Name: quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00
Duration: 7 min 40 s
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Agradecemos a Bruno Amati por el amable regalo del modelo de ratón transgénico Rosa26-MycER. Este trabajo fue financiado por subvenciones de WWCR, AIRC, ERC y el Ministerio de Salud de Italia a P.G.P. T.V. y X.A. con el apoyo de FIRC y A.S. por una subvención FUV.

Los procedimientos in vivo se realizaron de conformidad con la directiva 2010/63 de la UE y tras la aprobación de nuestro comité de ética institucional (Organismo para el bienestar animal--OPBA) y el Ministerio de Salud de Italia (Números 762/2015 y 537/2017 del OIA.
1. Colección y digestión de Murine Mammary Gland
<ol><li>Para un experimento típico, sacrificar ratones hembra vírgenes de 8-10 semanas de edad por inhalación de CO2. Dependiendo de los objetivos del experimento, utilice 5-30 ratones. Coloque los ratones en tableros de disección bajo una capucha. Use agujas para estirar las extremidades anteriores y lavar el pelaje del animal con etanol.</li>
	<li>Levante la piel con fórceps y realice una incisión vertical comenzando a nivel de la zona pélvica y moviéndose hasta el cuello uterino, dejando el peritoneo intacto. Para evitar romper la piel o el peritoneo, utilice tijeras de borde redondo.</li>
	<li>Separe cuidadosamente la piel del cuerpo con movimientos suaves de las tijeras a través del eje lateral del cuerpo.</li>
	<li>Una vez que la piel esté completamente separada de la zona torácica y abdominal, realice cuatro incisiones en las cuatro extremidades del animal y ancle la piel con agujas. Usa las tijeras y fórceps para separar completamente el cuerpo del animal de la piel extendida.</li>
	<li>Usa los fórceps para levantar suavemente las almohadillas de grasa mamaria que ahora están completamente expuestas y desprendécelas cuidadosamente de la piel con la ayuda de las tijeras. Recoger las glándulas mamarias torácicas y abdominales inferiores de cada ratón y sumergirlas en la salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), en un tubo cónico de 50 ml. Recoger hasta 20 glándulas por tubo. Mantenga los tejidos en hielo. NOTA: Si es necesario, las glándulas pueden permanecer en hielo durante la noche. Este es un punto de parada seguro. Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles.</li>
	<li>Preparar y filtrar el medio de digestión: Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 200 U/ml de colagenasa y 100 g/ml de hialuronidasa (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Transfiera hasta 20 glándulas a un plato Petri de 100 mm y pique el tejido usando un bisturí o tijeras curvas. Evite transferir grandes volúmenes de DPBS al plato.</li>
	<li>Añadir 10 ml de medio de digestión a cada plato Petri y transferir el tejido picado a un tubo cónico de 50 ml, utilizando una pipeta serológica de 25 ml.</li>
	<li>Selle los tubos con un parafilm y colóquelos en un rotador. Ajuste el rotador a baja velocidad (0,03 x g)e incubar durante 2,5 h a 37 oC en una atmósfera húmeda que contenga un 5% deCO2.</li>
	<li>Inspeccione visualmente la suspensión antes de continuar con los siguientes pasos. Si grandes trozos de tejido permanecen sin digerir, prolongue la incubación a 37 oC durante otros 30 min. NOTA: Como alternativa, la digestión se puede realizar durante la noche a 37 oC, 5% CO2,utilizando una mezcla suave de enzima selgenasa/hialuronidasa13.</li>
</ol>2. Aislamiento de LOS MEC Sprimarios De la Murine
<ol><li>Detenga el rotador y retire los tubos de la incubadora. Ajuste una punta P1000 en la apertura de una pipeta serológica de 5 ml. Si la suspensión pasa a través de la punta P1000, proceda a los siguientes pasos. De lo contrario, prolongar la incubación a 37oC durante otros 30 min.</li>
	<li>Centrífuga a 100 x g,durante 5 min a 4oC. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet de cada tubo en 3 ml de DPBS. NOTA: La baja velocidad de centrifugación permite la eliminación de linfocitos y células del tejido adiposo. Se requiere una manipulación suave para evitar desalojar el pellet en este paso.</li>
	<li>Filtre la suspensión celular en cada tubo por separado, usando coladores de células de 100, 70 y 40 m. En cada paso de filtrado, lave los coladores con 2 ml de DPBS antes de recoger el paso. NOTA: A partir de este punto, las suspensiones celulares se pueden agrupar y procesar juntas.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g,durante 5 min a 4oC. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células en el volumen restante de DPBS.</li>
	<li>Proceda a la lisis de glóbulos rojos (RBC) añadiendo un volumen igual de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK) (ver Tabla de materiales). Mezclar en pipeteo e incubar sobre hielo durante un máximo de 5 min.</li>
	<li>Añadir 10 mL de DPBS y centrifugar a 300 x g,durante 5 min a 4oC. Decantar cuidadosamente el sobrenadante e inspeccionar visualmente el pellet. Si el pellet es blanco, continúe con el siguiente paso. De lo contrario, repita el paso de lisis RBC (paso 2.5).</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 1-5 ml de medios de mamesfera: medio basal de crecimiento de células epiteliales mamarias (MEBM), complementado con 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, insulina de fibroblastos básico de 5 g/ml, hidrocortisona de 0,5 g/ml, 2% B27, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/ml (EGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico de 20 ng/ml (bFGF) y heparina de 0,4 UI/ml (ver Materiales de la tabla).</li>
</ol>3. Re-plating de la maméfera serial
<ol><li>Para el establecimiento de cultivos de mamolución, placa las células en cultivos no tisulares tratados (adhesión ultrabaja) placas de 6 pocillos a una densidad de 200.000 células viables/ml en medio de mamesfera. Incubar las células durante 7-10 días a 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Preparar y filtrar 1% de solución poli-HEMA en etanol al 95% (ver Tabla de Materiales). Recubrir placas de 6 pocillos de adhesión ultrabaja para los siguientes pasajes, añadiendo 400 ml de solución de poli-HEMA al 1% por poca y permitiendo que el etanol se seque por completo. Para obtener mejores resultados, repita el recubrimiento dos veces. NOTA: El uso de placas no recubiertas durante el primer paso permite la eliminación selectiva de fibroblastos del cultivo.</li>
	<li>Al final de la cultura de 7-10 días, recoger las mamesferas primarias de todos los pozos y centrífuga a 300 x g, durante 5 min a 4 oC.</li>
	<li>Decantar cuidadosamente el sobrenadante y proceder a la disociación mecánica de las mamesferas utilizando una pipeta P200 con puntas filtradas. Pipetear durante aproximadamente 100 veces e inspeccionar visualmente la suspensión para detectar la presencia de grandes esferoides. NOTA: Una incubación corta (2-5 min) del pellet de esfera en un volumen bajo (0,2-0,5 ml) de tripina o Accutase a 37 oC, 5% CO2,se puede utilizar para facilitar la disociación mecánica. Preparar el medio de mamesfera fresca (paso 2.7) para el revestimiento de cada pasaje.</li>
	<li>Resuspender en 1-5 ml de medio de mamesfera fresca y contar las células viables. Si corresponde, divida las células en grupos de tratamiento o condiciones de cultivo.</li>
	<li>Placa 20.000 células viables/ml en placas de 6 pocillos recubiertos de poli-HEMA de 6 pocillos e incubar a 37oC, 5% CO2. NOTA: Las mamisferas alcanzan su tamaño máximo dentro de 5-7 días después del revestimiento celular. Cuando sea posible, distribuya las celdas de cada muestra o condición a varios pozos para obtener réplicas técnicas. La densidad de chapado debe mantenerse baja para evitar la agregación celular. Se recomienda un máximo de 20.000 celdas/ml para placas de 6 pocillos y 5.000 celdas/ml para placas de 24 pocillos.</li>
	<li>Después de 5-7 días, cuente el número de esferas por pozo. Esto se puede hacer manualmente, utilizando un microscopio equipado con una lente de aumento de 10x, o utilizando el análisis de imágenes digitales (ver paso 4).</li>
	<li>Recoger las mamesferas de cada pocal por separado y centrifugar a 300 x g,durante 5 min a 4 oC.</li>
	<li>Decantar cuidadosamente el sobrenadante y proceder a la disociación mecánica de las mamesferas utilizando una pipeta P200 con puntas filtradas. Pipetear durante aproximadamente 100 veces e inspeccionar visualmente la suspensión para detectar la presencia de grandes esferoides.</li>
	<li>Resuspender en 1 ml de medio de mamesfera fresca y contar las células viables. Amarre las celdas de cada muestra o condición y repita los pasos 3.6-3.10. Registre el número de celdas chapadas y el número de esferas y celdas contadas por pozo para cada pasaje. Continúe con el paso 5 para el cálculo del crecimiento acumulado.</li>
</ol>4. Enumeración de esferas mediante análisis de imágenes digitales (DIA)
<ol><li>Al final de cada pasaje, escanea toda la superficie de todos los pozos y adquiere imágenes de las esferas usando una cámara digital montada en un estereoscopio. Guarde las imágenes como archivos .tif.</li>
	<li>Importe las imágenes del estereoscopio como una secuencia de imágenes utilizando ImageJ14. Establezca la escala y el tipo de imagen en 8 bits.</li>
	<li>Duplica la pila de imágenes y selecciona Restar fondo en la pestaña Procesar en la barra de menús. Compruebe las opciones Fondo claro y Paraboloides deslizantes y haga clic en el botón OK. Procesar todas las imágenes de la pila.</li>
	<li>Seleccione Ajustar y luego Umbral en la pestaña Imagen de la barra de menús. Al hacer clic en Aplicar, aparecerá una ventana de diálogo titulada Convertir pila a binario. Seleccione Predeterminado como método y Luz como fondo. Marque la casilla Calcular umbral para cada imagen y haga clic en el botón Aceptar.</li>
	<li>Seleccione secuencialmente los comandos Cuenca hidrográfica, Abrir y Erosionar en la lista binario en la pestaña Proceso de la barra de menús. Procesar todas las imágenes de la pila haciendo clic en el botón Sí del cuadro de diálogo que aparece. NOTA: Estos procesos permiten la segmentación visual de objetos que tocan, suavizan objetos y se elimina píxeles del borde de los objetos.</li>
	<li>Seleccione la función Analizar partículas en el menú Analizar. Establezca el umbral de tamaño mínimo en 10.000 m2 y la circularidad entre 0,50 y 1,00. Seleccione la opción Elipses en el menú desplegable Mostrar. Marque Resumir, Excluir en bordes y Mostrar in situ y haga clic en el botón Aceptar. Procesar todas las imágenes de la pila.</li>
	<li>Inspeccione visualmente la correspondencia de las elipses con esferas y, si es necesario, corrija el recuento de partículas en consecuencia. Sume los recuentos de todos los fotogramas de cada pozo para obtener el recuento total de mamesferas por pozo.</li>
</ol>5. Cálculo de la curva de crecimiento acumulada
NOTA: El número de mamesferas contadas en cada pozo al final de cada pasaje (PN) refleja el número de células que inician la mamesfera sembradas al principio de PN.
<ol><li>Para cada pasaje (PN), registre el número de celdas chapadas y el número de celdas y esferas contadas por pozo. Calcular el tamaño de la esfera al final de cada pasaje: tamaño de la esfera PN (células / esfera) - celdas contadas PN / esferas contadas PN NOTA: El tamaño de la esfera en PN es una medida del potencial proliferativo de cada célula iniciadora de mamesfera sembrada en PN.</li>
	<li>Inferir el número de esferas chapadas dividiendo el número de celdas chapadas para PN por el tamaño de la esfera calculado al final del pasaje anterior (PN-1): esferas chapadas PN - células chapadas PN / esfera tamaño PN-1 NOTA: Por convención, el tamaño de la esfera se asume estable durante el primer pasaje de la referencia cultural (es decir, el tamaño de la esfera P0 - tamaño de esfera P1). Si se utilizan varios pozos como réplicas técnicas, utilice el tamaño medio de la esfera en PN-1 como denominador.</li>
	<li>Calcule la celda acumulativa y el número de esfera para cada pozo por paso: Número acumulado PN (recuento PN / chapado PN) X número acumulado PN-1. NOTA: Por convención, número acumulado P0 - chapado P1. Si se utilizan varios pozos como réplicas técnicas, calcule el número acumulado medio por muestra o condición para cada paso.</li>
	<li>Trazar los puntos de datos en una escala semi-logarítmica. Muestre el número de paso (P0 a PN) en el eje x (escala lineal) y el número de celda o esfera acumulativa en el eje y (escala logarítmica).</li>
	<li>Ajuste una línea de tendencia exponencial a los puntos de datos y calcule el coeficiente de determinación (R2) para medir la bondad del ajuste. NOTA: La línea de tendencia ajustada a los puntos de datos debe aproximarse a una curva exponencial, como se espera para una población celular que crece o muere con una tasa constante. R2 toma valores entre 0 y 1, con valores más cercanos a 1 que indican un mejor ajuste.</li>
	<li>Representar la ecuación de la línea de tendencia como una función exponencial natural para inferir la tasa de crecimiento (GR) de la cultura: y y0 e(GR)x, donde y0 es el valor de y cuando x a 0.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell.">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>van Amerongen, R., Bowman, A. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo para la descripción cuantitativa de las propiedades de crecimiento de MaSC in vitro. Como ejemplo, presentamos el efecto de la expresión Myc constitutiva de bajo nivel en los MASC murinos normales. Este enfoque, sin embargo, puede aplicarse por igual a varios contextos. Las células primarias humanas o murinas, así como las líneas celulares establecidas, se pueden cultivar en condiciones independientes de anclaje para establecer cultivos de mamesferas que se pueden pasar en serie. La sobreexpresión genética y la interferencia del ARN se pueden introducir fácilmente en el protocolo con la adición de un paso de transducción viral al final del primer pasaje (después del paso 3.5). Alternativamente, las células pueden ser infectadas en la adhesión y luego chapadas como mamesferas.
Un aspecto crítico del ensayo presentado aquí es la densidad celular de sembración, que debe ser lo suficientemente baja como para evitar la generación de agregados que interfieren con la interpretación de los resultados16,17. La morfología de las mamesferas puede ser informativa para resolver esta ambiguedad. Sólo las esferas redondas compactas deben enumerarse al final de cada pasaje. Tanto la circularidad de los esferoides como el tamaño deben tenerse en cuenta. Mediante el proceso automatizado de la DIA, este paso se garantiza con los umbrales adecuados de una manera objetiva y absoluta. A menudo, los progenitores formarán estructuras acinar o grupos más pequeños de células que deben excluirse de los recuentos de mamesferas. Como regla general, utilizamos un umbral de 100 m de diámetro. Por último, se debe tener cuidado de evitar el traslado de mammopsheres intactos o no totalmente disociados de un pasaje al siguiente. Por otro lado, el exceso de pipeteo conducirá a un aumento de la muerte celular. Por lo tanto, si se encuentran tales dificultades, se recomienda el uso de trippsinización leve o tratamiento Accutase y pasar las esferas disociadas a través de un colador de 40 m para asegurar la generación de suspensiones de una sola célula.
La eficiencia de formación de esferas (SFE) se ha utilizado alternativamente, como sustituto de la cuantificación SC o CSC ex vivo en cultivos de mamesferas. SFE es de hecho una medida de células similares a los tallos en una población celular dada. Sin embargo, representa un enfoque menos concienzudo, ya que proporciona información sólo en momentos distintos. El cálculo de los números de esfera acumulados y la generación de curvas de crecimiento acumuladas, en su lugar, permite la inferencia de la tasa de crecimiento de la cultura desde el paso inicial de la semilla celular hasta que el cultivo se agota o, en el caso de las culturas inmortalizadas, para el número deseado de pasajes. La evaluación de las propiedades de crecimiento permite evaluar la desviación del crecimiento exponencial a través del coeficiente R2 y, en una segunda etapa, la evaluación del propio valor GR.
Es importante destacar que las curvas de crecimiento de la maméfera acumulativa se pueden utilizar para evaluar el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas u otros fármacos quimioterápicos selectivamente en el niveldeCSC6,11. Contrariamente a las mamesferas primarias normales, que funcionan funcionalmente se agotan en 5-7 pasajes, las mamcerebrales tumorales tienden a expandirse indefinidamente. Esta característica está vinculada a la capacidad ilimitada de autorenovación de CSC. Los efectos sobre la proliferación y la autorenovación de la CSC se pueden desacoplar a través de la generación de células tumorales y curvas de crecimiento de mamesferas, respectivamente. Se espera que un efecto específico de CSC resulte en una disminución de la tasa de crecimiento de la maméfera acumulada, con o sin efecto en la tasa de crecimiento celular acumulativo6,11.
Por último, otra área de interés es la de la reprogramación del tejido adulto SC. Las mamopatías completamente cultivadas consisten en una población celular fenotípicamente heterogénea, en la que sólo una fracción menor retiene características similares a los de los tallos, incluyendo la capacidad de iniciación de la mamcerebral y la regeneración de la glándula mamaria al trasplante in vivo6,9,11,18,19. Los progenitores mamarios pueden aislarse, bien utilizando ensayos in vitro de retención de etiquetas6,9,11 o, ex vivo, utilizando marcadores de superficie establecidos2,3. En particular, los progenitores mamarios no sobreviven a los anoikis y son incapaces de formar mamesferas. Se ha demostrado que la expresión Myc forzada confiere potencial de iniciación a progenitores mamarios aislados como PKHneg11,lo que da como resultado la generación de una cultura que se puede pasar indefinidamente. Del mismo modo, la interferencia de los reguladores negativos de la reprogramación fisiológica se puede probar utilizando el mismo ensayo. En este contexto, un problema común que puede surgir es el número limitado de entradas de celda. Si la entrada de celda es inferior a 10.000 celdas, se recomienda la sembración en placas de 24 pocillos (máximo 5.000 celdas viables/ml). Sin embargo, se puede demostrar que las condiciones de cultivo independientes de anclaje son demasiado duras para la reprogramación de la puntuación, especialmente en los casos en que el efecto de reprogramación no es inmediato. En tales casos, el uso de una matriz de apoyo y cultivos organoides tridimensionales podría ser más apropiado20.
En general, el ensayo de mamesfera es una opción rentable que se puede emplear fácilmente para puntuar propiedades similares a los tallos en poblaciones normales y tumorales de MEC. El enfoque cuantitativo adoptado en este protocolo facilita las comparaciones entre cultivos realizados en diferentes condiciones o expuestos a diversos estímulos. Cuando se sigue rigurosamente, proporciona un sistema de modelo ex vivo relativamente simple que permite desacoplar a los múltiples actores que definen las propiedades del tallo in vivo, ofreciendo la posibilidad de estudios mecánicos más detallados.

El aislamiento y el cultivo in vitro de células protelíticas y progenitoras mamarias se han convertido en esenciales para comprender sus propiedades en la biología de las células mamarias. El seguimiento elegante del linaje y los ensayos de trasplante en serie han permitido el estudio de células madre (SC) y otros subconjuntos de tejidos en el contexto de su nicho in vivo. Sin embargo, este enfoque consume mucho tiempo y requiere la generación de modelos de ratón reportero1,2,3,4,5. Por lo tanto, el cultivo in vitro y la propagación de células madre mamarias (MASC) al tiempo que se ahorran características clave de la talla, a saber, la capacidad de auto-renovación y diferenciación, es uno de los mayores desafíos en el campo. En los últimos años, el ensayo de mamares se ha utilizado ampliamente para modelar tanto el tejido mamario normal como el crecimiento del cáncer de mama, para cuantificar los SC normales o cancerosos (CCS) y evaluar su capacidad de auto-renovación como reportero sustituto de su actividad en su respectivo contexto vivo6,7,8,9,10,11.
El ensayo de mamsphere es un enfoque eficiente y rentable, en el que las células epiteliales mamarias recién aisladas (MEC) se cultivan en condiciones no adherentes, con la premisa de que sólo los MASC sobrevivirán y formarán esferas en suspensión mientras que todos los demás tipos de células morirán por anoikis. Además, la capacidad de formar varias generaciones de mamesferas en pasajes seriales no adherentes está relacionada con la capacidad de auto-renovación de los MaSCs6,9,11. Aquí, describimos un protocolo detallado de un ensayo cuantitativo de mamosfera, que fue desarrollado inicialmente por Dontu y sus colegas7 como una modificación del ensayo neurosfera pionero12,permitiendo el crecimiento de SC putativas en condiciones no adherentes, libres de suero con la adición de factores de crecimiento apropiados7,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 &#956;g. Stock solution 100 &#956;g/&#956;L in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>S17859L0615</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-Bio</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 &#956;g/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td>L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>PharmaTex</td>
			<td>34692032</td>
			<td>Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;g/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SAFCBiosciences</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td>Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary epithelial cell growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 &#181;g streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-HEMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 &#176;C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 &#956;m) before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of self-renewal in murine mammosphere cultures

La glándula mamaria se caracteriza por una amplia capacidad de regeneración, ya que pasa por cambios hormonales masivos a lo largo del ciclo de vida de una hembra. El papel de las células madre mamarias (MASC) se estudia ampliamente tanto en el contexto fisiológico/desarrollo como con respecto a la carcinogénesis mamaria. En este aspecto, los estudios ex vivo centrados en las propiedades de MaSC son muy solicitados. Los cultivos de mamesferas representan un sustituto de la formación de órganos y se han convertido en una herramienta valiosa para la investigación básica y traslacional. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la generación de cultivos de mamesfera primaria murina y la cuantificación de las propiedades de crecimiento de MaSC. El protocolo incluye la recolección y digestión de la glándula mamaria, el aislamiento de las células epiteliales mamarias primarias (MEC), el establecimiento de cultivos de mamesferas primarias, el passaging en serie, la cuantificación de los parámetros de crecimiento de la mamesfera y la interpretación de los resultados. Como ejemplo, presentamos el efecto de la expresión myc constitutiva de bajo nivel en los MEC normales, lo que conduce a una mayor auto-renovación y proliferación.

La sobreexpresión de mic en LOS MEC normales, conduce a una mayor frecuencia de células que inician la mamesfera. Esto se logra a través de un mecanismo doble: Myc aumenta la tasa de divisiones simétricas MaSC y la frecuencia de la reprogramación de los progenitores en nuevos MaSC11. Para probar el efecto de la expresión Myc constitutiva baja, utilizamos el modelo de ratón transgénico Rosa26-MycER, en el que la actividad myc puede ser inducida por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT)15. Primero chapamos los MEC en placas de 6 pocillos de adhesión ultrabaja para eliminar los fibroblastos, en ausencia de 4-OHT. Después del primer pasaje, dividimos la cultura en dos: dos pozos se mantuvieron sin tratar (control) y dos pozos fueron tratados con 200 nM 4-OHT (MycER). Contamos el número de esfera y celda de 5 pasajes consecutivos para tres experimentos independientes(Tabla 1). Los números de celda y esfera acumulativos por pasaje se muestran en el Cuadro 2. La inducción con 4-OHT conduce a un aumento de las tasas de crecimiento de la esfera y de las células, como se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> Figura 1: Resultados representativos. Esfera acumulativa (A) y celda (B) curvas de crecimiento de control y mamesferas MycER. Se muestran la media y la desviación estándar de 3 experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1a chapado</td>
			<td colspan="3">2o revestimiento</td>
			<td colspan="3">3o revestimiento</td>
			<td colspan="3">4o chapado</td>
			<td colspan="3">5o revestimiento</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Células chapadas</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>Recuento de esferas</td>
			<td>Células chapadas</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>Recuento de esferas</td>
			<td>Células chapadas</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>Recuento de esferas</td>
			<td>Células chapadas</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>Recuento de esferas</td>
			<td>Células chapadas</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>Recuento de esferas</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1</td>
			<td rowspan="2">Control</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2</td>
			<td rowspan="2">Control</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3</td>
			<td rowspan="2">Control</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Números de esferas contadas y números de celdas chapadas y contadas en cada pasaje.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> Tabla 2: Cálculo de números de esfera chapados y números de esfera y celda sacumulativos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)

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Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Aquí, describimos la implementación e interpretación de los resultados de un ensayo cuantitativo de autorenovación de la mamismo in vitro.

Cuantificación de la auto-renovación en las culturas de la maméfera de la muriña

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Por lo tanto, los cultivos de mamosfera proporcionan un sistema motor de fácil acceso para estudiar y diseccionar aspectos importantes de lo normal en los comportamientos de células madre mamarias con cáncer, incluida su capacidad de autore renovarse y diferenciarse. Nuestro enfoque cuantitativo tiene como objetivo la evaluación de la tasa de crecimiento de los cultivos de mamosfera de una manera objetiva, permitiendo una comparación directa de diferentes tipos y condiciones celulares. Para el primer ensayo, aconsejo mantener un control estricto sobre los tiempos de incubación para evitar la sobre digestión y para asegurar un recuento celular preciso antes de cada chapado.Demostrando el procedimiento con Charolaise Bull estará Errico D'Elia, un técnico de mi laboratorio. Después de cosechar las cuatro glándulas de mamíferos torácicos abdominales e inferiores de 5 a 30, 8 a 10 ratones hembra de edad, coloque hasta 20 glándulas por plato de petri de 100 milímetros en un volumen mínimo de DPBS. Picar los tejidos en trozos más pequeños y añadir 10 mililitros de medio digestivo a los fragmentos.Utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para transferir las piezas de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros y sellar el tubo con película de parafina. A continuación, incubar los fragmentos en un rotador a 0,03 X G durante 2 horas y media a 37 grados y 5% de dióxido de carbono con humedad. Al final de la incubación, si todos los fragmentos se pueden pasar a través de la punta de la pipeta P1000, sedimentar la suspensión del tejido por centrifugación y decantar cuidadosamente el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de PBS y filtre el contenido del tubo secuencialmente a través de un colador celular de 100, 170, 140 micrómetros en un nuevo tubo cónico, lavando cada colador con 2 mililitros de DPBS fresco después de cada filtro. Pele el Dóserculo de las células por centrifugación y decantar el sobrenadante suspendiendo las células en el DPBS restante. Mezclar las células con un volumen igual de tampón de lysis de potasio de cloruro de amonio ylyse los glóbulos rojos en hielo durante un máximo de 5 minutos.Al final de la incubación, detener la lelisis con 10 mililitros de DPBS y recoger las células por centrifugación. Confirmar la presencia de un pellet blanco y volver a suspender el pellet en 1 a 5 mililitros de media de mamosfera para el recuento. Luego platina las células sobre la adhesión ultra baja tratada por cultivo de tejido seis placas de pozo a una 2 x 10 a las quintas células viables por mililitro de concentración media de mamosfera para una incubación de 7 a 10 días a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.Al final del cultivo de 7 a 10 días, recoger las mamíferos primarias de cada pozo de la placa de cultivo celular y sedimentar las mamíferos por cetrifugación. Después de decantar el sobrenadante, utilice una pipeta P200 con una punta filtrada para pipetear las masferas aproximadamente 100 veces. La generación de pacientes con células individuales es fundamental para la cuantificación precisa de la célula de la mamosfera para la nueva labilidad.Inspeccione visualmente la extensión de la segregación y utilice el colador celular si es necesario. Re suspenda las mafiosas desasociadas con 1 a 5 mililitros de medio de mamosfera fresca para el recuento y placa 2 X 10 a las cuartas células viables por mililitro en polihema recubierto de adhesión ultra baja seis placas de pozo para un cultivo de 5 a 7 días. Luego, después de 5 a 7 días, cuenta el número de esferas por pozo.Al final de cada pasaje, utilice una cámara digital montada en un estereoscopio para escanear toda la superficie de todos los pozos para imaginar las esferas. Después de guardar las imágenes, como archivos tif, importe las imágenes del estereoscopio como una secuencia de imágenes en ImageJ y establezca la escala y el tipo de imagen en 8 bits. Duplica la pila de imágenes y selecciona Restar fondo en la pestaña Proceso.Compruebe las opciones Fondo claro y Paraboloides deslizantes y haga clic en Aceptar para procesar todas las imágenes de la pila. Seleccione Ajustar y umbral en la pestaña Imagen y haga clic en Aplicar. Aparecerá una ventana emergente.Seleccione Predeterminado como Método y Luz como fondo. Marque el cuadro Calcular umbral para cada imagen y haga clic en Aceptar. Para procesar todas las imágenes de la pila, seleccione Cuenca hidrográfica y haga clic en Sí. Seleccione Abrir y haga clic en Sí y seleccione E erosionar y haga clic en Sí.A continuación, seleccione Analizar partículas en el menú Analizar y establezca el umbral de tamaño mínimo en 10.000 micrómetros al cuadrado y la Circularidad entre 0,50 y 1,00. Seleccione la opción Elipses en el menú desplegable Mostrar y active Resumir, Excluir en los bordes y Mostrar in situ. A continuación, haga clic en Aceptar para procesar todas las imágenes de la pila.Para calcular la curva de crecimiento acumulativo para cada pasaje, registre el número de celdas chapadas y el número de celdas en esferas contadas por pozo y calcule el tamaño de la esfera al final de cada pasaje. Deduzca el número de esferas chapadas, dividiendo el número de celdas chapadas para cada paso por el tamaño de la esfera calculado al final del pasaje anterior. Calcule el número de celda acumulativa para cada pozo por paso y el número de esfera acumulativa para cada pozo por pasaje y trace los puntos de datos en una escala semi-logarítmica.A continuación, una línea de tendencia exponencial a los puntos de datos y calcular el coeficiente de determinación para medir la bondad del ajuste. A continuación, represente la ecuación de la línea de tendencia como una función exponencial natural para inferir la tasa de crecimiento de la cultura. En este experimento, se determinaron la esfera y los números de celda de cinco pasajes consecutivos, para tres experimentos independientes.Aquí en los números de celda y esfera acumulativas por paso se muestran. Como se observó la activación de Myc, conduce a un aumento de las tasas de crecimiento de la esfera y la célula. Los puntos de tiempo biológicos y relevantes se pueden seleccionar para la recolección celular o para realizar análisis de expresión génica u otros activos funcionales para evaluar la diferenciación celular, la migración y la invasión.Este es un enfoque simple y rentable con múltiples aplicaciones. Por ejemplo, se puede utilizar en el descubrimiento directo para medir los efectos sobre la proliferación de células madre de cáncer y la auto-renovación.

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Investigación

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Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

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La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

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Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

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Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia