Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Forfatterne takker Mohamed Abdullahi Ahmed for ekspert teknikeren assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Lundbeck fonden, Novo Nordisk Fonden, den danske nyre forening, Aase og Ejnar Danielsen Foundation, A.P. Møller fonden til fremme af lægevidenskaben, og Knud og Edith Eriksen Memorial Foundation.

1. indsættelse af Peptidkodning sekvensering sekvens i pBAD BirA-eCPX-AP
Bemærk: For at vælge for BirA varianter, biotinylate en Native Target protein, starte med at identificere en 15-aminosyre peptid sekvens i proteinerne primære sekvens, der indeholder mindst én lysin (K) rest.
<ol><li>Gå til sekvens manipulation Suite12.</li>
	<li>Indsæt den identificerede 15 aminosyre peptidsekvens i indtastningsfeltet i FASTA format, og tryk på s...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Som for alle udvælgelsesmetoder er stringens af vaske trinene af allerstørste vigtighed. Da bakterier ikke behøver at blive elueret fra perlerne før amplificeringen af de valgte kloner, kan den høje affinitets binding mellem biotin og streptavidin anvendes i stedet for at bruge lavere affinitet avidiner, som tidligere gjort med fagtypning display system, for udvælgelsen af BirA varianter7,8. Dette sikrer, at sjældne kloner udvælges, og at ikke-biotinylere...

Biotinylering af et protein skaber en kraftfuld tag for sin affinitet isolation og detektion. Enzymatisk protein biotinylering er en meget specifik post-translationel modifikation katalyseret af biotin-protein-ligaser. E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er yderst specifik og kovalent biotinylater kun et begrænset antal naturligt forekommende proteiner ved specifikke lysinrester1. Fordelene ved BirA katalyseret biotinylering udnyttes i øjeblikket ved at fusing målproteinet med en lille syntetisk 15-aminosyre biotin acceptor peptid (AP), der effektivt er biotinyleret2 og giver mulighed for den meget specifikke og effektiv in vivo-og in vitro-biotinylering ved co-ekspression eller tilsætning af BirA3,4,5. Selvom in vivo og in vitro-katalyseret biotin-protein ligering er en attraktiv mærknings strategi, er dens anvendelse begrænset til prøver, der indeholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metode er at udvikle nye mutanter af biotin-protein-ligaser, der selektivt biotinylerer indfødte umodificerede proteiner og derved udvider antallet af anvendelser, hvor den enzymatiske biotinyleringstrategi kan anvendes.
Protein funktionen kan udvikles gennem iterativ runder af genmutationen, udvælgelsen og amplificeringen af genvarianter med den ønskede funktion. En stærk og effektiv udvælgelses strategi er afgørende for den instruerede evolution og biotin-protein ubiquitinligase aktivitet er let udvalgt på grund af den stærke binding mellem biotin og streptavidin og dens homologer6. Phage display Technologies giver mulighed for udvælgelse af fager, der viser biotinylerede peptider7,8. Da forstærkning af isolerede fager kræver infektion af en bakteriel vært, men fagtypning udvælgelse med streptavidin skaber en flaskehals i, at den høje affinitet binding af biotin til streptavidin er næsten irreversibel under ikke-denaturering Betingelser. For at sikre reversibel binding af biotinylerede fager blev der anvendt monomeriske avidiner med lavere affinitet, hvilket resulterede i en beskeden ~ 10-fold berigelse7. Vi har for nylig udviklet en bakteriel visningsmetode til isolering af nye BirA varianter, der eliminerer behovet for eluering fra Affinity matrix og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA udvælgelsessystemer9. Faktisk giver vores bakterielle display system mulighed for en > 1, 000, 000-fold berigelse af aktive kloner i et enkelt valg trin9, hvilket giver et effektivt udvælgelsessystem for den rettede udvikling af nye BirA varianter.
Vores bakterielle display system består af to komponenter, BirA med en C-Terminal 6xHis tag og et stillads protein, der giver mulighed for overfladen visning af et mål peptid. Vi brugte stilladset protein forbedret cirkulært permuteret ydre membran protein X (eCPX), da den effektive visning af peptider kan observeres på både N-og C-Termini10,11. Den fusion af Target peptid sekvens til C-endestation af eCPX sikrer biotinylering af bakterier, som udtrykker aktive BirA varianter. Bakterierne giver mulighed for et effektivt streptavidin-valg, da det biotinylerede peptid nu vises på overfladen (figur 1a).
Formålet med denne metode er at udvælge nye varianter af BirA, som biotinylater peptidsekvenser til stede i indfødte proteiner. Systemet er kodet af gener, der findes på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som indeholder en Arabinose-inducerbar promotor, som kontrollerer BirA (araBAD), og en T7-promotor, som styrer eCPX9 (figur 1b). Denne protokol beskriver den detaljerede procedure for 1) inkorporering af et peptid afledt af et målprotein i C-terminalen af ecpx, 2) oprettelse af et Mutations Library of BirA med fejlbehæftet PCR, 3) udvælgelse af streptavidin-binding bakterier ved magnetisk-aktiveret celle sortering (MACS), 4) kvantificering af bakterie berigelse, og 5) indledende karakterisering af isolerede kloner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotin er en attraktiv post-translationel modifikation af proteiner, der giver en kraftfuld tag til isolering og påvisning af protein. Enzymatisk biotinylering af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er meget specifik og giver mulighed for biotinylering af målproteiner i deres oprindelige miljø; Men, den nuværende brug af BirA medieret biotinylering kræver tilstedeværelsen af en syntetisk acceptor peptid (AP) i målet protein. Derfor er dens anvendelse begrænset til proteiner, der er blevet konstrueret til at indeholde AP. Formålet med denne protokol er at anvende bakterie visningen af et peptid afledt af et ikke-modificeret målprotein til at udvælge de varianter af BirA, som biotinylerer peptid. Systemet er baseret på en enkelt plasmid, der giver mulighed for Co-ekspression af BirA varianter sammen med et stillads for peptid displayet på den bakterielle overflade. Protokollen beskriver en detaljeret procedure for inkorporering af målet peptid i displayet stillads, oprettelse af BirA bibliotek, udvælgelse af aktive BirA varianter og indledende karakterisering af de isolerede BirA varianter. Metoden giver et meget effektivt udvælgelsessystem til isolering af nye BirA varianter, der kan bruges til yderligere rettet udvikling af biotin-protein ligaser, der biotinylate et indfødt protein i komplekse opløsninger.

Western blot af pBAD-BirA-eCPX-AP udtrykker bakterier producerer en ~ 22 kDa streptavidin-reagerende bånd i overensstemmelse med molekylvægten af eCPX (figur 2a). I modsætning til BirA-6xHis var biotinyleret eCPX-AP til stede i både uinduceret og induceret kulturer (figur 2a) på grund af en lille grad af T7 promotor aktivitet selv i ikke-inducerede kulturer og efterfølgende BIOTINYLERING af AP af endogene BirA. I BirA-eCPX...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Her præsenterer vi en metode til at vælge for nye varianter af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA at biotinylates et specifikt mål peptid. Protokollen beskriver opførelsen af en plasmid for bakteriel visning af målet peptid, generation af en BirA bibliotek, udvælgelse og karakterisering af BirA varianter.

Bakteriel peptid-display til udvælgelse af nye Biotinylerende enzymer

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Denne protokol giver et yderst effektivt bakterielt display system til isolering af nye varianter af BirA, der giver mulighed for specifik biotinylation af indfødte proteiner. Den største fordel ved teknikken er, at den udvælger BirA varianter ved hjælp af høj-affinitet streptavidin udvælgelse. Dette sikrer, at inaktive kloner fjernes, hvilket skaber en yderst effektiv udvælgelsesproces.Til at begynde, i en plasmid editor, designe fremad primer til at omfatte de sidste 30 nukleotider af det modsatte supplement af peptid kodning sekvens, og tilføje plasmid bindende nukleotid sekvens til sin fem-prime ende. Design den omvendte primer til at omfatte de første 30 nukleotider i det omvendte supplement af peptidkodningssekvensen, og tilsæt plasmidbindingnukleotidsekvensen til sin fem-prime ende. Derefter, at oprette en 20-microliter PCR reaktion, tilsæt reagenser i en tyndvægget PCR rør.Overfør røret til en termisk cycler, og udfør PCR i henhold til manuskriptet. Dernæst køre fem mikroliter af PCR reaktion på en 1% agarose gel for at bekræfte forstærkning af en seks-kilobase PCR produkt, og fortsætte i henhold til manuskriptet. Nu, at syntetisere mutant megaprimers med BirA hexahistidine frem og tilbage primere, i en PCR rør, tilføje et nanogram pBAD-BirA-eCPX med den forberedte mål peptid sekvens som en skabelon.Opsæt 35 PCR-cyklusser med en glødende temperatur på 60 grader Celsius i henhold til producentens instruktion. Kør derefter fem mikroliter af forstærkningsreaktionen på en 1% agarosegel for at kontrollere forstærkningen af et 984-base par PCR-produkt. Rens PCR-produktet fra de resterende 45 mikroliter af forstærkningsreaktionen ved hjælp af et kommercielt PCR-rensesæt, og brug et spektrofotometer til at kvantificere DNA-udbyttet.I et pcr-rør med tyndvæggede vægge tilsættes reagenserne i de forberedte mutant megaprimere for at forberede prøvereaktionen. Overfør reaktionsblandingen til en termisk cykelr, og kør PCR i henhold til manuskriptet. Opbevar forstærkningsreaktionen ved fire grader Celsius eller på is.Dernæst tilsættes en mikroliter af Dpn1 restriktionsenzym direkte til forstærkningsreaktionen, og bland forsigtigt. Spin ned reaktionen blandingen, og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius. Efter to timer omdannes T7 Express lysY/Iq kompetente E.coli-celler i et rør med to mikroliter af Dpn1-reaktionen.Først vaccineres 100 milliliter LB indeholdende 1%glukose og 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin med en milliliter BirA-bibliotek, og inkuberes natten over ved 37 grader Celsius med omrystning ved 200 omdr./min. Derefter vaccineres fem milliliter LB indeholdende 1%glucose og 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin med 100 mikroliter af nattens kultur. Inkuberes i to timer og 30 minutter, eller indtil kulturen når en OD600 på ca. 0,5.Dernæst fremkalde eCPX og BirA udtryk med 0,2%vægt i volumen L-arabinose, 100-mikromolar IPTG, og 100-mikromolar biotin. Ryst kulturen ved 200 rpm i en time ved 37 grader Celsius. Centrifuge kulturen i 10 minutter ved 5, 000 gange g, og fjern supernatanten.Cellerne opsaltres i en milliliter iskold PBS og centrifugerer ved 5.000 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten, og opsvar cellerne i 400 mikroliter iskold PBS, og opbevar cellerne på is. Derefter overføres 10 mikroliter af de resuspenderede celler til et 1,5 milliliterrør mærket input.Opbevares på is. Dernæst vaskes 20 mikroliter streptavidin magnetiske perler i en milliliter iskold PBS i et rør, og læg røret i en bænktop magnetisk partikelseparator i to minutter, og fjern forsigtigt supernatanten. Opsalt de streptavidin magnetiske perler i 20 mikroliter iskold PBS, og overfør perleopløsningen til de tidligere forberedte 390 mikroliter af resuspenderede celler.Bland ved forsigtigt pipettering. Derefter inkuberes i 30 minutter ved fire grader Celsius. Der skal indbelystes en kolonne med ferromagnetiske kugler i en magnetisk partikelseparator, og vaskes med fem milliliter iskold PBS.Overfør cellerne og streptavidin magnetiske perler fra røret i kolonnen fastgjort i separatoren. Når kolonnebeholderen er tom, vaskes kolonnen med et samlet volumen på fem milliliter iskold PBS ved 500 mikroliter hver gang. Derefter fjernes kolonnen fra separatoren, og den anbringes i et rør på 1,5 milliliter.Pipetter en milliliter af den iskolde PBS på kolonnen, og brug stemplet til at fremkalde de magnetisk mærkede celler. Derefter anbringes 1,5-milliliterrøret i en benchtop separator, og den magnetisk mærkede celle vaskes med en milliliter iskold PBS. Resalpend forsigtigt de magnetisk mærkede celler i en milliliter af den iskolde PBS.Resuspension overføres 10 mikroliter til et 1,5 milliliterrør mærket udgang. Inokuler 100 milliliter LB indeholdende 1%glucose og 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin med de magnetisk mærkede celler, og inkuberes natten over ved 37 grader Celsius med omrystning ved 200 omdrejning. Den næste dag, kombinere 10 milliliter af natten kultur i LB med glycerol til en endelig koncentration på 15% og opbevares på minus 80 grader Celsius at gøre fryser lagre.Brug 100 mikroliter af natten kultur for den næste runde af udvælgelse. Nu tilsættes 990 mikroliter iskold PBS til både input- og outputprøverne, og rørindgang 10 til minus to og output 10 til minus to. Der foretages 10 gange serielle fortyndinger af de to prøver i iskold PBS, indtil en endelig fortynding på 10 til minus 10 er nået i inputprøven og 10 til minus fire i outputprøven.Plade 100 mikroliter af prøver fra input 10 til minus seks, input 10 til minus otte, input 10 til minus 10, output 10 til minus to, output 10 til minus tre, og output 10 til minus fire på individuelle LB-ampicillin plader, og inkubere natten over ved 37 grader Celsius. Om morgenen tælle antallet af kolonier på pladerne med klart adskilte kolonier. Multiplicer kolonitallet med fortyndingsfaktoren for at opnå bakteriekoncentrationstallet pr. 100 mikroliter.I denne protokol, efter generering af et tilfældigt muteret bibliotek af BirA varianter, BirA og eCPX-AP udtryk blev induceret. Bakterier blev inkuberet med affinitet reagens, ubundne bakterier blev kasseret, og udvalgte bakterier blev forstærket. Western blot af pBAD-BirA-eCPX-AP udtrykke bakterier produceret en 22-kilodalton streptavidin-reagerende bånd i overensstemmelse med den molekylære vægt af eCPX i både uinducerede og inducerede kulturer.De var dog ikke til stede i BirA hexahistidine. Den stærke overfladebiotinylation i eCPX-AP, der udtrykte bakterier, forårsagede sammenlægning ved tilsætning af streptavidin magnetiske perler og dannelsen af en pellet i bunden af røret, som ikke blev observeret med eCPX med lysin til alanin mutationsekspressionsbakterier. Analyse af bundfaldet fra streptavidin pulldown viste en klar 22-kilodalton streptavidin-reagerende og anti-hexahistidine band i prøverne fra eCPX-AP kulturer, men ikke eCPX-AP med lysin til alanin mutation kulturer.Tilsvarende, antallet af bakterier bundet til streptavidin perler var betydeligt højere i eCPX-AP end eCPX-AP lysin til alanin mutation kulturer. Det vigtigste skridt er en streng vask af streptavidin-bundet bakterier. En streng vask sikrer, at kun bakterier med overflade-vises biotin er valgt.Når en klar berigelse af bakterier er observeret, kan de isolerede kloner muteres yderligere og derved udvikle meget aktive BirA varianter, der giver mulighed for specifik biotinylation af indfødte proteiner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg af Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

En ny screeningsmetode til den Rettede Udviklingen i Termostabile bakteriolytisk Enzymes

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalerbar High Throughput Selection Fra fagpræsenterede Syntetiske antistofbiblioteker

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Udvikling og Identifikation af en roman underpopulation af human neutrofil-afledte Giant fagocytter<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...