Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

ويشكر المؤلفان محمد عبد السيد احمد علي المساعدة الفنية الخبيرة. وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه لوندبيك ، ومؤسسه نوفو نورديسك ، وجمعيه الكلي الدانمركية ، ومؤسسه اياسي اوغ اجنار دانييلسن ، ومؤسسه A.P. مولر للنهوض بالعلوم الطبية ، وكود واياديث اريكسون مؤسسه ميموريال.

1. ادراج التسلسل التسلسلي الترميز الببتيد في pBAD البيرا-eCPX-AP
ملاحظه: لتحديد المتغيرات البيرا التي تعكر البروتين الهدف الأصلي, تبدا من خلال تحديد تسلسل الببتيد الأحماض الامينيه 15 في تسلسل البروتينات الاساسيه التي تحتوي علي واحد علي الأقل ليسين (K) بقايا.
<ol><li>انتقل إل...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

اما بالنسبة لجميع طرق الاختيار ، فان صرامة خطوات الغسيل ذات اهميه قصوى. وبما ان البكتيريا لا تحتاج إلى التملص من الخرز قبل تضخيم المستنسخين المختارين ، يمكن استخدام الربط العالي بين البيوتين والسسترافيدين بدلا من استخدام avidins التقارب الأقل ، كما فعلت سابقا مع نظام عرض بالعاثيه ، الانتقاء ...

بيوينيليشن من البروتين يخلق علامة قويه لعزله تقارب والكشف عنها. الانزيميه البروتين بيوتينييشن هو تعديل ما بعد الانتقالية محدده للغاية محفزه من قبل الاربطه البيوتين البروتين. و e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هو محدده للغاية والحيوية covalylates فقط عدد محدود من البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي في بقايا ليسين محدده1. ويتم حاليا تسخير مزايا البيره الحيوية المحفزة عن طريق دمج البروتين المستهدف مع الاصطناعية الصغيرة 15-الامينيه-حمض البيوتين متقبل (AP) الذي هو فعال بيوتينيلاتيد2 ويسمح لتحديدا عاليا و كفاءه في الجسم الحيوي وفي المختبر الحيوي من خلال التعبير المشترك أو أضافه البيرا3،4،5. علي الرغم من ان في الجسم الخارجي وفي المختبر البيره يحفز البيوتين-بروتين الربط هو استراتيجية جذابة لوضع العلامات ، ويقتصر تطبيقه علي العينات التي تحتوي علي البروتينات AP-تنصهر. والغرض من هذا الأسلوب هو تطوير المسوخ الجديدة من البروتينات البيوتين البروتيني التي بشكل انتقائي البروتينات غير المعدلة الاصليه ، التالي توسيع عدد التطبيقات التي يمكن استخدامها في استراتيجية الانزيميه الحيوية.
يمكن ان تتطور وظيفة البروتين من خلال جولات تكراريه من طفرة الجينات ، واختيار ، وتضخيم المتغيرات الجينات مع الوظيفة المطلوبة. استراتيجية اختيار قويه وفعاله أمر حاسم بالنسبة للتطور الموجهة ويتم اختيار النشاط البيوتين البروتين يغاز بسهوله بسبب الربط القوي بين البيوتين والسسترافالدين و homologs6. تكنولوجيات العرض phage تسمح لاختيار phage التي تعرض الببتيدات بيوتينيلاتيد7,8. وبما ان تضخيم الزوائد المعزولة يتطلب عدوي من المضيف البكتيري ، الا ان الاختيار الفاجي مع العقديات يخلق اختناقا في ان الربط العالي التقارب من البيوتين إلى العقديات لا رجعه فيه تقريبا في ظل عدم الفصل الظروف. لضمان ربط عكسها من phages الحيوية ، واستخدمت avidins موحودي مع تقارب اقل مما ادي إلى الإثراء ~ 10 اضعاف متواضعة7. طورنا مؤخرا طريقه عرض بكتيرية لعزل متغيرات البيرا الجديدة التي تلغي الحاجة إلى التملص من مصفوفة التقارب التالي تزيل اختناقا من أنظمه اختيار البيرا السابقة9. في الواقع ، لدينا نظام عرض البكتيرية يسمح لإثراء > 1 ، 000 ، 000 اضعاف من استنساخ النشطة في خطوه اختيار واحده9، التالي توفير نظام اختيار فعال للتطور الموجهة من المتغيرات البيرا الرواية.
لدينا نظام العرض البكتيري يتكون من اثنين من المكونات ، البيرا مع C-المحطة 6xHis العلامة والبروتين سقالة التي تسمح لعرض سطح الببتيد الهدف. استخدمنا البروتين سقالة معززه دائري الغشاء الخارجي البروتين X (eCPX) منذ عرض فعال من الببتيدات يمكن ملاحظتها في كل من N-و C-تيرميني10،11. الانصهار من الهدف الببتيد تسلسل إلى ال [ك-تيرمينوس] من [اكpx] يضمن [بيوينيلايشن] من جراثيم عبر عن نشطه [بيرا] [فرينت]. البكتيريا تسمح للاختيار العقديات فعاله كما الببتيد بيوتينيلاتيد يعرض الآن علي السطح (الشكل 1ا).
والغرض من هذا الأسلوب هو لتحديد المتغيرات الجديدة من البيرا التي بيوتينيلات الببتيد متواليات الموجودة في البروتينات الاصليه. يتم ترميز النظام من قبل الجينات الموجودة علي البلازميد pbad-البيرا-ecpx-AP ، الذي يحتوي علي مروج العربية المحرض السيطرة علي البيرا (arabad) ، ومروج T7 السيطرة ecpx9 (الشكل 1ب). يصف هذا البروتوكول الاجراء المفصل ل 1) دمج الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف في C-الطرفية من eCPX ، 2) إنشاء مكتبه الداخلية من البيرا عن طريق الخطا المعرضة PCR ، 3) مجموعه من البكتيريا الملزمة العقديات من قبل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MAC) ، 4) التحديد الكمي لإثراء البكتيريا ، و 5) التوصيف الاولي لمستنسخات معزولة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

البيوتين هو تعديل جذاب بعد الانتقالية للبروتينات التي توفر علامة قويه للعزل والكشف عن البروتين. الانزيميه الحيوية من قبل e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هي محدده للغاية ويسمح للبيئة البروتينات المستهدفة في بيئتهم الاصليه. ومع ذلك ، فان الاستخدام الحالي للحيوية بوساطة البيرا يتطلب وجود الببتيد متقبل الاصطناعية (AP) في البروتين المستهدف. لذلك ، يقتصر تطبيقه علي البروتينات التي تم هندستها لاحتواء AP. والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام العرض البكتيري من الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف غير المعدلة لتحديد المتغيرات البيرا التي بيوتينيلات الببتيد. ويستند هذا النظام علي البلازميد واحد الذي يسمح للتعبير المشترك من المتغيرات البيرا إلى جانب سقالة للعرض الببتيد علي سطح البكتيريا. ويصف البروتوكول اجراء مفصلا لادراج الببتيد الهدف في سقالة العرض ، وإنشاء مكتبه البيرا ، واختيار المتغيرات الفعلية البيرا والتوصيف الاولي للمتغيرات البيرا المعزولة. ويوفر الأسلوب نظام اختيار فعاله للغاية لعزل المتغيرات البيرا الرواية التي يمكن استخدامها للتطور الموجهة المزيد من البروتينات البيوتين البروتينية التي تعكر البروتين الأصلي في الحلول المعقدة.

وصمه عار الغربية من pBAD-البيره-eCPX-AP التعبير عن البكتيريا تنتج ~ 22 [كده] العقديات-رد فعل الفرقة متسقة مع الوزن الجزيئي لل eCPX (الشكل 2ا). وعلي عكس البيرا-6xHis, كان eCPX-AP الحيوية موجودة في كل من الثقافات غير المستحثة والمستحثة (الشكل 2ا) بسبب درجه صغي?...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

هنا نقدم طريقه لتحديد المتغيرات الجديدة من e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا التي بيوتينيلات الببتيد الهدف محدده. يصف البروتوكول بناء البلازميد للعرض البكتيرية من الببتيد الهدف ، وتوليد مكتبه البيرا ، واختيار وتوصيف المتغيرات البيرا.

البكتيريا الببتيد العرض لاختيار الانزيمات بيوتينيلاتينج رواية

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

يوفر هذا البروتوكول نظام عرض بكتيري فعال للغاية لعزل المتغيرات الجديدة من BirA التي تسمح بتنينيل حيوي محدد للبروتينات الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تختار متغيرات BirA باستخدام اختيار streptavidin عالي التقارب. وهذا يضمن إزالة المستنسخات غير النشطة، وبالتالي إنشاء عملية اختيار عالية الكفاءة.لتبدأ، في محرر البلازميد، تصميم التمهيدي إلى الأمام لتشمل آخر 30 النيوكليوتيدات من تكملة عكسي من تسلسل الترميز الببتيد، وإضافة تسلسل النيوكليوتيدات ملزمة plasmid إلى نهايتها خمسة رئيس الوزراء. تصميم التمهيدي العكسي لتشمل أول 30 النيوكليوتيدات من الملحق العكسي لتسلسل ترميز الببتيد، وإضافة تسلسل النيوكليوتيدات ملزمة plasmid إلى نهايتها خمسة رئيس. ثم، لإعداد تفاعل PCR 20 ميكرولتر، إضافة الكواشف في أنبوب PCR رقيقة الجدران.نقل الأنبوب إلى دورة حرارية، وإجراء PCR وفقا للمخطوطة. بعد ذلك، قم بتشغيل خمسة ميكرولترات من تفاعل PCR على هلام agarose بنسبة 1٪لتأكيد تضخيم منتج PCR بست كيلو، والمضي قدما وفقا للمخطوطة. الآن ، لتجميع megaprimers متحولة مع بيرا hexahistidine إلى الأمام وعكس التمهيديات ، في أنبوب PCR ، إضافة نانوغرام واحد من pBAD - BirA - eCPX مع تسلسل الببتيد الهدف المعدة كقالب.اقامة 35 دورة PCR مع درجة حرارة 60 درجة مئوية من الصلب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم، تشغيل خمسة ميكرولترات من رد فعل التضخيم على هلام agarose 1٪للتحقق من تضخيم منتج PCR زوج 984 قاعدة. تنقية المنتج PCR من 45 ميكرولترات المتبقية من تفاعل التضخيم باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية، واستخدام مقياس الطيفي لكمية العائد الحمض النووي.في أنبوب PCR رقيقة الجدران، إضافة الكواشف في megaprimers متحولة أعدت لإعداد رد فعل العينة. نقل خليط التفاعل إلى دورة حرارية، وتشغيل PCR وفقا للمخطوطة. تخزين رد فعل التضخيم في أربع درجات مئوية أو على الجليد.بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد Dpn1 مباشرة إلى تفاعل التضخيم، واخلط بلطف. تدور أسفل خليط التفاعل، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. بعد ساعتين، تحويل T7 Express lysY/Iq الخلايا الإشريكية القولونية المختصة في أنبوب مع اثنين من microliters من رد فعل Dpn1.أولا، تلقيح 100 ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين مع ملليلتر واحد من مكتبة بيرا، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. ثم، تلقيح خمسة ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ من الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين مع 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها. احتضان لمدة ساعتين و 30 دقيقة أو حتى الثقافة تصل إلى OD600 من حوالي 0.5.المقبل, حث ECPX و BirA التعبير مع 0.2٪ الوزن من قبل حجم L-arabinose, 100-micromolar IPTG, و 100-بيوتين micromolar. هز الثقافة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي ثقافة لمدة 10 دقائق في 5،000 مرات ز، وإزالة الفائق.إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS، والطرد المركزي في 5،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل الماثرة، وإعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني، وتخزين الخلايا على الجليد. ثم، نقل 10 ميكرولترات من الخلايا resuspended إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يسمى الإدخال.تخزين على الجليد. المقبل، وغسل 20 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin في ملليلتر واحد من الجليد البارد برنامج تلفزيوني في أنبوب، ووضع الأنبوب في فاصل الجسيمات المغناطيسي benchtop لمدة دقيقتين، وإزالة بعناية supernatant. Resuspend الخرز المغناطيسي streptavidin في 20 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني ، ونقل محلول حبة إلى 390 ميكرولترات أعدت السابقة من الخلايا resuspended.مزيج عن طريق الأنابيب بلطف. ثم، احتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. ضع عمودًا مع مجالات مغناطيسية في فاصل جسيمات مغناطيسية ، واغسل بخمسة ملليلترات من PBS باردًا.نقل الخلايا والخرز المغناطيسي streptavidin من أنبوب في العمود المرفق في الفاصل. بمجرد أن يكون خزان العمود فارغًا ، اغسل العمود بحجم إجمالي قدره خمسة ملليلترات من PBS الباردة الجليدية عند 500 ميكرولتر في كل مرة. بعد ذلك، قم بإزالة العمود من الفاصل، وضعه في أنبوب 1.5 ملليلتر.الماصات ملليلتر واحد من PBS الجليد الباردة على العمود، واستخدام المكبس ل elute الخلايا المسمى مغناطيسيا. ثم، ضع أنبوب 1.5 ملليلتر في فاصل مقاعد البدلاء، وغسل الخلية التي تحمل علامة مغناطيسية مع ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS. إعادة تعليق بلطف الخلايا التي تحمل علامة مغناطيسية في ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS.نقل 10 ميكرولترات من resuspension إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الانتاج المسمى. تلقيح 100 ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ من الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين مع الخلايا التي تحمل علامة مغناطيسية، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، والجمع بين 10 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها في LB مع الجلسرين إلى تركيز النهائي من 15٪، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لجعل مخزونات الفريزر.استخدام 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها للجولة المقبلة من الاختيار. الآن ، إضافة 990 microliters من الجليد البارد برنامج تلفزيوني لكل من عينات المدخلات والمخرجات ، وتسمية أنابيب المدخلات 10 إلى ناقص اثنين والمخرجات 10 إلى ناقص اثنين ، على التوالي. جعل 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من العينتين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة حتى يتم التوصل إلى تخفيف النهائي من 10 إلى ناقص 10 في عينة المدخلات و 10 إلى ناقص أربعة في عينة الإخراج.لوحة 100 ميكرولترات من العينات من المدخلات 10 إلى ناقص ستة، وإدخال 10 إلى ثمانية ناقص، وإدخال 10 إلى ناقص 10، والإخراج 10 إلى ناقص اثنين، وإخراج 10 إلى ثلاثة ناقص، وإخراج 10 إلى ناقص أربعة على لوحات LB-ampicillin الفردية، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في الصباح، عد عدد المستعمرات على لوحات مع مستعمرات منفصلة بوضوح. اضرب عدد المستعمرات مع عامل التخفيف للحصول على عدد تركيزات البكتيريا لكل 100 ميكرولترات.في هذا البروتوكول، بعد إنشاء مكتبة متحولة عشوائيا من المتغيرات بيرا، وكان حث بيرا وeCPX-AP التعبير. تم احتضان البكتيريا مع مع الكاشف تقارب، تم التخلص من البكتيريا غير المنضمة، وتضخيم البكتيريا المختارة. أنتجت البقعة الغربية من pBAD-BirA-eCPX-AP التي تعبر عن البكتيريا شريطًا يتفاعل مع 22 كيلوdalتون متوافق مع الوزن الجزيئي لـ eCPX في الثقافات غير المستحثة والمستحثة على حد سواء.ومع ذلك، لم تكن موجودة في الهكسيستيدين بيرا. تسبب التنينيل الحيوي السطحي القوي في البكتيريا المعبرة عن eCPX-AP في التجميع عند إضافة الخرز المغناطيسي streptavidin وتشكيل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب ، وهو ما لم يتم ملاحظته مع eCPX مع اللين إلى بكتيريا التعبير عن الطفرة ألانين. تحليل العجلة من سحب streptavidin عرض واضحة 22 كيلودالون streptavidin رد فعل ومكافحة hexahistidine الفرقة في العينات من الثقافات eCPX-AP ولكن ليس eCPX-AP مع ليسين لثقافات الطفرات ألانين.وبالمثل، كان عدد البكتيريا المرتبطة الخرز streptavidin أعلى بكثير في eCPX-AP من eCPX-AP lysine إلى ثقافات الطفرات ألانين. الخطوة الأكثر أهمية هي غسل صارم للبكتيريا المرتبطة بالعصية. يضمن الغسيل الصارم أن يتم اختيار البكتيريا فقط مع البيوتين المعروضة على السطح.مرة واحدة لوحظ الإثراء الواضح للبكتيريا، يمكن أن تكون أكثر تحور استنساخ معزولة وبالتالي تطوير المتغيرات BirA نشطة للغاية التي تسمح بتنينيل حيوي محدد من البروتينات المحلية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&#39;Bioluminescent&#39; بالعاثية مراسل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الفئة أ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...