Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

提交人感谢穆罕默德·阿卜杜拉希·艾哈迈德提供专家技术员援助。这项工作得到了伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦肾脏协会、Aase og Ejnar Danielsen基金会、A.P. Müller 医学科学促进基金会以及克努德和伊迪丝·埃里克森的资助。纪念基金会

1. 在pBAD BirA-eCPX-AP中插入肽编码序列
注：要选择生物仿宗原生靶蛋白的 BirA 变体，首先在含有至少一种裂氨酸 （K） 残留物的蛋白质初级序列中识别 15-氨基酸肽序列。
<ol><li>转到序列操作套件12。</li>
	<li>以 FASTA 格式将标识的 15 个氨基酸肽序列粘贴到输入框中，然后按"提交"。</li>
	<li>选择并复制肽序列的45个核苷酸反向翻译。</li>...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

对于所有选择方法，洗涤步骤的严格性至关重要。由于细菌在选定克隆的扩增之前不需要从珠子中洗脱，因此可以使用生物素和链球菌之间的高亲和力结合，而不是像以前使用噬菌体显示系统那样使用较低的亲亲性阿胶，选择比A变型7，8。这确保了稀有的克隆被选择，并且非生物仿菌被丢弃。与噬菌体显示相比，使用细菌显示的另一个优点是细菌显示?...

蛋白质的生物素化为它的亲和力分离和检测创造了一个强大的标签。酶蛋白生物异化是一种高度特异性的转化后修饰，由生物锡蛋白气化催化。大肠杆菌生物蛋白联苯比拉是极其特异性的，共价生物酸化仅在特定莱塞残留物1中产生数量有限的自然存在的蛋白质。BirA 催化生物异化的优点目前通过将靶蛋白与小型合成 15-氨基酸生物锡接受肽 （AP） 融合，该肽可有效生物异化2，并允许高度特异性和通过共同表达或添加BirA3，4，5，在体内和体外生物体内建立有效的生物体化。虽然体内和体外BirA催化生物蛋白结扎是一种有吸引力的标签策略，但其应用仅限于含有AP融合蛋白的样品。该方法的目的是开发新的生物蛋白利气突变体，选择性地对原生未改性蛋白质进行生物异化，从而扩大酶生物异化策略的应用范围。
蛋白质功能可以通过基因突变的迭代轮来进化，选择和扩增具有所需功能的基因变异。由于生物锡和链球菌蛋白及其同源性之间的强结合，一个强大而有效的选择策略对于定向进化至关重要，生物蛋白结合酶活性很容易选择。噬菌体显示技术允许选择显示生物仿菌肽7，8的噬菌体。然而，由于分离噬菌体的扩增需要细菌宿主的感染，因此，使用链球菌的噬菌体选择会产生瓶颈，因为生物锡与链球菌的高亲和力结合在非变性下几乎是不可逆的条件。为了确保生物氨酸噬菌体可逆结合，使用亲和力较低的单体性阿胶，从而获得适度的±10倍富集7。我们最近开发了一种细菌显示方法，用于分离新的BirA变体，消除了从亲和基质基质洗脱的需要，从而消除了以前的BirA选择系统9的瓶颈。事实上，我们的细菌显示系统允许在单个选择步骤9中增加1，000，000倍的活性克隆，从而为新型BirA变体的定向进化提供了一个有效的选择系统。
我们的细菌显示系统由两个部分组成，一个带有 C 端 6xHis 标签的 BirA 和一个支持目标肽的表面显示的支架蛋白。我们使用脚手架蛋白增强型循环渗透外膜蛋白X（eCPX），因为肽的有效显示可以在N-和C-termini10，11。目标肽序列与eCPX的C-终点的融合确保了表达活性BirA变异的细菌的生物素化。细菌允许有效的链球菌蛋白选择，因为生物仿当肽现在显示在表面上（图1a）。
这种方法的目的是选择在原生蛋白质中生物肽序列的生物仿菌的BirA的新变种。该系统由存在于质粒pBAD-BirA-eCPX-AP上的基因编码，其中包含控制BirA（阿拉巴德）的阿拉伯诱导启动子和控制eCPX9的T7启动子（图1b）。本协议描述了将来自靶蛋白的肽加入eCPX的C端的详细程序，2）通过容易出错的PCR创建BirA突变库，3）通过选择链球菌结合菌磁活细胞分类（MACS），4）细菌富集的定量，以及5）分离克隆的初始表征。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotin 是一种有吸引力的蛋白质转化后修饰，为蛋白质的分离和检测提供了强大的标签。大肠杆菌生物蛋白结合体比抗酶酶具有很强的特异性，允许在其原生环境中对靶蛋白进行生物异化;然而，目前使用BirA介导的生物小化需要在靶蛋白中存在合成接受肽（AP）。因此，其应用仅限于被设计成含有AP的蛋白质。本协议的目的是使用从未修饰的目标蛋白中提取的肽的细菌显示来选择生物仿制肽的BirA变体。该系统基于单个质粒，允许共同表达BirA变异，以及细菌表面肽显示的支架。该协议描述了将目标肽集成到显示支架中、创建 BirA 库、选择活动 BirA 变体和分离的 BirA 变体的初始特征的详细过程。该方法为分离新的BirA变体提供了一个高效的选择系统，可用于生物蛋白蛋白利气的进一步定向进化，在复杂溶液中生物适应原生蛋白。

pBAD-BirA-eCPX-AP表达细菌的西方斑点产生一个+22 kDa链球蛋白反应带，与eCPX的分子量一致（图2a）。与BirA-6xHis不同，生物素化eCPX-AP存在于非诱导和诱导培养物中（图2a），因为即使在非诱导培养物和随后的内源性BirA对AP的生物素化中，T7促进因素活动程度很小。在比较多的-eCPX-AP（K10A）表达培养物中，未检测到生物素素eCPX带（<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

在这里，我们提出一种方法，以选择大肠杆菌生物蛋白的倍酶BirA的新变种，生物异化特定靶肽。该协议描述了用于靶肽的细菌显示的质粒的构造、BirA库的生成、BirA变体的选择和表征。

细菌肽显示用于选择新型生物仿生酶

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

该协议提供了一个高效的细菌显示系统，用于分离BirA的新变种，允许本地蛋白质的特定生物素化。该技术的主要优点是，它选择BirA变种使用高亲和力链球菌素的选择。这可确保删除非活动克隆，从而创建高效的选择过程。首先，在质粒编辑器中，设计前底图，包括肽编码序列的反向补充的最后30个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列添加到其五个底端。设计反向底原，包括肽编码序列的反向补充的30个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列添加到其五个质端。然后，要建立20微升PCR反应，在薄壁PCR管中加入试剂。将管子转移到热循环器上，然后根据手稿执行 PCR。接下来，在1%的加糖凝胶上运行五微升PCR反应，以确认6千基PCR产品的放大，然后根据手稿进行。现在，要合成具有BirA六核酸和反向底向的突变巨型基普器，在PCR管中，添加一个带准备好的目标肽序列的pBAD-BirA-eCPX的纳米图作为模板。根据制造商的说明，设置 35 个 PCR 循环，退火温度为 60 摄氏度。然后，在1%的加糖凝胶上运行5微升的扩增反应，以验证984基对PCR产品的放大。使用商用 PCR 纯化试剂盒从扩增反应的其余 45 微升中净化 PCR 产品，并使用分光光度计对 DNA 产量进行定量测量。在薄壁PCR管中，在制备的突变体中加入试剂，以制备样品反应。将反应混合物转移到热循环器中，然后根据手稿运行PCR。将放大反应储存在摄氏四度或冰上。接下来，将一微升Dpn1限制酶直接加入放大反应，轻轻混合。旋转反应混合物，在37摄氏度下孵育两小时。两小时后，将T7快速lysY/Iq称大肠杆菌细胞在具有Dpn1反应两微升的管子中转化。首先，用BirA库的1毫升，接种含有1%葡萄糖和100微克每毫升安皮西林的100毫升LB，并在37摄氏度下孵育，在200转/时摇晃。然后，接种5毫升LB，含有1%葡萄糖和100微克每毫升安他西林与100微升的过夜培养。孵育2小时30分钟，或直到培养达到约0.5的OD600。接下来，通过体积L-arabinose、100微摩尔IPTG和100微摩尔生物素诱导eCPX和BirA表达，重量为0.2%。在 37 摄氏度下以 200 rpm 的速度摇动培养力一小时。在5000倍g下将培养物离心10分钟，然后取出上光。将细胞重新浓缩在一毫升冰冷的PBS中，以5000倍g离心5分钟。丢弃上清液，将细胞重新储存在400微升的冰冷PBS中，并储存在冰上。然后，将10微升的重新暂停的细胞转移到1.5毫升的管标记输入中。储存在冰上。接下来，将20微升的链球菌磁珠在一毫升的冰冷PBS中清洗，将管子放在台式磁性颗粒分离器中两分钟，小心地取出上清液。将链球菌磁珠重新悬浮在20微升的冰冷PBS中，将珠液转移到先前准备的390微升的再悬浮细胞中。通过轻轻移液混合。然后，在4摄氏度下孵育30分钟。将带铁磁球的柱放在磁性粒子分离器中，用五毫升冰冷的PBS清洗。将细胞和链球菌磁珠从管子转移到分离器中附加的柱中。一旦柱储液罐是空的，每次用500微升的冰冷PBS的总体积清洗柱。之后，从分离器上取下柱子，并将其放在 1.5 毫升管中。将一毫升的冰冷PBS移到柱子上，然后使用柱塞对磁性标记的细胞进行免疫。然后，将1.5毫升的管子放入台式分离器中，用一毫升的冰冷PBS清洗磁性标记的电池。轻轻将磁性标记的细胞重新悬浮在一毫升的冰冷的 PBS 中。将 10 微升的再分配转移到 1.5 毫升的管标记输出中。用磁性标记的细胞接种含有1%葡萄糖和每毫升100微克的LB，并在37摄氏度下孵育，在200 rpm时摇晃。第二天，将 LB 中 10 毫升的隔夜培养与甘油混合到 15% 的最终浓度，并储存在零下 80 摄氏度，使冰柜库存。使用 100 微升的过夜文化进行下一轮选择。现在，在输入和输出样品中加入990微升的冰冷PBS，并分别将管输入10标记为负2，输出10到负2。在冰冷的 PBS 中对两个样品进行 10 倍的连续稀释，直到输入样品达到 10 到减 10，在输出样品中达到 10 到负 4。板100微升样品从输入10到负6，输入10到负8，输入10到负10，输出10到负2，输出10到负3，输出10到负4在个别LB-ampicillin板，并在37摄氏度过夜孵育。早晨，数一数在盘子里有明显分离的殖民地的数量。将菌落计数与稀释因子相乘，获得每 100 微升的细菌浓度计数。在此协议中，在生成了BirA变体、BirA和eCPX-AP表达式的随机变异库之后。细菌用亲和试剂孵育，废弃无约束细菌，将选定的细菌放大。pBAD-BirA-eCPX-AP表达细菌的西方印迹产生了一个22千吨石丁反应带，与eCPX在未诱导和诱导培养物中的分子量一致。然而，他们并不在比拉六边/地。eCPX-AP表达细菌中强烈的表面生物素化在加入链球菌磁珠后引起聚集，并在管底形成颗粒，未用eCPX观察与莱辛至丙氨酸突变表达细菌。分析从链球菌素下拉的沉淀显示一个明确的22千多千吨斯特雷普他汀反应和反六氯他命带在样品从eCPX-AP培养，但不是eCPX-AP与莱辛到丙氨酸突变培养。同样，在eCPX-AP中，与链霉素珠结合的细菌数量明显高于丙氨酸突变培养物的eCPX-AP。最重要的一步是严格清洗与链球菌束缚的细菌。严格的洗涤保证只选择含有表面显示生物素的细菌。一旦观察到细菌的明显富集，分离的克隆可以进一步变异，从而发展出高活性的BirA变异，允许本地蛋白质的特定生物素化。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

“发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

科研

免疫与感染

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

选择恶性疟原虫</emCytoadhesion>寄生虫对人脑血管内皮细胞

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

在细菌粘附的研究剪应力

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

唾液，唾液腺，淋巴收集肩突硬蜱蜱

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

耐高温溶菌酶的定向进化的一个新的筛选方法

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

为检验新型抗病毒药物的鉴定对蓝舌病病毒

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

可扩展的高通量选择从噬菌体展示合成抗体库

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

生成和多表型高内涵筛选<em&gt;贝氏柯克斯体</em&gt;转座子突变体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

开发和鉴定人的中性粒细胞源性巨噬细胞新型亚群<em&gt;体外</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

一种新型大鼠自然杀伤细胞无饲养系统的研究体外

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...