Name: quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00
Duration: 7 min 40 s
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私たちは、Rosa26-MycERトランスジェニックマウスモデルの種類の贈り物のためにブルーノ・アマティに感謝します。この研究は、WWCR、AIRC、ERC、イタリア保健省からP.G.P.T.V.およびX.A.への助成金を受け、FIRCとA.S.によってFUV補助金によって支援されました。

インビボ手続きは、EU指令2010/63に従い、当社の機関倫理委員会(動物ウェルベシングのための生物--OPBA)およびイタリア保健省(IACUC番号762/2015および537/2017)の承認を受けた後に行われました。
1. マウス乳腺採取と消化
<ol><li>典型的な実験では、CO2吸入により8-10週齢の処女雌マウスを犠牲にする。実験の目的に応じて、5〜30匹のマウスを使用してください。フードの下の解剖板にマウスを置きます。針を使って前肢を伸ばし、エタノールで動物の毛皮を洗い流します。</li>
	<li>鉗子で皮膚を持ち上げ、骨盤領域のレベルから始まり、子宮頸部まで移動して腹腹をそのままにして垂直切開を行う。皮膚や腹腹が破裂しないようにするには、丸いはさみを使用します。</li>
	<li>体の横軸を横切るはさみのやさげで、肌を慎重に取り外します。</li>
	<li>皮膚が胸部および腹部から完全に剥離したら、動物の4つの手足を横切って4つの切開を行い、針で皮膚を固定する。はさみと鉗子を使用して、拡張された皮膚から動物の体を完全に取り外します。</li>
	<li>鉗子を使用して、完全に露出している乳腺脂肪パッドを穏やかに持ち上げ、はさみの助けを借りて慎重に皮膚から取り外します。各マウスの下部胸部および腹部乳腺を収集し、50 mL円錐形チューブでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に浸漬します。チューブあたり最大20の腺を収集します。ティッシュを氷の上に置いておきなさい。 注:必要に応じて、腺は一晩氷の上にとどまることができます。ここは安全な停止点です。以下のステップは、滅菌条件下で行う必要があります。</li>
	<li>消化媒体を調製し、フィルタリングする:ダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)2mMグルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、200 U/mLコラゲターエーゼおよび100μg/mLヒアルロニダーゼ(材料表参照)を添加した。</li>
	<li>最大20gを100mmのペトリ皿に移し、メスまたは湾曲したはさみを使用して組織をミンチします。大量のDPBSを皿に移さないでください。</li>
	<li>各ペトリ皿に10mLの消化媒体を加え、25 mLの血清学的ピペットを使用して、50 mL円錐形チューブに細分化された組織を移します。</li>
	<li>パラフィルムでチューブを密封し、ローテーターの上に置きます。ローテータを低速(0.03 x g)に設定し、5%CO2を含む湿気の多い雰囲気の中で37°Cで2.5時間インキュベートします。</li>
	<li>次の手順に進む前に、サスペンションを目視で検査します。大きな組織が未消化のままである場合は、さらに30分間37°Cでインキュベーションを延長する。 注:代替として、消化は、37°、5%CO2、穏やかなコラゲターゼ/ヒアルロニダーゼ酵素ミックス13を用いて一晩行うことができる。</li>
</ol>2. 一次マウスMECの分離
<ol><li>ローテーターを停止し、インキュベーターからチューブを取り外します。5 mL の血清学的ピペットの開口部で P1000 チップを調整します。サスペンションがP1000チップを通過する場合は、次の手順に進みます。それ以外の場合は、さらに30分間37°Cでインキュベーションを延長する。</li>
	<li>遠心分離機は100 x g、4°Cで5分間。慎重に上清をデカントし、DPBSの3 mLで各チューブのペレットを再中断します。 注:低い遠心分離速度はリンパ球および脂肪組織細胞の除去を可能にする。このステップでペレットを離れないように、穏やかな操作が必要です。</li>
	<li>100、70および40μmの細胞ストレーナーを使用して、各チューブ内の細胞懸濁液を別々に濾過する。各フィルタリングステップで、パススルーを収集する前に、2 mLのDPBSでストレーナーを洗浄します。 注:この時点から、セル懸濁液をプールして一緒に処理できます。</li>
	<li>遠心分離機は300 x g、4°Cで5分間。慎重に上清をデカントし、DPBSの残りのボリューム内の細胞を再中断します。</li>
	<li>塩化アンモニウムカリウム(ACK)リシス緩衝液の等量を加えて赤血球(RBC)リシスに進む(材料表を参照)。ピペットで混ぜ、氷の上で最大5分間インキュベートします。</li>
	<li>DPBSと遠心分離機を300xgで10mL加え、4°Cで5分間加えます。慎重に上清をデカントし、目視でペレットを検査します。ペレットが白い場合は、次のステップに進みます。それ以外の場合は、RBCリシスステップを繰り返します(ステップ2.5)。</li>
	<li>マンモスフィア培地の1-5 mLで細胞ペレットを再中断する:乳腺上皮細胞増殖基底培地(MEBM)、2mMグルタミンを添加し、 100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、5 μg/mL インスリン、0.5 μg/mL ヒドロコルチゾン、2% B27、20 ng/mL 表皮成長因子 (EGF)、20 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)および 0.4 IU/mL </li>
</ol>3. シリアルマンモスフィア再めっき
<ol><li>マンモスフィア培養物の確立のために、細胞を処理した非組織培養(超低接着)6ウェルプレート上に、マンモスフィア培地中の200,000個の生存細胞/mLの密度でプレートをプレート化します。細胞を37°Cで7〜10日間インキュベートし、5%CO2.</li>
	<li>95%エタノールで1%ポリHEMA溶液を調製し、濾過する(材料表を参照)。以下の通路用の超低接着6ウェルプレートをコートし、ウェル当たり1%ポリHEMA溶液の400μLを添加し、エタノールを完全に乾燥させる。より良い結果を得るには、コーティングを2回繰り返します。 注:最初の通路の間に非コーティングされた版の使用は培養からの線維芽細胞の選択的な除去を可能にする。</li>
	<li>7-10日間の培養の終わりに、すべての井戸から一次マンモスフィアを収集し、300 x gで遠心分離機を、4°Cで5分間収集します。</li>
	<li>慎重に上清をデカントし、フィルタリングされた先端を持つP200ピペットを使用してマンモスフィアの機械的解離に進みます。ピペットを約100回、大きなスフェロイドの有無を目視で検査します。 注:37°C、5%CO2でトリプシンまたはアキュターゼの少量(0.2-0.5 mL)の球ペレットの短いインキュベーション(2-5分)を使用して、機械的解離を容易にすることができます。各通路のめっき用に新鮮なマンモスフィア培地(ステップ2.7)を準備します。</li>
	<li>新鮮なマンモスフィア培地の1〜5 mLで再サスペンドし、生存細胞を数えます。該当する場合は、細胞を治療群または培養条件で分割する。</li>
	<li>プレート20,000の生細胞/mL上のポリHEMAコーティングされた超低接着6ウェルプレートと37°でインキュベートし、5%CO2。 注:マンモスフィアは、細胞めっき後5〜7日以内に最大サイズに達する。可能であれば、各サンプルまたは条件の細胞を複数のウェルに分配し、技術的な複製を得る。細胞凝集を避けるために、めっき密度を低く保つ必要があります。6ウェルプレートには最大20,000セル/mL、24ウェルプレートには5,000セル/mLを推奨します。</li>
	<li>5~7日後、井戸あたりの球数を数えます。これは、10倍の倍率レンズを搭載した顕微鏡を使用するか、デジタル画像解析を使用して手動で行うことができます(ステップ4を参照)。</li>
	<li>各井戸のマンモスフィアを別々に収集し、300 x gで遠心分離機を4°Cで5分間収集します。</li>
	<li>慎重に上清をデカントし、フィルタリングされた先端を持つP200ピペットを使用してマンモスフィアの機械的解離に進みます。ピペットを約100回、大きなスフェロイドの有無を目視で検査します。</li>
	<li>新鮮なマンモスフィア培地の1 mLで再サスペンドし、生存細胞を数えます。各サンプルまたは条件のセルをプールし、手順 3.6~ 3.10 を繰り返します。めっきされた細胞の数と、各通路のウェルごとにカウントされる球体と細胞の数を記録します。累積成長計算のステップ 5 に進みます。</li>
</ol>4. デジタル画像解析(DIA)を用いた球体列挙
<ol><li>各通路の終わりに、すべての井戸の表面全体をスキャンし、ステレオスコープに取り付けられたデジタルカメラを使用して球体の画像を取得します。イメージを .tif ファイルとして保存します。</li>
	<li>ImageJ14を使用して、ステレオスコープイメージをイメージシーケンスとして読み込む 。画像の縮尺と種類を 8 ビットに設定します。</li>
	<li>イメージのスタックを複製し、メニューバーの「プロセス」タブから「背景を減算」を選択します。オプションライトの背景とスライド放物面をチェックし、ボタンOKをクリックします。スタックのすべてのイメージを処理します。</li>
	<li>メニュー バーの [イメージ]タブから [調整]を選択し、[しきい値]を選択します。[適用]をクリックすると、[スタックをバイナリに変換]というタイトルのダイアログ ウィンドウが表示されます。[方法として既定]を選択し、[背景としてライト]を選択します。[各イメージのしきい値を計算する] チェックボックスをオンにし、[OK]ボタンをクリックします。</li>
	<li>メニューバーのタブの下にある「バイナリ」リストから「流域」、「開く」、「侵食」のコマンドを順番に選択します。表示されるダイアログ ボックスの [はい]ボタンをクリックして、スタックのすべてのイメージを処理します。 注:これらのプロセスにより、オブジェクトのエッジからピクセルをタッチ、オブジェクトスムージング、および削除するオブジェクトを視覚的に分割できます。</li>
	<li>[分析]メニューから[パーティクルを分析]機能を選択します。最小サイズしきい値を 10,000 μm2に設定し、円形を 0.50 ~ 1.00 に設定します。[表示]ドロップダウン メニューからオプションの省略記号を選択します。[要約]をオンにし、[エッジに除外]、および[In situ Show]をオンにして、[OK]ボタンをクリックします。 スタックのすべてのイメージを処理します。</li>
	<li>球との楕円の対応を視覚的に検査し、必要に応じてパーティクル数を修正します。各ウェルのすべてのフレームからのカウントを合計して、ウェルあたりのマンモスフィアの合計数を取得します。</li>
</ol>5. 累積成長曲線計算
注:各通路の終わりに各ウェルでカウントされるマンモスフィアの数(PN)は、PNの始めに播種されたマンモスフィア開始細胞の数を反映する。
<ol><li>各通路(PN)について、めっき細胞の数と井戸ごとにカウントされる細胞と球の数を登録します。各通路の終点の球のサイズを計算します。 球サイズPN(セル/球)=細胞カウントPN/球数PN 注:PNにおける球体サイズは、PNに播種された各マンモスフィア開始細胞の増殖電位の尺度である。</li>
	<li>PN用にめっきされたセルの数を前の通路の終端で計算された球のサイズで割ることによって、めっきされた球の数を推測する(PN-1): 球板めっき PN = セルメッキ PN / 球サイズ PN-1 注:慣例により、球のサイズは、培養の最初の通路(すなわち、球サイズP0=球サイズP1)の間に安定していると仮定される。複数のウェルがテクニカル複製として使用される場合は、分母としてPN-1の平均球サイズを使用します。</li>
	<li>各ウェルの各ウェルの累積セルと球数を計算します。 累積数 P= (カウント PN / めっき PN) X 累積数P-1. 注:慣例により、累積数 P0 = めっき P1.複数の井戸が技術的な複製として使用される場合は、各通路のサンプルまたは条件あたりの平均累積数を計算します。</li>
	<li>半対数スケールでデータ ポイントをプロットします。x 軸 (線形スケール) に通路番号 (P0 ~ PN)を表示し、y 軸に累積セルまたは球数 (対数スケール) を表示します。</li>
	<li>指数トレンド線をデータポイントにフィットさせ、決定係数(R2)を計算して適合度を測定します。 注:データ ポイントに適合する傾向線は、一定の割合で成長または死亡するセル集団に対して予想されるように、指数曲線を近似する必要があります。R2は 0 ~ 1 の値を取り、1 に最も近い値はより適切な適合を示します。</li>
	<li>トレンドラインの方程式を、培養の成長率(GR)を推測する自然な指数関数として描写します。 y = y0 e(GR)x、 y0はx = 0 の場合の y の値です。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell.">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage+and+time+dictate+the+fate+of+Wnt/beta-catenin-responsive+stem+cells+in+the+mammary+gland.">Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).</li><li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stem+cells+contribute+to+mammary+gland+development+and+maintenance.">Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance.</a> Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).</li><li>Pece, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140 (1), 62-73 (2010).</li><li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem/progenitor+cell+properties.">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li><li>Santoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Loss+in+Breast+Cancer+Leads+to+Myc+Activation,+Increased+Cell+Plasticity,+and+Expression+of+a+Mitotic+Signature+with+Prognostic+Value.">p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value.</a> Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).</li><li>Reynolds, B. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Tracking+of+Breast+Cancer+Cells+Enables+Prediction+of+Sphere+Formation+from+Early+Cell+Divisions.">Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions.</a> iScience. 8, 29-39 (2018).</li><li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines.">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells:+a+mathematical+model+and+experiment.">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP/TAZ.">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li></ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、vitroにおけるMaSC増殖特性の定量的説明のためのプロトコルについて説明する。一例として、通常のマウスMaSCに対する低レベル構成Myc発現の効果を提示する。ただし、この方法はさまざまなコンテキストにも同様に適用できます。ヒトまたはマウスの一次細胞は、確立された細胞株と同様に、連続して通過することができるマンモスフィア培養を確立するために、アンカレッジ独立した条件で培養することができる。遺伝子過剰発現およびRNA干渉は、第1通路の終わりにウイルス導入工程を加えてプロトコル内に容易に導入することができる(ステップ3.5後)。あるいは、細胞は付着に感染し、次いでマンモスフィアとしてめっきすることができる。
ここで提示されるアッセイの重要な側面は、結果16、17の解釈を妨げる凝集体の生成を避けるのに十分に低いはずの播種細胞密度である。マンモスフィアの形態は、このあいまいさを解決するために有益であり得る。各通路の最後に、コンパクトで丸い球のみを列挙する必要があります。回転楕円体の円形とサイズの両方を考慮する必要があります。DIA の自動化されたプロセスを使用して、このステップは客観的かつ絶対的な方法で適切なしきい値で保証されます。多くの場合、前駆者は、マンモスフィアカウントから除外されるべき細胞のアシナール構造または小さなクラスターを形成する。経験則として、直径100μmの閾値を使用します。最後に、無傷または完全に解離したマンモプスが1つの通路から次の通路に移らないように注意する必要があります。一方、過剰なピペットは細胞死の増加につながります。したがって、このような困難が発生した場合は、軽度のトリプシン化またはアキュターゼ処理を使用し、解離球を40μmのストレーナーを通して単一細胞懸濁液の生成を確実にすることをお勧めします。
球形成効率(SFE)は、マンモスフィア培養におけるSCまたはCSC定量ex vivoのサロゲートとして代替的に使用されている。SFEは確かに所定の細胞集団における幹細胞様細胞の尺度である。ただし、異なる時点でのみ情報を提供するため、あまり良心的なアプローチではありません。累積球数と累積成長曲線の生成の計算は、代わりに、培養が排気するまでの培養工程からの培養速度の推論、または不滅の培養の場合は所望の通路数の推論を可能にする。成長特性の評価は、係数R2を介した指数関数的成長からの偏差の評価を可能にし、第2のステップでは、GR値自体の評価を可能にします。
重要なことに、累積マンモスフィア成長曲線は、CSCレベル6、11で選択的に小分子阻害剤または他の化学療法薬の効果を評価するために使用することができる。5~7箇所で機能的に排気する正常な原発性哺乳類球とは対照的に、腫瘍マンモスフィアは無限に膨張する傾向がある。この機能は、無制限の CSC 自己更新機能にリンクされています。増殖およびCSC自己再生に及ぼす影響は、それぞれ腫瘍細胞およびマンモスフィア成長曲線の生成を通じて結合解除することができる。CSC特異的効果は、累積細胞増殖速度6、11に影響を及ぼす有無にかかわらず、累積マンモスフィア増殖速度の低下をもたらすことが期待される。
最後に、もう一つの関心領域は、成人組織SCリプログラミングの1つである。完全に成長したマンモスフィアは、生体内6、9、11、18、19の移植時に乳房圏開始能および乳腺再生を含むわずかな部分のみが茎のような特徴を保持するフェノタイプ異種細胞集団からなる。乳腺前駆体は、このようにして、インビトロ標識保持アッセイ6、9、11、または、ex vivo、確立された表面マーカー2、3を用いて単離することができる。特に、乳腺前駆者はアノイキスを生き残ることができず、マンモスフィアを形成することができない。強制Myc発現は、PKHneg11として単離された乳腺前駆体にマンモスフィア開始電位を付与することが示されており、その結果、無期限に通過できる培養物の生成をもたらす。同様に、生理学的リプログラミングの陰性レギュレータの干渉は、同じアッセイを用いて試験することができる。このコンテキストでは、発生する可能性のある一般的な問題は、セル入力の数が限られています。セル入力が 10,000 セルより低い場合は、24 ウェル プレート (最大 5,000 個の生存セル/mL) にシードすることをお勧めします。それにもかかわらず、アンカレッジ独立した培養条件は、特にリプログラミング効果が即座にない場合に、リプログラミングを採点するには過酷すぎることが証明できます。このような場合、支持マトリックスおよび3次元オルガノイド培養物の使用は、より適切な20であり得る。
全体的に、マンモスフィアアッセイは、正常および腫瘍MEC集団におけるステム様特性をスコアリングするために容易に採用することができる費用対効果の高いオプションである。このプロトコルで取られた定量的アプローチは、異なる条件で行われる、または多様な刺激にさらされる培養物間の比較を容易にする。厳格に従うと、それは生体内で茎の特性を定義する複数のプレーヤーの結合を解除することを可能にする比較的単純なex vivoモデルシステムを提供し、より詳細な機械的研究の可能性を提供する。

乳腺上皮幹および前駆細胞の単離およびインビトロ培養は、乳腺細胞生物学におけるその性質を理解するために不可欠となっている。エレガントな系統トレースとシリアル移植アッセイは、生体内ニッチのコンテキストで幹細胞(SC)および他の組織サブセットの研究を可能にしました。ただし、この方法は時間がかかり、レポーター マウス モデル1、2、3、4、5の生成が必要です。したがって、乳腺幹細胞(MaSC)のインビトロ培養と伝播は、主要な幹機能、すなわち自己再生および分化能力をスペアリングしながら、この分野における最大の課題の1つです。過去数年間で、マンモスフィアアッセイは、正常な乳腺組織と乳癌増殖の両方をモデル化し、正常または癌SC(CSC)を定量化し、生体内文脈6、7、8、9、10、11におけるそれぞれの活動の代理レポーターとしての自己再生能力を評価するために広く使用されてきた。
マンモスフィアアッセイは、新鮮に単離された乳腺上皮細胞(MEC)が非付着状態で培養され、MaSCsのみが生存し、他のすべての細胞型がアノイキスによって死ぬことを前提とした、効率的で費用対効果の高いアプローチです。また、連続非付着通路において数世代のマンモスフィアを形成する能力は、MaSCs6、9、11の自己再生能力に関連している。ここでは、ドンツと同僚7が最初に先駆的な神経球アッセイ12の改変として開発した定量的マンモスフィアアッセイの詳細なプロトコルを説明し、適切な成長因子を添加して非付着、無血清条件における適合性SCの増殖を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 &#956;g. Stock solution 100 &#956;g/&#956;L in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>S17859L0615</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-Bio</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 &#956;g/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td>L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>PharmaTex</td>
			<td>34692032</td>
			<td>Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;g/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SAFCBiosciences</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary epithelial cell growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 &#181;g streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-HEMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 &#176;C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 &#956;m) before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures

乳腺は、女性のライフサイクルを通じて大規模なホルモンの変化を経るので、広範な再生能力によって特徴付けられます。乳腺幹細胞(MaSC)の役割は、生理学的/発達的な文脈と乳房発癌の両方で広く研究されている。この側面では、MaSC特性に焦点を当てたex vivo研究が非常に求められている。マンモスフィア培養は臓器形成のサロゲートを表し、基礎研究と翻訳研究の両方にとって貴重なツールとなっています。ここでは、マウス一次マンモスフィア培養の生成とMaSC増殖特性の定量に関する詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルには、乳腺の採取と消化、原発性乳腺上皮細胞(MEC)の分離、一次哺乳動物培養物の確立、シリアル通過、マンモスフィア増殖パラメータの定量および結果の解釈が含まれる。一例として、自己再生と増殖の増加につながる正常MECに対する低レベル構成Myc発現の効果を提示する。

正常なMECにおけるMyc過剰発現は、マンモスフィア開始細胞の頻度の増加につながる。これは二重メカニズムによって達成される:MycはMaSC対称分裂の速度および新しいMaSC11への前駆者の再プログラミングの頻度を増加させる。低構成Myc発現の効果を試験するために、4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)15によってMyc活性を誘導することができるRosa26-MycERトランスジェニックマウスモデルを用いた。まず、4-OHTがない場合、超低接着6ウェルプレートにMECをめっきし、線維芽細胞を除去しました。最初の一節の後、培養物を2つに分割しました:2つの井戸を未処理に保ち(コントロール)、2つのウェルを200 nM 4-OHT(MycER)で処理しました。3つの独立した実験について、5つの連続した通路の球数と細胞数を数えた( 表1)。通路ごとの累積セル数と球数を表2に示します。4-OHT による誘導は、図 1に示すように、球と細胞の増殖速度の増加につながります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> 図1:代表的な結果制御とMycERマンモスフィアの累積球(A)および細胞(B)成長曲線。3つの独立した実験の平均と標準偏差が示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">第1めっき</td>
			<td colspan="3">第2めっき</td>
			<td colspan="3">第3めっき</td>
			<td colspan="3">第4めっき</td>
			<td colspan="3">第5めっき</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>セルメッキ</td>
			<td>セル数</td>
			<td>球数</td>
			<td>セルメッキ</td>
			<td>セル数</td>
			<td>球数</td>
			<td>セルメッキ</td>
			<td>セル数</td>
			<td>球数</td>
			<td>セルメッキ</td>
			<td>セル数</td>
			<td>球数</td>
			<td>セルメッキ</td>
			<td>セル数</td>
			<td>球数</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1</td>
			<td rowspan="2">コントロール</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2</td>
			<td rowspan="2">コントロール</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3</td>
			<td rowspan="2">コントロール</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>表1:球体数をカウントし、各通路でめっき・カウントした細胞数を示す。
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> 表 2: めっき球数と累積球数とセル番号の計算<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">この表の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>

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Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

ここでは、インビトロマンモスフィア自己再生定量アッセイの実施と解釈について説明する。

マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

したがって、mmmosphere培養は、自己更新および分化能力を含む、がん乳房幹細胞行動における正常な重要な側面を研究し、解剖するための簡単にアクセスできる運動システムを提供する。定量的アプローチは、マンモスフィア培養の成長率を客観的に評価し、異なる細胞の種類と条件を直接比較することを目的としています。最初の試験では、消化を避け、各めっきの前に正確な細胞数を確保するために、インキュベーション時間を厳しく管理することをお勧めします。シャロレーズ・ブルとの手順を実証するのは、私の研究室の技術者であるエリコ・デリアです。4つの腹部および下部胸部マンモリー腺を5〜30、8〜10週齢の雌マウスから収穫した後、DPBSの最小体積で100ミリメートルシャーレあたり最大20腺を配置する。組織を小さな部分にミンチし、断片に10ミリリットルの消化培地を加えます。25ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織片を50ミリリットルの円錐状チューブに移し、パラフィンフィルムでチューブを密封します。その後、0.03 X Gで0.03 X Gで、37度で2時間半、湿度で5%の二酸化炭素をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、すべての断片がP1000ピペット先端を通過できる場合、遠心分離によって組織スラリーを沈降し、上清を慎重にデカントする。3ミリリットルのPBSでペレットを再び懸濁し、100、170、140マイクロメートルのセルストレーナーを通してチューブの内容物を順次濾過して新しい円錐形チューブに入れ、各フィルターの後に2ミリリットルの新鮮なDPBSで各ストレーナーを洗浄します。ペレットは遠心分離により細胞をデカントし、残りのDPBS内の細胞を再懸濁する。同量の塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーと細胞を混合し、氷上の赤血球を最大5分間リセリングします。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルのDPBSで溶菌を逮捕し、遠心分離によって細胞を採取する。白いペレットの存在を確認し、カウント用の1〜5ミリリットルのmmosphere培地中にペレットを再び懸濁させる。その後、細胞を非組織培養処理された超低接着6つのウェルプレートに2 x 10から5番目の生存細胞のミンモスフィア培地濃度でプレートをプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で7〜10日のインキュベーションを行います。7〜10日培養の終わりに、細胞培養板の各ウェルから一次のmmosphereを収集し、セチフィケーションによってmmmmospheresを沈下する。上清をデカントした後、P200ピペットをフィルターチップで使用し、約100回のミペットをマムモスフィアにします。単一細胞患者の生成は、新しい可起性のために、mmosphere細胞の正確な定量化に不可欠である。分離の範囲を視覚的に検査し、必要に応じて細胞ストレーナーを使用します。再は、5〜7日間培養のためにポリヘマコーティングされた6つのウェルプレート上のミリリットル当たり4番目の生存細胞に2 X 10を数える新鮮なマンモスフィア培地の1〜5ミリリットルで不関連のマンモスフィアを再中断する。次に、5~7日後に、ウェル当たりの球数をカウントします。各通路の最後に、ステレオスコープに取り付けられたデジタルカメラを使用して、すべての井戸の表面全体をスキャンして球体を画像化します。イメージを tif ファイルとして保存した後、ステレオスコープイメージを ImageJ にイメージシーケンスとして読み込み、画像のスケールと種類を 8 ビットに設定します。画像のスタックを複製し、[プロセス]タブから[背景を減算]を選択します。[背景の明るさ] オプションと [放物線のスライディング] オプションをオンにし、[OK] をクリックしてスタックのすべてのイメージを処理します。[イメージ] タブの [調整としきい値] を選択し、[適用] をクリックします。ポップアップ ウィンドウが表示されます。方法として[デフォルト]を、[背景]として[ライト]を選択します。[各イメージのしきい値を計算] チェックボックスをオンにして、[OK] をクリックします。スタック内のすべての画像を処理するには、[集水域] を選択して [はい] をクリックします。[開く] を選択し、[はい] をクリックして [Erode] を選択し、[はい] をクリックします。次に、[解析]メニューから[パーティクルを解析]を選択し、最小サイズしきい値を 10,000 マイクロメートル、0.50 ~ 1.00 の間で[円形]に設定します。[表示] ドロップダウン メニューから [省略記号] オプションを選択し、[要約]、[エッジ上で除外]、および [インザス]表示をオンにします。次に、[OK] をクリックして、スタックのすべてのイメージを処理します。各通路の累積成長曲線を計算するには、めっき細胞の数とウェル当たりの球数を登録し、各通路の終点で球体サイズを計算する。めっき球の数を推定し、各通過に対してめっきされた細胞の数を、前の通路の終わりに計算された球体サイズで割ることにより。各通過のウェルの累積セル数と、各通過当たりのウェルの累積球数を計算し、データポイントを半対数スケールでプロットします。次に、指数傾向線をデータポイントに対して計算し、適合度を測定するための決定係数を計算します。次に、トレンドラインの方程式を自然な指数関数として表現し、文化の成長率を推定します。本実験では、5つの連続した通路の球数および細胞数について、3つの独立した実験について、決定した。ここでは、1節当たりの累積セル数と球数を示します。観察されたMyc活性化として、球および細胞の増殖速度の増加をもたらす。生物学的および関連する時点は、細胞の収集のために、または細胞の分化、移動、および浸潤を評価するために遺伝子発現解析または他の機能資産を実行するために選択することができる。これは、複数のアプリケーションを使用したシンプルでコスト効率の高いアプローチです。例えば、がん幹細胞増殖や自己再生に対する影響を測定するために直接発見に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

結腸幹細胞変異の定量

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

の新生RNA FISHによる転写分析<em&gt;インビボ</em&gt;栄養膜巨細胞または<em&gt;インビトロ</em&gt;栄養膜コーン外植片の短期文化

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...