Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

De auteurs bedanken Mohamed Abdullahi Ahmed voor de deskundige technicus assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Stichting Lundbeck, de Novo Nordisk Foundation, de Deense Niervereniging, de Aase og Ejnar Danielsen Foundation, de A.P. Møller Foundation voor de vooruitgang van de medische wetenschap, en Knud en Edith Eriksen Memorial Foundation.

1. inbrengen van peptide Coding volgorde sequentie in pBAD BirA-eCPX-AP
Opmerking: Om te selecteren voor BirA varianten die biotinyate een native doelwit eiwit, beginnen met het identificeren van een 15-aminozuur peptide sequentie in de eiwitten primaire sequentie die ten minste één lysine (K) residu bevat.
<ol><li>Ga naar de sequentie manipulatie Suite12.</li>
	<li>Plak de geïdentificeerde 15 aminozuur peptide sequentie in het invoervak in FASTA f...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Zoals voor alle selectiemethodes, is de striktheid van de wasstappen van het allergrootste belang. Omdat bacteriën niet hoeven te worden afgeleid van de kralen vóór de versterking van de geselecteerde klonen, de hoge affiniteit binding tussen Biotine en streptavidine kan worden gebruikt in plaats van het gebruik van lagere affiniteit avidins, zoals eerder gedaan met de faag display systeem, voor de selectie van BirA-varianten7,8. Dit zorgt ervoor dat zeldzame ...

Biotinylatie van een eiwit creëert een krachtige tag voor zijn affiniteit isolatie en detectie. Enzymatische proteïne biotinylatie is een zeer specifieke post-translationele modificatie gekatalyseerd door Biotine-eiwit ligasen. De E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en covalent biotinyaten slechts een beperkt aantal natuurlijk voorkomende eiwitten bij specifieke lysine residuen1. De voordelen van de door BirA gekatalyseerde biotinylatie worden momenteel benut door het doeleiwit te fusing met een kleine synthetische 15-aminozuur Biotine acceptor peptide (AP) die effectief biotinyleerd2 is en die de zeer specifieke en efficiënt in vivo en in vitro biotinylatie door co-expressie of toevoeging van BirA3,4,5. Hoewel de in vivo en in vitro BirA gekatalyseerde Biotine-eiwit ligatie een aantrekkelijke etiketterings strategie is, is de toepassing ervan beperkt tot monsters die AP-gesmolten eiwitten bevatten. Het doel van deze methode is de ontwikkeling van nieuwe mutanten van biotine-eiwit ligasen die selectief inheemse ongewijzigde eiwitten biotinyeren en daardoor het aantal toepassingen uitbreiden waarin de enzymatische biotinylatie strategie kan worden gebruikt.
Eiwit functie kan worden geëvolueerd door iteratieve rondes van de genmutatie, selectie en amplificatie van genvarianten met de gewenste functie. Een sterke en efficiënte selectie strategie is cruciaal voor de gerichte evolutie en biotine-eiwit ligase activiteit wordt gemakkelijk geselecteerd als gevolg van de sterke binding tussen Biotine en streptavidine en de homo logs6. Phage display technologieën maken het mogelijk om de Fagen te selecteren die biotinyleerd peptiden7,8vertonen. Omdat de versterking van geïsoleerde Fagen infectie van een bacteriële gastheer vereist, echter, de faag selectie met streptavidine creëert een knelpunt in dat de hoge-affiniteit binding van biotine streptavidine is vrijwel onomkeerbaar onder niet-denaturering Voorwaarden. Om een omkeerbare binding van biotinyleerd Fagen te garanderen, werden monomere avidins met een lagere affiniteit gebruikt, wat resulteerde in een bescheiden ~ 10-voudige verrijking7. We hebben onlangs een bacteriële weergavemethode ontwikkeld voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die de noodzaak van de elutie uit de affiniteits matrix elimineert en daardoor een knelpunt van de vorige BirA Selection Systems9verwijdert. Ons bacteriële display systeem zorgt immers voor een > 1, 000, 000-voudige verrijking van actieve klonen in één enkele selectie stap9, waardoor een effectief selectiesysteem wordt geboden voor de gerichte evolutie van nieuwe BirA-varianten.
Ons bacteriële display systeem bestaat uit twee componenten, BirA met een C-Terminal 6Xzijn tag en een steiger eiwit dat de oppervlakte weergave van een doel peptide mogelijk maakt. We gebruikten de steiger eiwit verbeterd circulair pergedempt buitenste membraan proteïne X (ecpx) omdat de effectieve weergave van peptiden kan worden waargenomen op zowel de N-en C-Termini10,11. De fusie van de doelpeptide sequentie tot het C-eindpunt van eCPX verzekert biotinylatie van bacteriën die actieve BirA-varianten uitdrukken. De bacteriën zorgen voor de effectieve streptavidine selectie als de biotinyleerd peptide nu op het oppervlak verschijnt (Figuur 1a).
Het doel van deze methode is om te selecteren voor nieuwe varianten van BirA dat biotinylates peptide sequenties aanwezig zijn in inheemse eiwitten. Het systeem is gecodeerd door genen die aanwezig zijn op het plasmide pBAD-BirA-eCPX-AP, dat een arabinose-oninduceerbaar promotor bevat die het BirA bestuurt (araBAD) en een T7 Promoter die eCPX9 bestuurt (Figuur 1b). Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor 1) opname van een peptide afgeleid van een doel proteïne in de C-terminal van ecpx, 2) creatie van een mutatie Library van BirA door foutgevoelige PCR, 3) selectie van streptavidine-bindende bacteriën door magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), 4) kwantificering van bacterie verrijking en 5) initiële karakterisering van geïsoleerde klonen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotine is een aantrekkelijke post-translationele modificatie van eiwitten die een krachtige tag biedt voor de isolatie en detectie van eiwitten. Enzymatische biotinylatie door de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en zorgt voor de biotinylatie van doel eiwitten in hun eigen omgeving; het huidige gebruik van door BirA gemedieerde biotinylatie vereist echter de aanwezigheid van een synthetische acceptor peptide (AP) in het doeleiwit. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot eiwitten die zijn ontworpen om de AP bevatten. Het doel van dit protocol is het gebruik van de bacteriële weergave van een peptide afgeleid van een niet-gemodificeerd doeleiwit om te selecteren voor BirA-varianten die biotinyates de peptide. Het systeem is gebaseerd op één plasmide die de co-expressie van BirA-varianten mogelijk maakt, samen met een steiger voor het peptide display op het bacteriële oppervlak. Het protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de opname van de doel peptide in de weergave-steiger, creatie van de BirA-bibliotheek, selectie van actieve BirA-varianten en initiële karakterisering van de geïsoleerde BirA-varianten. De methode biedt een zeer effectief selectiesysteem voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die kunnen worden gebruikt voor de verder geleide evolutie van biotine-eiwit ligasen die een inheems eiwit in complexe oplossingen biotinyeren.

Western Blot van pBAD-BirA-eCPX-AP dat bacteriën uitdrukt produceert een ~ 22 kDa streptavidine-reactie band die consistent is met het molecuulgewicht van eCPX (Figuur 2a). In tegenstelling tot BirA was de biotinyleerd ecpx-AP aanwezig in zowel ongeïnduceerde als geïnduceerde culturen (Figuur 2a) als gevolg van een kleine mate van T7-promotor activiteit, zelfs in niet-geïnduceerde culturen en daaropvolgende biotinylatie van ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Hier presenteren we een methode om te selecteren voor nieuwe varianten van de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA dat biotinyates een specifieke doel peptide. Het protocol beschrijft de bouw van een plasmide voor de bacteriële weergave van de doel peptide, het genereren van een BirA bibliotheek, selectie en karakterisering van BirA varianten.

Bacteriële peptide weergave voor de selectie van nieuwe Biotinylating enzymen

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Dit protocol biedt een zeer effectief bacterief vertoningssysteem voor isolatie van nieuwe varianten van BirA die specifieke biotinylation van inheemse proteïnen toestaat. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat het BirA varianten selecteert met behulp van hoge affiniteit streptavidin selectie. Dit zorgt ervoor dat inactieve klonen worden verwijderd, waardoor een zeer efficiënt selectieproces ontstaat.Om te beginnen, in een plasmid editor, het ontwerp van de voorwaartse primer om de laatste 30 nucleotiden van de omgekeerde aanvulling van de peptide codering sequentie op te nemen, en voeg de plasmid bindende nucleotide sequentie aan zijn vijf-prime einde. Ontwerp de omgekeerde primer om de eerste 30 nucleotiden van de omgekeerde aanvulling van de peptide coderende sequentie op te nemen en voeg de plasmid binding nucleotide sequentie toe aan het vijfste priemeinde. Voeg vervolgens de reagentia toe in een dunwandige PCR-buis om een PCR-reactie van 20 microliter op te zetten.Breng de buis over naar een thermische cycler en voer PCR uit volgens het manuscript. Voer vervolgens vijf microliters van de PCR-reactie uit op een 1%-agarosegel om de versterking van een PCR-product van zes kilobasis te bevestigen en ga verder volgens het manuscript. Nu, om de gemuteerde megaprimers te synthetiseren met BirA hexahistidine voorwaartse en omgekeerde primers, in een PCR-buis, voeg een nanogram pBAD-BirA-eCPX toe met de voorbereide doelpeptopvolgorde als sjabloon.Stel 35 PCR-cycli in met een gloeiende temperatuur van 60 graden Celsius volgens de instructies van de fabrikant. Voer vervolgens vijf microliters van de versterkingsreactie uit op een 1%agarose gel om de versterking van een 984-base pair PCR-product te verifiëren. Zuiver het PCR-product van de resterende 45 microliters van de versterkingsreactie met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit en gebruik een spectrofotometer om de DNA-opbrengst te kwantificeren.Voeg in een dunwandige PCR-buis de reagentia in de bereide gemuteerde megaprimers toe om de monsterreactie voor te bereiden. Breng het reactiemengsel over naar een thermische cycler en voer de PCR volgens het manuscript uit. Bewaar de versterkingsreactie op vier graden Celsius of op ijs.Voeg vervolgens een microliter Dpn1-restrictieenzym direct toe aan de versterkingsreactie en meng zachtjes. Draai het reactiemengsel naar beneden en broed twee uur uit bij 37 graden Celsius. Na twee uur transformeer t7 Express lysY/Iq competente E.coli cellen in een buis met twee microliters van de Dpn1-reactie.Ten eerste, inenting 100 milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met een milliliter bira bibliotheek, en incubaat 's nachts op 37 graden Celsius met schudden bij 200 rpm. Dan, inenting vijf milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met 100 microliter van de nachtelijke cultuur. Incubeer gedurende twee uur en 30 minuten of totdat de cultuur een OD600 van ongeveer 0,5 bereikt.Vervolgens induceren eCPX en BirA expressie met 0,2% gewicht in volume L-arabinose, 100-micromolar IPTG, en 100-micromolar biotine. Schud de cultuur bij 200 rpm voor een uur bij 37 graden Celsius. Centrifuge de cultuur gedurende 10 minuten op 5.000 keer g, en verwijder de supernatant.Resuspend de cellen in een milliliter ijskoude PBS, en centrifuge op 5,000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de cellen in 400 microliter ijskoude PBS en bewaar cellen op ijs. Breng vervolgens 10 microliter van de opnieuw opgebouwde cellen over in een invoer met het label van 1,5 milliliter.Bewaar op ijs. Vervolgens was 20 microliters van streptavidin magnetische kralen in een milliliter ijskoude PBS in een buis, en plaats de buis in een benchtop magnetische deeltjesscheidinger gedurende twee minuten, en verwijder voorzichtig de supernatant. Resuspend de streptavidin magnetische kralen in 20 microliter van ijskoude PBS, en breng de kraal oplossing aan de vorige bereide 390 microliterten van geresuspendeerde cellen.Meng door zachtjes pipetten. Dan, incubeer gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Plaats een kolom met ferromagnetische bollen in een magnetische deeltjesafscheider en was met vijf milliliter ijskoude PBS.Breng de cellen en streptavidin magnetische kralen van de buis in de kolom bevestigd in de separator. Zodra het kolomreservoir leeg is, wast u de kolom met een totaal volume van vijf milliliter ijskoude PBS bij 500 microliter per keer. Verwijder daarna de kolom uit de scheidingsafscheid en plaats deze in een buis van 1,5 milliliter.Pipette een milliliter van de ijskoude PBS op de kolom, en gebruik de zuiger om de magnetisch gelabelde cellen te ontwijken. Plaats vervolgens de buis van 1,5 milliliter in een benchtop-scheidingsteken en was de magnetisch gelabelde cel met een milliliter ijskoude PBS. Voorzichtig resuspend de magnetisch gelabelde cellen in een milliliter van de ijskoude PBS.Breng 10 microliter van de resuspensie over in een 1,5 milliliter buis met het label output. Inoculeren 100 milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met de magnetisch gelabelde cellen, en incubaat 's nachts bij 37 graden Celsius met schudden bij 200 rpm. De volgende dag, combineren 10 milliliter van de nachtcultuur in LB met glycerol tot een laatste concentratie van 15%en op te slaan bij min 80 graden Celsius om vriezer voorraden te maken.Gebruik 100 microliters van de nachtcultuur voor de volgende selectieronde. Voeg nu 990 microliter ijskoude PBS toe aan zowel de input- als outputmonsters en label de buizen 10 aan de min twee en output 10 aan de min twee, respectievelijk. Maak 10-voudige seriële verdunningen van de twee monsters in ijskoude PBS tot een uiteindelijke verdunning van 10 tot min 10 is bereikt in het inputmonster en 10 tot de min vier in het uitgangsmonster.Plaat 100 microliters van monsters van input 10 tot min zes, input 10 tot de min acht, input 10 tot de min 10, output 10 tot de min twee, output 10 tot de min drie, en output 10 tot de min vier op individuele LB-ampicilline platen, en incubate 's nachts bij 37 graden Celsius. In de ochtend, tel het aantal kolonies op de platen met duidelijk gescheiden kolonies. Vermenigvuldig het aantal kolonies met de verdunningsfactor om het aantal bacteriënconcentraties per 100 microliters te verkrijgen.In dit protocol werd na het genereren van een willekeurig gemuteerde bibliotheek van BirA-varianten BirA- en eCPX-AP-expressie geïnduceerd. Bacteriën werden geïncubeerd met affiniteit reagens, niet-gebonden bacteriën werden weggegooid, en geselecteerde bacteriën werden versterkt. Westerse vlek van pBAD-BirA-eCPX-AP uitdrukken bacteriën geproduceerd een 22-kilodalton streptavidin-reagerende band in overeenstemming met het molecuulgewicht van eCPX in zowel niet-geïnduceerde als geïnduceerde culturen.Ze waren echter niet aanwezig in BirA hexahistidine. De sterke oppervlaktebiotinylation in de eCPX-AP uitdrukkende bacteriën veroorzaakten aggregatie bij toevoeging van streptavidin magnetische kralen en de vorming van een korrel aan de onderkant van de buis, die niet werd waargenomen met eCPX met lysine tot alanine mutatie expressie bacteriën. Analyse van het neerslag van de streptavidin pulldown toonde een duidelijke 22-kilodalton streptavidin-reagerende en anti-hexahistidine band in de monsters van eCPX-AP culturen, maar niet eCPX-AP met lysine tot alanine mutatie culturen.Ook was het aantal bacteriën dat gebonden is aan de streptavidinkralen aanzienlijk hoger in de eCPX-AP dan de eCPX-AP lysine aan alanine-mutatieculturen. De belangrijkste stap is een strenge wassen van streptavidin-gebonden bacteriën. Een strenge wasbeurt zorgt ervoor dat alleen bacteriën met biotine met oppervlakte worden geselecteerd.Zodra een duidelijke verrijking van bacteriën wordt waargenomen, kunnen de geïsoleerde klonen verder worden gemuteerd en daardoor zeer actieve BirA-varianten ontwikkelen die specifieke biotinyleratie van inheemse eiwitten mogelijk maken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...