ministero della Salute italiano a P.G.P. T.V. e X.A. sono stati sostenuti da FIRC e A.S. da una sovvenzione FUV.

Le procedure in vivo sono state eseguite in conformità alla direttiva UE 2010/63 e dopo l'approvazione del nostro comitato etico istituzionale (Organism per il benessere animale--OPBA) e del Ministero della Salute italiano (IACUC Numbers 762/2015 e 537/2017).
1. Collezione Murine Mammary Gland e Digestione
<ol><li>Per un esperimento tipico, sacrificare 8-10 topi vergine di età fino all'età di 8-10 settimane per inalazione di CO2. A seconda degli obiettivi dell'esperimento, utilizzare 5-30 topi. Posizionare i topi sulle tavole di dissezione sotto un cappuccio. Utilizzare gli aghi per allungare gli arti anteriori e lavare la pelliccia dell'animale con etanolo.</li>
	<li>Sollevare la pelle con pinze ed eseguire un'incisione verticale a partire dal livello dell'area pelvica e muovendosi fino alla cervice, lasciando intatto il peritoneo. Per evitare di rottura della pelle o del peritoneo, utilizzare forbici rotonde.</li>
	<li>Staccare con attenzione la pelle dal corpo con movimenti delicati delle forbici attraverso l'asse laterale del corpo.</li>
	<li>Una volta che la pelle è completamente staccata dalla zona toracica e addominale, eseguire quattro incisioni attraverso i quattro arti dell'animale e pin giù la pelle con aghi. Utilizzare le forbici e le pinze per staccare completamente il corpo dell'animale dalla pelle estesa.</li>
	<li>Utilizzare le pinze per sollevare delicatamente i cuscinetti di grasso mammario che sono ora completamente esposti e staccarli con attenzione dalla pelle con l'aiuto delle forbici. Raccogliere le ghiandole mammarie toraciche e addominali inferiori di ogni topo e immergerle nella salina tamponata di fosfato di Dulbecco (DPBS), in un tubo conico da 50 mL. Raccogliere fino a 20 ghiandole per tubo. Tenere i tessuti sul ghiaccio. NOT:</</c1> Se necessario, le ghiandole possono rimanere sul ghiaccio durante la notte. Questo è un punto di sosta sicuro. I passaggi seguenti devono essere eseguiti in condizioni sterili.</li>
	<li>Preparare e filtrare il supporto di digestione: il mezzo dell'Aquila (DMEM) modificato di Dulbecco integrato con 2 mM di glutammina, 100 U/mL penicillina, 100 streptomici, 200 collagenase U/mL e 100 g/mL di hyaluronidase (vedi Tabella dei Materiali).</li>
	<li>Trasferire fino a 20 ghiandole in un piatto Petri da 100 mm e tritare il tessuto utilizzando un bisturi o forbici curve. Evitare di trasferire grandi volumi di DPBS al piatto.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di mezzo di digestione per ogni piatto Petri e trasferire il tessuto macinato in un tubo conico da 50 mL, utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL.</li>
	<li>Sigillare i tubi con parafilm e posizionarli su un rotatore. Impostare il rotatore a bassa velocità (0,03 x g)e incubare per 2,5 h a 37 gradi in un'atmosfera umida contenente il 5% di CO2.</li>
	<li>Ispezionare visivamente la sospensione prima di procedere alle fasi successive. Se grandi pezzi di tessuto rimangono non digeriti, prolungare l'incubazione a 37 gradi centigradi per altri 30 min. NOT:</</c5> In alternativa, la digestione può essere eseguita durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2, utilizzando un delicato mix di enzimi collagenasi/ialurionidasi13.</li>
</ol>2. Isolamento dei MEC primari Murine
<ol><li>Fermare il rotatore e rimuovere i tubi dall'incubatrice. Regolare una punta P1000 all'apertura di una pipetta sierologica da 5 mL. Se la sospensione passa attraverso la mancia P1000, procedere con i passaggi successivi. In caso contrario, prolungare l'incubazione a 37 gradi centigradi per altri 30 min.</li>
	<li>Centrifuga a 100 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Decant decant con attenzione il supernatante e respendere il pellet di ogni tubo in 3 mL di DPBS. NOT:</</c1> La bassa velocità di centrifugazione consente la rimozione di linfociti e cellule del tessuto adiposo. È necessaria una manipolazione delicata per evitare di dislocare il pellet in questa fase.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare in ogni tubo separatamente, utilizzando ceppi cellulari da 100, 70 e 40 m. Ad ogni fase di filtrazione, lavare i ceppi con 2 mL di DPBS prima di raccogliere il pass-through. NOT:</</c2> Da questo punto in poi, le sospensioni cellulari possono essere raggruppate ed elaborate insieme.</li>
	<li>Centrifuga a 300 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Decant con attenzione il supernatante e respendere le cellule nel volume rimanente di DPBS.</li>
	<li>Procedere al lisi dei globuli rossi (RBC) aggiungendo un volume uguale di buffer di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare pipettando e incubare sul ghiaccio per un massimo di 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di DPBS e centrifugare a 300 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Decant decant attentamente il supernatante e ispezionare visivamente il pellet. Se il pellet è bianco, procedere al passaggio successivo. In caso contrario, ripetere il passaggio di lisi RBC (passaggio 2.5).</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1-5 mL di supporti mammosphere: crescita delle cellule epiteliali mammarie basale medium (MEBM), integrato con 2 mM di glutammina, 100 U/mL penicillina, 100 g/mL streptomicina, 5 g/mL di insulina, 0,5 g/mL di idrocortisone, 2% B27, 20 fattore di crescita epiderlica ng/mL (EGF), 20 ng/mL fattore di crescita base del fibroblasto (bFGF) e 0,4U/mL heparin . </li>
</ol>3. Serial Mammosphere Re-plating
<ol><li>Per la creazione di colture di mammosfera, placcare le cellule su colture non tissutali trattate (adesione ultra-bassa) 6 pozzea ad una densità di 200.000 cellule/mL vitali nel mezzo mammosfera. Incubare le cellule per 7-10 giorni a 37 , 5% CO2.</li>
	<li>Preparare e filtrare l'1% della soluzione poli-HEMA nel 95% di etanolo (vedere Tabella dei materiali). Cappotto ultra-basso adesione 6-pozzetti per i seguenti passaggi, aggiungendo 400 L di 1% soluzione poli-HEMA per pozzo e permettendo l'etanolo ad asciugare completamente. Per ottenere risultati migliori, ripetere il rivestimento due volte. NOT:</</c2> L'uso di piastre non rivestite durante il primo passaggio consente la rimozione selettiva dei fibroblasti dalla coltura.</li>
	<li>Alla fine della coltura di 7-10 giorni, raccogliere le mammosfere primarie da tutti i pozzi e centrifugare a 300 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Decant con attenzione il supernatante e procedere alla dissociazione meccanica delle mammosfere utilizzando una pipetta P200 con punte filtrate. Pipetta per circa 100 volte e ispezionare visivamente le sospensioni per la presenza di grandi sferoidi. NOT:</</c4> Una breve incubazione (2-5 min) del pellet sfera in un volume basso (0,2-0,5 mL) di trypsin o Accutase a 37 gradi centigradi, 5% CO2, può essere utilizzata per facilitare la dissociazione meccanica. Preparare il mezzo di mammosfera fresco (passaggio 2.7) per la placcatura di ogni passaggio.</li>
	<li>Risospendere in 1-5 mL di mammosfera fresca media e contare le cellule vitali. Se applicabile, dividere le cellule in gruppi di trattamento o condizioni di coltura.</li>
	<li>Piastra 20.000 cellule vitali/mL su adere ultra-bassa rivestita poli-HEMA 6 pozze mobili e incubare a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. NOT:</</c7> Le mammosfere raggiungono la loro dimensione massima entro 5-7 giorni dopo la placcatura cellulare. Quando possibile, distribuire le celle di ogni campione o condizione a più pozzi per ottenere repliche tecniche. La densità di placcatura deve essere mantenuta bassa per evitare l'aggregazione delle cellule. Un massimo di 20.000 cellule / mL è raccomandato per piastre 6-well e 5,000 cellule / mL per piastre 24-well.</li>
	<li>Dopo 5-7 giorni, contare il numero di sfere per pozzo. Questo può essere fatto sia manualmente, utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo di ingrandimento 10x, o utilizzando l'analisi digitale delle immagini (vedi passo 4).</li>
	<li>Raccogliere le mammosfere di ogni pozzo separatamente e centrifugare a 300 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Decant con attenzione il supernatante e procedere alla dissociazione meccanica delle mammosfere utilizzando una pipetta P200 con punte filtrate. Pipetta per circa 100 volte e ispezionare visivamente le sospensioni per la presenza di grandi sferoidi.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di mammosfera media fresca e contare le cellule vitali. Raggruppare le celle di ogni campione o condizione e ripetere i passaggi da 3,6 a 3,10. Registrare il numero di celle placcate e il numero di sfere e celle conteggiate per ogni passaggio. Procedere al passaggio 5 per il calcolo della crescita cumulativa.</li>
</ol>4. Enumerazione sfera utilizzando digital Image Analysis (DIA)
<ol><li>Alla fine di ogni passaggio, scansiona l'intera superficie di tutti i pozzi e acquisisci immagini delle sfere utilizzando una fotocamera digitale montata su uno stereoscopio. Salvare le immagini come file .tif.</li>
	<li>Importare le immagini dello stereoscopio come sequenza di immagini utilizzando ImageJ14. Impostare la scala e il tipo di immagine su 8 bit.</li>
	<li>Duplicare la pila di immagini e selezionare Sottrai sfondo dalla scheda Processo nella barra dei menu. Controllare le opzioni Sfondo chiaro e paraboloide scorrevole e fare clic sul pulsante OK. Elaborare tutte le immagini della pila.</li>
	<li>Selezionare Regola, quindi Soglia dalla scheda Immagine della barra dei menu. Facendo clic su Applica, verrà visualizzata una finestra di dialogo intitolata Converti pila in binario. Selezionare Predefinito come metodo e Luce come sfondo. Selezionare la casella Calcola soglia per ogni immagine e fare clic sul pulsante OK.</li>
	<li>Selezionare in sequenza i comandi Watershed, Open ed Erode dall'elenco Binario nella scheda Processo della barra dei menu. Elaborare tutte le immagini della pila facendo clic sul pulsante Sì della finestra di dialogo visualizzata. NOT:</</c22> Questi processi consentono la segmentazione visiva di oggetti che toccano, levigano gli oggetti e la rimozione dei pixel dal bordo degli oggetti.</li>
	<li>Selezionare la funzione Analizza particelle dal menu Analizza. Impostare la soglia della dimensione minima a 10.000 m2 e la circolarità compresa tra 0,50 e 1,00. Selezionare l'opzione Ellissi dal menu a discesa Mostra. Controllare Riepiloga, Escludi sui bordi e In situ Mostra e fare clic sul pulsante OK. Elaborare tutte le immagini della pila.</li>
	<li>Ispezionare visivamente la corrispondenza delle ellissi con le sfere e, se necessario, correggere il conteggio delle particelle di conseguenza. Sommare i conteggi da tutti i fotogrammi di ogni pozzo per ottenere il conteggio totale di mammosfere per pozzo.</li>
</ol>5. Calcolo cumulativo della curva di crescita
 NOT:</</c0> Il numero di mammosfere contate in ogni pozzo alla fine di ogni passaggio (PN) riflette il numero di cellule che iniziano la mammosfera semina all'inizio di PN.
<ol><li>Per ogni passaggio (PN),registrare il numero di celle placcate e il numero di celle e sfere contate per pozzo. Calcolare la dimensione della sfera alla fine di ogni passaggio: dimensione della sfera PN (cellule / sfera) - le cellule contate PN / sfere contate PN NOT:</</c4> La dimensione della sfera a PN è una misura del potenziale proliferativo di ogni cella di mammosfera che ha seminato a PN.</li>
	<li>Dedurre il numero di sfere placcate dividendo il numero di cellule placcate per PN per la dimensione della sfera calcolata alla fine del passaggio precedente (PN-1): sfere piastrine PN - cellule placcate PN / dimensione sfera PN-1 NOT:</</c12> Per convenzione, la dimensione della sfera viene considerata stabile durante il primo passaggio della coltura (cioè, la dimensione della sfera P0 , la dimensione della sfera P1). Se vengono utilizzati più pozzi come repliche tecniche, utilizzare la dimensione media della sfera a PN-1 come denominatore.</li>
	<li>Calcola la cella cumulativa e il numero di sfera per ogni pozzo per passaggio: numero cumulativo PN - (conteggio PN / placcato PN) X numero cumulativo PN-1. NOT:</</c20> Per convenzione, il numero cumulativo P0 - placcato P1. Se vengono utilizzati più pozzi come repliche tecniche, calcolare il numero cumulativo medio per campione o condizione per ogni passaggio.</li>
	<li>Tracciare i punti dati su una scala semilogatica. Visualizzare il numero di passaggio (da P0 a PN)sull'asse x (scala lineare) e il numero cumulativo di celle o sfere sull'asse y (scala logaritmica).</li>
	<li>Adattare una linea di tendenza esponenziale ai punti dati e calcolare il coefficiente di determinazione (R2) per misurare la bontà dell'adattamento. NOT:</</c26> La linea di tendenza adattata ai punti dati dovrebbe approssimarsi a una curva esponenziale, come previsto per una popolazione cellulare che cresce o muore con un tasso costante. R2 accetta valori compresi tra 0 e 1, con i valori più vicini a 1 che indicano una migliore adattamento.</li>
	<li>Rappresentare l'equazione della linea di tendenza come funzione esponenziale naturale per dedurre il tasso di crescita (GR) della cultura: y - y0 e(GR)x, dove y0 è il valore di y quando x è 0.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kordon, E. C., Smith, G. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo per la descrizione quantitativa delle proprietà di crescita MaSC in vitro. Ad esempio, presentiamo l'effetto dell'espressione Myc costitutiva di basso livello sui normali MaSC murini. Questo approccio, tuttavia, può essere applicato ugualmente a vari contesti. Le cellule primarie umane o murine, così come le linee cellulari stabilite, possono essere coltivate in condizioni indipendenti dall'ancoraggio per stabilire colture mammosphere che possono essere passaggiate serialmente. La sovraespressione genica e l'interferenza dell'RNA possono essere facilmente introdotte nel protocollo con l'aggiunta di una fase di trasduzione virale alla fine del primo passaggio (dopo il passaggio 3.5). In alternativa, le cellule possono essere infettate nell'adesione e quindi placcate come mammosfere.
Un aspetto critico del saggio qui presentato è la densità delle cellule di semina, che dovrebbe essere abbastanza bassa da evitare che la generazione di aggregati interferisca con l'interpretazione dei risultati16,17. La morfologia delle mammosfere può essere informativa per risolvere questa ambiguità. Solo le sfere rotonde compatte devono essere enumerate alla fine di ogni passaggio. Sia la circolarità degli sferoidi che le dimensioni dovrebbero essere prese in considerazione. Utilizzando il processo automatizzato del DIA, questo passaggio è garantito con le soglie appropriate in modo obiettivo e assoluto. Spesso, i progenitori formano strutture acinari o gruppi più piccoli di cellule che dovrebbero essere esclusi dai conteggi della mammosfera. Come regola generale, usiamo una soglia di 100 m di diametro. Infine, occorre fare attenzione a evitare il trasferimento di mammopsheres intatti o non completamente dissociati da un passaggio all'altro. D'altra parte, l'eccesso di pipettaggio porterà ad un aumento della morte cellulare. Pertanto, se si incontrano tali difficoltà, si consiglia di utilizzare una lieve provapsinizzazione o un trattamento Con Accutase e di passare le sfere dissociate attraverso un colino da 40 m per garantire la generazione di sospensioni unicellulari.
L'efficienza della formazione della sfera (SFE) è stata utilizzata in alternativa, come surrogato per la quantificazione SC o CSC ex vivo nelle colture mammosphere. SFE è infatti una misura di cellule staminali in una determinata popolazione cellulare. Tuttavia, rappresenta un approccio meno coscienzioso in quanto fornisce informazioni solo in momenti distinti. Il calcolo dei numeri cumulativi della sfera e la generazione di curve cumulative di crescita, invece, consente l'inferenza del tasso di crescita della coltura dalla fase iniziale di semina cellulare fino all'esaurimento della coltura o, nel caso delle colture immortalate, per il numero desiderato di passaggi. La valutazione delle proprietà di crescita consente la valutazione della deviazione dalla crescita esponenziale attraverso il coefficiente R2 e, in una seconda fase, la valutazione del valore GR stesso.
È importante sottolineare che le curve cumulative di crescita della mammosfera possono essere utilizzate per valutare l'effetto di inibitori di piccole molecole o altri farmaci chemioterapici selettivamente al livello CSC6,11. Contrariamente alle normali mammosfere primarie, che funzionano si esauriscono in 5-7 passaggi, le mammosfere tumorali tendono ad espandersi all'infinito. Questa funzione è legata alla capacità illimitata di auto-rinnovamento CSC. Gli effetti sulla proliferazione e l'auto-rinnovamento del CSC possono essere disaccoppiati rispettivamente attraverso la generazione di cellule tumorali e curve di crescita della mammosfera. Un effetto specifico del CSC dovrebbe tradursi in una diminuzione del tasso di crescita cumulativo della mammosfera, con o senza effetto sul tasso di crescita cumulativo delle cellule6,11.
Infine, un'altra area di interesse è quella della riprogrammazione dei tessuti adulti SC. Le mammosfere completamente coltivate sono costituite da una popolazione di cellule fenotipicamente eterogenee, in cui solo una frazione minore conserva caratteristiche simili a stelo, tra cui la capacità di avvio della mammosfera e la rigenerazione della ghiandola mammaria dopo il trapianto in vivo6,9,11,18,19. I progenitori mammari possono quindi essere isolati utilizzando assaggi in vitro che conservanoetichette 6,9,11 o, ex vivo, utilizzando marcatori di superficie stabiliti2,3. In particolare, i progenitori mammari non sopravvivono agli anoichi e non sono in grado di formare mammosfere. È stato dimostrato che l'espressione Myc forzata conferisce il potenziale di initiazione della mammosfera ai progenitori mammari isolati come PKHneg11, con conseguente generazione di una cultura che può essere passata a tempo indeterminato. Allo stesso modo, l'interferenza dei regolatori negativi di riprogrammazione fisiologica può essere testata utilizzando lo stesso assaggio. In questo contesto, un problema comune che può sorgere è il numero limitato di input di cella. Se l'input della cella è inferiore a 10.000 celle, si consiglia di eseguire il seeding in piastre 24-well (massimo 5.000 cellule vitali /mL). Tuttavia, le condizioni di cultura indipendente di ancoraggio possono essere dimostrate troppo dure per la riprogrammazione del punteggio, soprattutto nei casi in cui l'effetto di riprogrammazione non è immediato. In questi casi, l'uso di una matrice di supporto e di colture organoidi tridimensionali potrebbe essere più appropriato20.
Nel complesso, il test della mammosfera è un'opzione conveniente che può essere facilmente impiegata per segnare proprietà simili a stelo nelle popolazioni MEC normali e tumorali. L'approccio quantitativo adottato in questo protocollo facilita il confronto tra culture effettuate in condizioni diverse o esposte a stimoli diversi. Se seguita rigorosamente, fornisce un sistema di modelli ex vivo relativamente semplice che permette di disaccoppiamento dei molteplici player che definiscono le proprietà del gambo in vivo, offrendo la possibilità di studi meccanicistici più dettagliati.

L'isolamento e la coltura in vitro delle cellule staminali esitali mammarie e delle cellule progenitrici sono diventate essenziali per comprendere le loro proprietà nella biologia cellulare mammaria. Eleganti analisi del lignaggio e analisi dei trapianti seriali hanno permesso lo studio delle cellule staminali (SC) e di altri sottoinsiemi di tessuti nel contesto della loro nicchia in vivo. Tuttavia, questo approccio richiede molto tempo e richiede la generazione di modelli murino reporter1,2,3,4,5. Pertanto, la coltura in vitro e la propagazione delle cellule staminali mammarie (MASC) pur risparmiando caratteristiche chiave di stelo, vale a dire l'auto-rinnovamento e la capacità di differenziazione, è una delle più grandi sfide nel campo. Negli ultimi anni, il saggio di mammosfera è stato ampiamente utilizzato per modellare sia la normale crescita del tessuto mammario che quello del cancro al seno, per quantificare sCs normali o tumorali (CSC) e valutare la loro capacità di auto-rinnovamento come reporter surrogato della loro attività nel loro rispettivo contesto in vivo6,7,8,9,10,11.
L'analisi della mammosfera è un approccio efficiente ed economico, in cui le cellule epiteliali mammarie appena isolate (MEC) sono coltivate in condizioni non aderenti, con la premessa che solo i MaSC sopravviveranno e formeranno sfere in sospensione mentre tutti gli altri tipi di cellule moriranno per anoikis. Inoltre, la capacità di formare diverse generazioni di mammosfere in passaggi seriali non aderenti è legata alla capacità di auto-rinnovamento dei MaSC6,9,11. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato di un saggio quantitativo di mammosfera, che è stato inizialmente sviluppato da Dontu e colleghi7 come una modifica del test della neurosfera pionieristica12, consentendo la crescita di SC putativi in condizioni non aderenti e prive di siero con l'aggiunta di adeguati fattori di crescita7,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 &#956;g. Stock solution 100 &#956;g/&#956;L in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>S17859L0615</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-Bio</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 &#956;g/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td>L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>PharmaTex</td>
			<td>34692032</td>
			<td>Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;g/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SAFCBiosciences</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary epithelial cell growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 &#181;g streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-HEMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 &#176;C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 &#956;m) before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures

La ghiandola mammaria è caratterizzata da un'ampia capacità di rigenerazione, in quanto attraversa enormi cambiamenti ormonali durante tutto il ciclo di vita di una femmina. Il ruolo delle cellule staminali mammarie (MASC) è ampiamente studiato sia nel contesto fisiologico/sviluppo che per quanto riguarda la carcinogenesi mammaria. In questo aspetto, gli studi ex vivo focalizzati sulle proprietà MaSC sono molto ricercati. Le colture mammosphere rappresentano un surrogato della formazione di organi e sono diventate uno strumento prezioso sia per la ricerca di base che per quella traslazionale. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di colture mammoliche primarie murine e la quantificazione delle proprietà di crescita MaSC. Il protocollo comprende la raccolta e la digestione della ghiandola mammaria, l'isolamento delle cellule epiteliali mammarie primarie (MEC), la creazione di colture primarie della mammosfera, il passaggio seriale, la quantificazione dei parametri di crescita della mammosfera e l'interpretazione dei risultati. Ad esempio, presentiamo l'effetto dell'espressione Myc costitutiva di basso livello sui normali MEC che porta ad un aumento dell'autorinnovamento e della proliferazione.

La sovraespressione Myc nei MEC normali, porta ad una maggiore frequenza di cellule che ne invitano la mammosfera. Ciò si ottiene attraverso un doppio meccanismo: Myc aumenta il tasso di divisioni simmetriche MaSC e la frequenza di riprogrammazione progenitrice in nuovi MaSC11. Per testare l'effetto della bassa espressione costitutiva di Myc, abbiamo usato il modello di topo transgenico Rosa26-MycER, in cui l'attività Myc può essere indotta da 4-idrossitamoxifen (4-OHT)15. Per la prima volta abbiamo placcato i MEC su piastre a 6 pozzetti ad aderisce ultra-bassa per rimuovere i fibroblasti, in assenza di 4-OHT. Dopo il primo passaggio, dividiamo la cultura in due: due pozzi sono stati tenuti non trattati (controllo) e due pozzi sono stati trattati con 200 nM 4-OHT (MycER). Abbiamo contato la sfera e il numero di celle di 5 passaggi consecutivi per tre esperimenti indipendenti (Tabella 1). I numeri cumulativi di cellule e sfere per passaggio sono riportati nella tabella 2. L'induzione con 4-OHT porta ad un aumento della sfera e dei tassi di crescita delle cellule, come mostrato nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> Figura 1: Risultati rappresentativi. Curve di crescita della sfera cumulativa (A) e delle cellule(B)e mammosfere MycER. Viene mostrata la media e la deviazione standard di 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1a placcatura</td>
			<td colspan="3">2a placcatura</td>
			<td colspan="3">3a placcatura</td>
			<td colspan="3">4a placcatura</td>
			<td colspan="3">5a placcatura</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Celle placcate</td>
			<td>Conteggio celle</td>
			<td>Conteggio sfere</td>
			<td>Celle placcate</td>
			<td>Conteggio celle</td>
			<td>Conteggio sfere</td>
			<td>Celle placcate</td>
			<td>Conteggio celle</td>
			<td>Conteggio sfere</td>
			<td>Celle placcate</td>
			<td>Conteggio celle</td>
			<td>Conteggio sfere</td>
			<td>Celle placcate</td>
			<td>Conteggio celle</td>
			<td>Conteggio sfere</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1 (in via di exp)</td>
			<td rowspan="2">Controllo</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2 (Exp2)</td>
			<td rowspan="2">Controllo</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3 (Exp3)</td>
			<td rowspan="2">Controllo</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Numero di sfere conteggiate e numero di celle placcate e conteggiate ad ogni passaggio.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> Tabella 2: Calcolo dei numeri di sfera placcata e della sfera cumulativa e dei numeri di cella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)</a>

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Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Qui, descriviamo l'attuazione e l'interpretazione dei risultati di un saggio quantitativo di auto-rinnovamento della mammosfera in vitro.

Quantificazione dell'autorinnovamento nelle colture di Mammosfera Murine

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Quindi le culture della mammut forniscono un sistema motorio facilmente accessibile per studiare e sezionare aspetti importanti del normale nei comportamenti delle cellule staminali mammari del cancro, inclusa la loro capacità di rinnovarsi e differenziarsi. Il nostro approccio quantitativo mira alla valutazione del tasso di crescita delle colture mammosfera in modo oggettivo, consentendo un confronto diretto dei diversi tipi e condizioni cellulari. Per il primo studio, consiglierei di mantenere uno stretto controllo sui tempi di incubazione per evitare la digestione e garantire un conteggio accurato delle cellule prima di ogni placcatura.A dimostrare la procedura con Charolaise Bull sarà Errico D'Elia, tecnico del mio laboratorio. Dopo aver raccolto le quattro ghiandole mammose toraciche addominali e inferiori da 5 a 30, topi femmine di 8-10 settimane, posizionare fino a 20 ghiandole per piastra di Petri da 100 millimetri in un volume minimo di DPBS. Tritare i tessuti in pezzi più piccoli e aggiungere 10 millilitri di mezzo digestivo ai frammenti.Utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri e sigillare il tubo con pellicola di paraffina. Quindi incubare i frammenti su un rotatore a 0,03 X G per 2 ore e mezza a 37 gradi e 5% di anidride carbonica con umidità. Alla fine dell'incubazione, se tutti i frammenti possono essere passati attraverso la punta della pipetta P1000, sedimentare il liquame tissutale mediante centrifugazione e decantare attentamente il supernatante.Sospendere il pellet in 3 millilitri di PBS e filtrare il contenuto del tubo in sequenza attraverso un filtro cellulare da 100, 170, 140 micrometri in un nuovo tubo conico, lavando ogni colino con 2 millilitri di DPBS fresco dopo ogni filtro. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e decantare il supernatante sospendendo le cellule nel DPBS rimanente. Mescolare le cellule con un volume uguale di tampone di lysis di cloruro di ammonio di potassio e llyse i globuli rossi sul ghiaccio per un massimo di 5 minuti.Al termine dell'incubazione, arrestare la lisi con 10 millilitri di DPBS e raccogliere le cellule per centrifugazione. Confermare la presenza di un pellet bianco e sospendere il pellet in 1-5 millilitri di mezzo mammosfera per il conteggio. Quindi placcare le cellule su un'adesione ultra bassa trattata con coltura non tissutale sei piastre di pozzo a 2 x 10 alla quinta cellule vitali per millilitro di concentrazione media di mammosfera per un'incubazione da 7 a 10 giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Alla fine della coltura di 7-10 giorni, raccogliere le mammosfere primarie da ogni pozzo della piastra di coltura cellulare e sedimentare le mammosfere mediante cetrifugazione. Dopo aver decantato il supernatante, utilizzare una pipetta P200 con una punta filtrata per pipettare le mammosfere circa 100 volte. La generazione di pazienti a cellule singole è fondamentale per l'accurata quantificazione della cellula mammosfera per una nuova labilità.Ispezionare visivamente l'estensione della segregazione e, se necessario, utilizzare il filtro cellulare. Sospendere le mammosfere dissociate con da 1 a 5 millilitri di mezzo mammosfera fresco per il conteggio e placcare da 2 X 10 alle quattro cellule vitali per millilitro su adesione ultra bassa rivestita di poliema sei piastre di pozzo per una coltura da 5 a 7 giorni. Quindi, dopo 5-7 giorni, conta il numero di sfere per pozzo.Alla fine di ogni passaggio, utilizzare una fotocamera digitale montata su uno stereoscopio per scansionare l'intera superficie di tutti i pozzi per immagini le sfere. Dopo aver salvato le immagini, come file tif, importate le immagini stereoscopiche come sequenza di immagini in ImageJ e impostate la scala e il tipo di immagine su 8 bit. Duplicare la pila di immagini e selezionare Sottrai sfondo dalla scheda Processo.Controllare le opzioni Sfondo chiaro e Paraboloide scorrevole e fare clic su OK per elaborare tutte le immagini della pila. Selezionare Regola e soglia dalla scheda Immagine e fare clic su Applica. Apparirà una finestra pop-up.Selezionate Predefinito (Default) come metodo e Luce (Light) come sfondo. Selezionare la casella Calcola soglia per ogni immagine e fare clic su OK. Per elaborare tutte le immagini nello stack, selezionare Spartiacque e fare clic su Sì. Selezionare Apri e fare clic su Sì e selezionare Erode e fare clic su Sì.Quindi, selezionate Analizza particelle (Analyze Particles) dal menu Analizza (Analyze) e impostate la soglia di dimensione minima a 10.000 micrometri al quadrato e la circolarità compresa tra 0,50 e 1,00. Selezionate l'opzione Ellissi (Ellipses) dal menu a discesa Mostra (Show) e selezionate Riepiloga (Summarize), Escludi sui bordi (Exclude on edges) e Mostra in situ (In situ Show). Quindi fare clic su OK per elaborare tutte le immagini dello stack.Per calcolare la curva di crescita cumulativa per ogni passaggio registrare il numero di cellule placcate e il numero di cellule in sfere conteggiate per pozzo e calcolare la dimensione della sfera alla fine di ogni passaggio. Dedurre il numero di sfere placcate, dividendo il numero di celle placcate per ogni passaggio per la dimensione della sfera calcolata alla fine del passaggio precedente. Calcolare il numero di cella cumulativo per ogni pozzo per passaggio e il numero di sfera cumulativa per ogni pozzo per passaggio e tracciare i punti dati su una scala semi-logaritmica.Quindi una linea di tendenza esponenziale ai punti dati e calcolare il coefficiente di determinazione per misurare la bontà dell'adattamento. Quindi raffigura l'equazione della linea di tendenza come una funzione esponenziale naturale per dedurre il tasso di crescita della cultura. In questo esperimento, sono stati determinati il numero di sfere e cellule di cinque passaggi consecutivi, per tre esperimenti indipendenti.Qui alla cella cumulativa e vengono mostrati i numeri di sfera per passaggio. Come osservato attivazione myc, porta ad un aumento dei tassi di crescita della sfera e delle cellule. I punti di tempo biologici e rilevanti possono essere selezionati per la raccolta cellulare o per eseguire analisi dell'espressione genica o altre risorse funzionali per valutare la differenziazione cellulare, la migrazione e l'invasione.Questo è un approccio semplice ed economico con più applicazioni. Ad esempio, può essere utilizzato nella scoperta diretta per misurare gli effetti sulla proliferazione delle cellule staminali tumorali e sull'autori rinnovamento.

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